多表位測定的製作方法

2023-09-23 16:58:35 2

專利名稱：多表位測定的製作方法
技術領域：
本發明涉及親和力測定的領域。具體地，本發明涉及一種在親和力測定中檢測生物學靶標的方法以及生物學靶標的檢測配置。
背景技術：
親和力測定是測量溶液中的物質，分析物的存在或濃度的生物化學測試，所述溶液通常包含物質的複雜混合物，例如生物學液體，如血液、唾液、血清或尿。這樣的測定基於給定分子或所述分子的特定部分如抗體以高特異性結合至一種或非常有限組的其他分子的能力。測定的特異性取決於分析物能夠結合至其特異性結合夥伴以排除待分析的樣品中的所有其他物質的程度。
除了需要特異性，必須選擇對分析物具有足夠高親和力的結合夥伴以產生準確和可重複的測量，即可測量信號。在歷史上，這通過測量一些物理特徵如光散射的變化或折射率的變化來完成。通過現代儀器，這類方法再次越來越受歡迎。然而，現在的大多數免疫測定依賴於使用分析試劑以結合至分析物，所述分析試劑與可檢測的標記相關。已證實各種標記，包括用於放射免疫測定的放射性元素；酶；螢光、磷光和化學發光染料；乳膠和磁性顆粒；染料微晶、金、銀和硒膠體顆粒；金屬螯合物；輔酶；電活性基團；寡核苷酸、穩定的自由基、聚合物等。這類標記用於分離游離和結合的標記試劑之後檢測和定量結合事件，或者通過以結合事件影響標記產生的信號的變化這樣的方式設計系統來檢測和定量結合事件。
親和力測定通常探測肽、蛋白、寡核苷酸、寡糖或小分子如適配體與固定的結合夥伴的相互作用。典型的結合夥伴包括蛋白，其可以為受體、酶或抗體，但是還包括多肽和多胺基酸(例如，鎳結合位點的多His標籤、醯胺或Schiff鹼連接的多賴氨酸、硫醚連接的多半胱氨酸)。例如，基於固定方案的鏈黴親和素廣泛用於將生物素化的生物學元素連接至測定表面。
例如，親和力測定可以進一步分類為競爭性和非競爭性測定。在競爭性親和力測定中，生物學樣品中的分析物與標記的分析物類似物競爭結合其夥伴。然後測量結合至夥伴的標記的分析物類似物的量。在這種方法中，反應信號與生物學樣品中分析物的濃度成反比。這是因為反應信號越大，樣品中越少分析物可用於與標記的分析物類似物競爭。
在非競爭性親和力測定中，其也稱為「夾心測定」，生物學樣品中的分析物結合至其夥伴，然後標記試劑結合至所述分析物。然後測量位點上標記試劑的量。不像競爭性方法，非競爭性方法即夾心測定的結果直接與生物學樣品中分析物的濃度成比例。這是因為如果生物學樣品中不存在分析物，則標記試劑不會結合。
親和力測定，特別是免疫測定廣泛用作細菌、病毒、內分泌和寄生疾病的診斷工具以及濫用和慢性疾病狀態的檢測藥物，一個實例是可以導致心臟病發作的心臟疾病。
各種技術如放射免疫測定、免疫過氧化物酶和ELISA目前用於親和力測定，特別是免疫測定。然而，放射免疫測定具有需要使用危險和破壞環境的試劑的缺點。
此外，除了特異性，如上文所述，靈敏度對於測定性能是至關重要的。測定的靈敏CN 102947703 A書明說2/15 頁度可以通過結合事件產生的特異性信號與系統的背景噪聲相比的比例來定義。
降低信噪比(SNR)的因素包括試劑如抗體非特異性結合至測定的各種組分。此外，與測定的試劑如酶底物反應的測定基質的一些內源性組分的活性傾向於產生「假」反應產物，其幹擾標記的複合物如標記的抗體_抗原複合物形成的「真正」產物的準確檢測。
通常，將添加劑如封閉試劑加入測定基質以降低測定噪聲並減少假陽性信號。發明內容
本發明的目的是提供一種與現有技術已知的親和力測定相比具有更高信噪比的親和力測定。
本發明的另一目的是提供這樣的親和力測定，其適合廣泛的分析物。
具體地，本發明的目的是提供一種適合整合入醫療點或者臺面、裝置和微型化的親和力測定。
本發明的另一目的是提供一種產生最少假陽性結果的快速和可靠的親和力測定。
這些目的通過用獨立權利要求所示的親和力測定檢測生物學樣品中的生物學靶標的方法來實現。從屬權利要求表明優選的實施方案。在這種上下文中值得注意的是，以下描述中給出的所有範圍應當理解為它們包括限定這些範圍的值。·


本發明的這些和其他方面參考下文所述的實施方案會清楚和闡明。
圖I圖示根據本發明將捕獲的生物學靶標濃縮為小於生物學樣品體積的洗脫體積以及檢測和/或定量的進一步任選存在的步驟的一個實例。
圖2圖示根據本發明在親和力測定中檢測生物學靶標的方法的一個實例。
圖3示出本發明怎樣實現增加信噪比的目的的另一方面。
圖4示出第一捕獲部分的組織的實例。
圖5示出合適的接頭的模塊設計的一些實例。
圖6示出富集的3-表位親和力測定的概念驗證。
圖7示出來自建立心肌肌鈣蛋白-I (cTnl)和前列腺特異性抗原(PSA)的3_表位親和力測定的初步實驗的結果。
圖8圖示熱切割然後競爭性親和力測定的實例。
圖9更詳細地示出3-表位測定中的第一捕獲部分不幹擾檢測。
圖10示出捕獲時間常數的確定。
圖11示出步驟c)的評價，即對各種體積濃縮因素的生物學靶標濃縮的評價。
圖12示出步驟c)的劑量反應曲線，即生物學靶標濃縮的劑量反應曲線。
具體實施方式
根據本發明，通過親和力測定檢測生物學樣品中的生物學靶標的方法包括以下步驟
a)提供包含所述生物學靶標的生物學樣品體積；
b)將第一捕獲部分加入包含所述生物學靶標的生物學樣品體積，其中所述第一捕5獲部分粘附至顆粒；
c)將捕獲的生物學靶標濃縮為小於步驟a)中的生物學樣品體積的洗脫體積；
d)從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學靶標；
e)以夾心或競爭性親和力測定形式直接或間接檢測和/或定量所述生物學靶標， 其中所述生物學靶標與至少一種捕獲部分相關，優選與至少兩種捕獲部分相關。
這種親和力測定具有這樣的優勢，將生物學靶標濃縮並去除可以幹擾檢測的因素，因此導致增加的特異性結合和減少的非特異性結合，從而導致測定的大大增加的信噪比和更高的靈敏度。
具體地，生物學靶標結合至第一捕獲部分與生物學靶標的檢測和/或定量分開是有益的。因此第一捕獲部分的量與粘附的顆粒可以是大的，以便捕獲儘可能多的生物學靶標，但是第一捕獲部分與粘附的顆粒不幹擾生物學靶標的檢測和/或定量。例如，如果第一捕獲部分與粘附至它們的大磁性顆粒用來捕獲大體積的生物學靶標，例如生物學樣品，其比較小的顆粒更易於驅動。因此，更易於從大體積(生物學樣品)收集這些較 大的顆粒，並且將它們和結合的生物學靶標轉移至較小的體積(洗脫體積)。
如本文所用，術語「生物學靶標」指待檢測的生物學來源的物質。生物學靶標的非限制性實例為蛋白、肽、抗體、毒性物質、脂質、胺基酸、胺、信使或小分子、碳水化合物、細胞組分、病毒、細胞外基質的組分、細胞、細胞片段、核酸、半抗原和/或藥物。
如本文所用，術語「親和力測定」指測量生物學靶標的存在或濃度的生物化學測試，其基於捕獲部分以高特異性結合至生物學靶標以及任選地結合至一種或非常有限組的其他分子的能力。
如本文所用，術語「生物學樣品體積」指其中最初提供生物學靶標的體積或部分體積。
如本文所用，術語「捕獲部分」指結合元件，例如這樣的部分，其包含選擇性結合至生物學靶標的表位的互補性決定區域並可以結合至至少一種其他實體如顆粒，並且可以具有與其相關的試劑。
在一優選實施方案中，捕獲部分為抗體，例如動物抗體、人抗體、人嵌合抗體和人源化抗體及其片段，如Fab片段等，或者為適配體，或者為核酸或多肽或包含結合位點的任何物質。
如本文所用，術語「結合元件」指另一元件可以結合或關聯的位點。在本發明的一優選實施方案中，結合位點為表位，即抗原決定簇，即被免疫系統，特別是抗體、B細胞或T 細胞識別的抗原部分。
適配體是結合至特異性祀分子的寡核酸(oligonucleic acid)或肽分子。適配體通常通過從大的隨機序列池選擇來產生，但是天然適配體還存在於核糖開關(riboswitch) 中。
如本文所用，術語「顆粒」指能夠支持捕獲部分的粘附的結構，例如珠。顆粒可以製備自瓊脂糖、聚苯乙烯、乳膠、聚乙烯醇、矽。在一優選實施方案中，顆粒可以具有 5 μ m-o. I μ 的直徑，更優選 I μ m-0. 3 μ m,即彡 O. 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9 和 / 或 < I μ m0
如本文所用，術語「切割」指從顆粒分離捕獲部分或者從捕獲部分分離生物學靶標。
如本文所用，術語「粘附至」指捕獲部分通過接頭粘附至顆粒之一的情況。
如本文所用，術語「接頭」指允許從顆粒分離第一捕獲部分的結構。接頭可以位於第一捕獲部分上和/或顆粒中。例如，如果採用PH誘導的切割就可以是這樣。或者，接頭可以是偶聯至捕獲部分和/或顆粒的分離結構。
接頭可以利用模塊設計來構建；圖5給出一些實例。原則上可以使用任何偶聯(生物)化學(羧基、胺、sulfhydride、馬來醯亞胺等)，優選互相不同。此外,接頭應當包含可切割的實體。可切割的實體的實例和切割的方法包括但不限於
可以通過蛋白酶切割的肽(優選特異性胺基酸序列)；和/或
可以通過核酸酶切割的核酸序列(優選特異性序列/核酸酶)；和/或
光致斷裂兀件(Photocleavableelement);和 / 或
溫度誘導的切割；和/或
化學誘導的切割(例如S-S鍵的還原)；和/或
pH誘導的切割。
接頭的實例為包含限制位點的合成DNA片段，但是接頭的許多不同選擇是可用的。
如本文所用，術語「相關」指物理關聯。
如本文所用，術語「直接檢測和/或定量」表示檢測和/或定量生物學靶標本身。
如本文所用，術語「間接檢測和/或定量」表示使用競爭性親和力測定，其中不檢測和/或定量生物學靶標本身，但是檢測和/或定量與生物學靶標競爭步驟e)的至少一種捕獲部分的實體，例如生物學靶標的類似物。
在一優選實施方案中，步驟e)中的至少一種捕獲部分為檢測表面的一部分。
如本文所用，術語「檢測表面」指能夠結合生物學靶標以及使得能夠檢測的表面。 為了本發明的目的，檢測表面可以是生物的、非生物的、有機的、無機的或者它們的組合，並且可以為顆粒、鏈、沉澱、凝膠、片、管、球、容器、毛細管、墊、薄片、膜、玻片等的形式，具有任何方便的形狀，包括圓盤、球形、圓形等，只要其允許檢測結合的生物學靶標。
在這樣的設定中，特別優選步驟e)中的至少一種捕獲部分包含以這樣的方式構建的生物化學分子或結構，其允許結合至支持物以及生物學靶標。這樣的生物化學分子或結構的實例為核酸，優選多達200個鹼基的DNA寡核苷酸，以及蛋白和半抗原如抗體或凝集素，其可以結合分子結構如DNA序列、抗體、抗原或酶。
步驟e)中的至少一種捕獲部分還可以包含強結合物質如鏈黴親和素。
如本文所用，術語「檢測」指確定生物學靶標的物理存在和/或定量檢測生物學靶標。
在一優選實施方案中，親和力測定為免疫測定，即該測定利用抗體特異性結合分析物，即生物學靶標。這有利於可獲得具有不同結合位點的不同抗體的良好選擇的那些生物學靶標，因為抗體_抗原結合通常是高度特異性和非常靈敏的。
在另一優選實施方案中，步驟a)-d)順序應用一次或多次。這是有利的，因為其允許更高地富集和/或純化溶液中的生物學靶標。
此外，優選生物學靶標與步驟e)中的至少兩種捕獲部分相關，其中所述兩種捕獲部分中的一種為檢測表面的一部分，而另一種使得能夠在這種表面上檢測。換句話說，生物學靶標直接結合至檢測表面。
這種生物學靶標直接結合至檢測表面的捕獲部分具有這樣的優勢，檢測和/或定量生物學靶標不需要額外的系列結合步驟。
在本發明的方法的另一優選實施方案中，在步驟e)中，第一捕獲部分或第二捕獲部分與另一捕獲部分相關。
因此，如果第一捕獲部分與生物學靶標一起從顆粒切割，第一捕獲部分或其一部分可以用來結合至另一捕獲部分。優選地，額外的捕獲部分是檢測表面的一部分。這樣，生物學靶標間接結合至額外的捕獲部分並因此結合至檢測表面，從而使得能夠檢測(參見例如圖3B)。
如本文所用，術語「間接結合」表示生物學靶標本身不結合至檢測表面。取而代之， 第一捕獲部分的一部分如第三實體或標籤結合至檢測表面(參見例如圖3B和圖3C)。
如果生物學靶標僅具有一個捕獲部分可以結合的位點，則間接結合特別有利，因為在檢測表面上的生物學靶標的重新捕獲發生時這個位點已被第一捕獲部分佔據。
或者，無論第一捕獲部分是否與生物學靶標一起從顆粒切割，第二捕獲部分均可以結合至生物學靶標，並且這種第二捕獲部分轉而可以用來結合至另一捕獲部分。因此同樣地，如果額外的捕獲部分是檢測表面的一部分，則生物學靶標間接結合至額外的捕獲部分並因此結合至檢測表面，從而使得能夠檢測(參見例如圖3C)。
在本發明的方法的另一優選實施方案中，在步驟e)中，生物學靶標與進一步的捕獲部分相關。
因此在這個優選實施方案中，生物學靶標與至少3種捕獲部分相關。例如，這些可以是與生物學靶標一起從顆粒切割的第一捕獲部分以及兩種額外的捕獲部分，其中一種是檢測表面的一部分，而另一種使得能夠在這種表面上檢測。換句話說，生物學靶標直接結合至檢測表面(參見例如圖3D)。
這種生物學靶標直接結合至檢測表面的捕獲部分具有這樣的優勢，檢測和/或定量生物學靶標不需要額外的系列結合步驟。
此外，生物學靶標可以與4種捕獲部分相關，如果第一捕獲部分與生物學靶標一起從顆粒切割就可以是這樣。可能來自生物學靶標的第二輪濃縮並在切割之後還保持連接至生物學靶標的第二捕獲部分結合至第三捕獲部分，其是檢測表面的一部分，而第四捕獲部分連接至顆粒，使得能夠在這種檢測表面上檢測。第二部分可以通過DNA-接頭結合至第三捕獲部分，所述DNA-接頭具有第三捕獲部分識別的表位。
例如，如果檢測表面的捕獲部分即第三捕獲部分與第二捕獲部分之間的結合通過強結合物質介導，如生物素與鏈黴親和素之間的相互作用，則這種配置是有利的。
在本發明的方法的另一優選實施方案中，試劑與至少一種捕獲部分相關，或者在競爭性親和力測定形式的情況下，與步驟e)中的生物學靶標的類似物相關。
如本文所用，術語「試劑」指使得能夠在親和力測定中檢測生物學靶標和/或促進在親和力測定中檢測生物學靶標的物質。
如本文所用，術語「生物學靶標的類似物」指在競爭性親和力測定中與生物學靶標競爭結合位點的物質。
包含這個額外步驟的親和力測定是有利的，因為試劑可以是與本領域已知的公認的檢測系統一起工作的許多物質中的任何一種。因此，無論測定的生物學靶標，實際的檢測反應可以從多種已知的方法中選擇。
如果親和力測定包含這個額外步驟，如果接頭包含間隔元件，這是有益的，因為檢測表面與試劑之間的距離增加，這允許非特異性與特異性結合之間更好的區別。
優選地，所述試劑選自
放射性同位素；和/或
固相，例如磁珠或乳膠珠或檢測表面；和/或
螢光、磷光和/或化學發光染料；和/或
酶和/或酶底物；和/或
核酸序列、肽；和/或
膠體或納米顆粒；和/或
聚合物或大分子，例如樹狀聚體或脂質體。
在本發明的優選方法中，將捕獲的生物學靶標濃縮為小於步驟a)中的生物學樣品體積的第二體積通過磁性分離或重力來進行。
優選地，在濃縮步驟中，生物學樣品體積以1:2-1:1000的比例減小，S卩1:2、1:3、 1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:200、1:500 和 / 或 1:1000。
此外，生物學樣品體積優選具有I μ l-5ml的體積，即彡I μ 1,2 μ 1,3 μ 1,4 μ I, 5 μ 1、6μ 1、7μ 1、8μ 1、9μ 1、10μ 1、11μ 1、12μ 1、13μ 1、14μ 1、15μ 1、16μ 1、17μ I、 18 μ 1、19μ I >20 μ 1、21μ I >22 μ 1、23μ I >24 μ 1、25μ I、26 μ 1、27μ 1、28μ I、29 μ I、 30 μ 1,50 μ I、100 μ 1,300 μ 1,500 μ l、lml、3ml 和 / 或 5ml。
濃縮步驟之後的生物學樣品體積，這裡也稱為洗脫體積，對於酶促洗脫可以高達例如5 μ L,而對於光化學洗脫可以高達例如15 μ L。
可用於濃縮步驟a)中的生物學靶標的兩種方法磁性分離或重力是快速、可靠的技術。
在一可選實施方案中，生物學樣品體積比生物學靶標比例的減小通過過濾來進行。在這種情況下，顆粒可以為His-標籤，即由至少5個組氨酸(His)殘基組成的胺基酸基序，並且過濾可以利用親和介質如Ni Sepharose> NTA-瓊脂糖、His60Ni、HisPur樹脂或 Talon樹脂來進行。
優選地，顆粒為磁性顆粒和/或超順磁顆粒。這是有益的，因為磁性顆粒和/或超順磁顆粒具有高表面比體積比例，並且磁性顆粒使得生物學樣品體積比生物學靶標的比例能夠通過磁性分離而減小。
例如，如果顆粒為磁性顆粒，則本發明的方法可以如下進行首先，將包含生物學靶標的生物學樣品體積提供在第一室中。然後，加入粘附至磁性顆粒的第一捕獲部分。在足夠的生物學靶標與粘附至磁性顆粒的第一捕獲部分之間的結合發生之後，利用磁力將捕獲部分與生物學靶標轉移至第二個較小的室，從而減小生物學樣品體積比生物學靶標的比例。隨後，從磁性顆粒切割第一捕獲部分，並且將磁性顆粒從第二個較小的室去除。最後， 在檢測表面上重新捕獲生物學靶標，並且在檢測表面上檢測和/或定量生物學靶標。
利用這種方法，大量磁性顆粒可以用來分離和濃縮生物學樣品體積內的生物學靶標而不幹擾隨後的檢測步驟。
在本發明的另一優選方法中，從顆粒切割第一捕獲部分通過酶促、熱和/或光化學切割進行。
還可以平行或順序(after each other)聯合使用的每種不同的切割方法具有其特定優勢。然而，所有切割方法均可以與親和力測定聯合使用，因為所有切割方法均引起最小幹擾和流體的最小汙染。可選方法，例如通過降低PH切割或化學誘導的切割如還原反應可以強烈影響生物學靶標的狀態和構象，並且可以改變溶液的化學條件，從而強烈幹擾隨後的親和力測定。雖然最後這兩種方法均為簡單的公知的從抗體洗脫分析物的方式，但是它們具有在過程中以後影響生物學靶標的親和力測定的缺點。
例如酶促切割可以用於所有靶標，並且它是溫和的過程，可以用於是蛋白的生物學靶標，因為它通常不變性蛋白。因此，本發明的方法對於濃縮即蛋白的富集特別有利，濃縮的進行通常非常具有挑戰性，這是由於蛋白分子對溫度的敏感性和緩衝製劑的變化。此外，酶促切割允許隨後的免疫測定。使用DNA的優勢是測定的性能可以通過在抗體結合以外的地方放置限制位點來增強。剩餘的DNA接頭可以用來增加最終測定上的檢測信號。
切割的優選酶為DNase和EcoRl。對於優選實施方案，DNAse表現出比EcoRl更高的收率。可以使用任何特異性核酸酶，具有對DNA序列的最小影響。這裡,在優選實施方案中，EcoRI用來顯示系統可以是可適應的，並且還顯示核酸檢測方法的通用性。
熱切割具有這樣的優勢，切割位點具有比酶促切割少的特異性要求，其特別適合可以耐受高溫的生物學靶標，例如小分子。然而，如果小心不要使用可以變性蛋白的溫度， 則還可以對是蛋白的生物學靶標進行熱切割。
在熱切割的情況下，從顆粒切割第一捕獲部分的步驟可以被從第一捕獲部分切割生物學靶標代替。然而，當然還可能將熱切割位點構建入接頭和/或第一捕獲部分本身。
光化學切割是有益的，因為不需要加入其他底物，例如酶促反應的酶。關於將這種測定整合入緊湊型裝置，光化學切割也表現出一些優勢。
然而，用這種形式的切割，測定需要在允許光穿透的環境如暗盒(cartridge)中進行。
此外，優選的檢測和/或定量方法選自
-光學檢測,例如突光、磷光、化學發光、吸收、散射、成像、瞬逝場技術、受抑全內反射、表面等離子共振、拉曼、光譜學；和/或
-酶反應；和/或
-核酸擴增技術，例如免疫-PCR、滾環擴增；和/或
-磁性檢測，例如通過磁致電阻、霍爾效應、線圈；和/或
-聲波檢測，例如表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體；和/或
-電檢測，例如電導、阻抗、電流、氧化還原循環、電荷；和/或
-光磁檢測。
一種光學檢測技術為受抑全內反射(FTIR)。在正確的角度照明，通常反射擊中傳感器的活性表面下側的光強度沒有任何損失，這是全內反射。然而，當納米顆粒結合至表面的對側時，它們散射並吸收光，減少反射光束的強度。通過傳感器檢測對應於結合的納米顆CN 102947703 A書明說8/15 頁粒的數量的反射光束的這些強度變化，例如與數位相機中使用的相似的CMOS圖像傳感器。 這是FTIR。
各種合適的酶反應如辣根過氧化物酶是本領域公知的。
免疫-PCR為抗原檢測系統，其中特異性DNA分子用作標記，並且PCR用來檢測這種標記。
如果試劑為磁性顆粒，檢測的優選方法為FTIR，因為其可靠、快速，並且可以在小體積中工作。
在本發明的方法的一優選實施方案中，切割為酶促的，試劑為磁珠，並且生物學靶標與進一步的捕獲部分相關。
在另一優選實施方案中，生物學靶標結合至第一捕獲部分、第二捕獲部分和第三捕獲部分全部通過生物學靶標上的結合位點進行。
在這樣的情況下，生物學靶標上的3個結合位點被與試劑相關的第一捕獲部分、 第二捕獲部分以及第三捕獲部分佔據，所述第三捕獲部分優選為檢測表面的一部分。
本發明的發明人令人驚訝地發現雖然生物學靶標上的2個結合位點已被佔據，靶標仍然可以通過第三結合位點直接結合至檢測表面。換句話說，已結合的元件不空間上阻礙生物學靶分子的檢測，即使在磁珠作為試劑，第二捕獲部分試劑複合物非常大的情況下也是如此。
在另一優選實施方案中，生物學靶標結合至第一捕獲部分、第二捕獲部分和第三捕獲部分全部通過結合至表位進行，即結合至生物學靶標的抗原決定簇。
這種「3-表位_測定」是有利的，因為其具有高特異性，這是由於結合至生物學靶標的3個抗原決定簇。此外，由於從顆粒酶促切割第一捕獲部分，生物學靶標在空間上對於試劑相關的第二捕獲部分非常易於接近，並且直接結合至檢測表面。
在一可選實施方案中，提供生物學靶標的檢測配置，其包含第一、第二和第三捕獲部分，其中試劑與第二和/或第三捕獲部分相關，並且生物學靶標直接結合至所有三個捕獲部分，從而使得能夠檢測。
在這種檢測配置的一優選實施方案中，生物學靶標通過表位結合至所有捕獲部分。
在另一可選實施方案中，提供捕獲部分，其包含
a)用於附著至顆粒的第一實體，
b)用於切割對顆粒的附著的第二實體，以及
c)用於附著至檢測表面的第三實體。
優選地，權利要求13的捕獲部分在權利要求1-10中任一項的方法中用作第一捕獲部分。
因此，當使用這個實施方案時，第一捕獲部分結合至生物學靶標，並且與生物學靶標一起從顆粒切割。
優選地，檢測表面包含進一步的捕獲部分。
與上述3-表位測定相反，結合至檢測表面是間接的，因為第三實體結合至檢測表面而不是生物學靶標。
在這種情況下，如果接頭包含間隔是有益的，因為這增加檢測表面上第三實體的11結合面積。具體地，間隔增加在檢測表面上找到結合位置的面積，因為其中第三實體可以成功地結合更多方向或空間。
一般來說，可以研究本發明的方法的步驟b)期間發生的第一捕獲反應作為時間和顆粒濃度的函數。步驟b)期間發生的第一捕獲部分與生物學靶標之間的相互作用可以模擬為一階速率表達式及之後的重排；捕獲效率(ε capt)如下
權利要求
1.一種在親和力測定中檢測生物學靶標的方法，所述方法包括以下步驟a)提供包含所述生物學靶標的生物學樣品體積；b)將第一捕獲部分加入包含所述生物學靶標的生物學樣品體積，其中所述第一捕獲部分粘附至顆粒；c)將捕獲的生物學靶標濃縮為小於步驟a)中的生物學樣品體積的洗脫體積；d)從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學靶標；e)以夾心或競爭性親和力測定形式直接或間接檢測和/或定量所述生物學靶標，其中所述生物學靶標與至少一種捕獲部分相關，優選與至少兩種捕獲部分相關。
2.如權利要求I所述的方法，其中在步驟e)中，所述第一捕獲部分或第二捕獲部分與另一捕獲部分相關。
3.如權利要求I或2所述的方法，其中在步驟e)中，所述生物學靶標與進一步的捕獲部分相關。
4.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中在步驟e)中，試劑與至少一種捕獲部分相關，或者在競爭性親和力測定形式的情況下，與所述生物學靶標的類似物相關。
5.如權利要求4所述的方法，其中所述試劑選自放射性同位素；和/或固相，例如磁珠或乳膠珠或檢測表面；和/或螢光、磷光和/或化學發光染料；和/或酶和/或酶底物；和/或核酸序列、肽；和/或膠體或納米顆粒；和/或聚合物或大分子，例如樹狀聚體或脂質體。
6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中將所述捕獲的生物學靶標濃縮為小於步驟a)中的生物學樣品體積的洗脫體積通過磁性分離或重力來進行。
7.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述顆粒為磁性顆粒。
8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學靶標通過酶促、熱和/或光化學切割進行。
9.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述檢測和/或定量方法選自-光學檢測，例如螢光、磷光、化學發光、吸收、散射、成像、瞬逝場技術、FTIR、表面等離子共振、拉曼、光譜學；和/或 _酶反應；和/或-核酸擴增技術，例如免疫-PCR、滾環擴增；和/或 -磁性檢測，例如通過磁致電阻、霍爾效應、線圈；和/或 -聲波檢測，例如表面聲波、體聲波、懸臂、石英晶體；和/或 -電檢測，例如電導、阻抗、電流、氧化還原循環、電荷。
10.如權利要求3-9中任一項所述的方法，其中所述切割是酶促的，所述試劑為磁珠， 並且所述生物學靶標與進一步的捕獲部分相關。
11.一種生物學靶標的檢測配置，其包括生物學靶標，第一、第二和第三捕獲部分，其中試劑與第二和/或第三捕獲部分相關，並且所述生物學靶標直接結合至所有三個捕獲部分，從而使得能夠檢測。
12.如權利要求11所述的檢測配置，其中所述生物學靶標通過表位結合至所有捕獲部分。
13.—種用於如權利要求1-10所述的方法的捕獲部分,其包含a)用於附著至顆粒的第一實體(404)，b)用於切割對顆粒的附著的第二實體(406)，以及c)用於附著至檢測表面的第三實體(407)。
14.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中加入所述生物學樣品體積的第一捕獲部分包含a)用於附著至顆粒的第一實體(404)，b)用於切割對顆粒的附著的第二實體(406)，以及c)用於附著至檢測表面的第三實體(407)。
全文摘要
本發明涉及一種在親和力測定中檢測生物學靶標的方法，所述方法包括以下步驟提供包含所述生物學靶標的生物學樣品體積；將第一捕獲部分加入包含所述生物學靶標的生物學樣品體積，其中所述第一捕獲部分粘附至顆粒；將捕獲的生物學靶標濃縮為小於步驟a)中的生物學樣品體積的洗脫體積；從所述顆粒切割所述第一捕獲部分或所述生物學靶標以及以夾心或競爭性親和力測定形式直接或間接檢測和/或定量所述生物學靶標，其中所述生物學靶標與至少一種捕獲部分相關，優選與至少兩種捕獲部分相關。
文檔編號G01N33/543GK102947703SQ201180029393
公開日2013年2月27日 申請日期2011年6月14日 優先權日2010年6月17日
發明者G·薩瓦特, M·W·J·普林斯, T·H·埃弗斯, W·M·哈德曼, J·G·奧塞爾 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司