一種提取胰島素的方法

2023-09-23 12:19:05

一種提取胰島素的方法
【專利摘要】本發明闡述一種提取胰島素的方法。本發明的技術方案採取酸醇液法破壞胰臟，來提取胰島素，然後根據等電點沉澱的原理，調節pH，鹼化、酸化除雜蛋白，減壓濃縮進一步提純並除去乙醇，最後加熱去脂，氯化鈉鹽析製得胰島素。本法每千克胰臟可得4g以上胰島素。
【專利說明】—種提取胰島素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物製藥領域，設計藥用胰島素的生化分離技術。具體地說是採用酸醇提取減壓濃縮法提取動物胰臟中的胰島素。
【背景技術】
[0002]胰島素是哺乳動物胰島β細胞分泌的蛋白性激素，分子中含有以二硫鍵相連接的兩條多肽鏈。胰島素可溶於80%以下的稀醇、稀丙醇及酸、鹼中，不溶於90%以上的乙醇及其他有機溶劑，在PH值為2~4時較穩定，遇蛋白酶、強酸、強鹼易被破壞，加熱易變性，其等電點為5.3~5.4。 [0003]胰島素可以調節糖代謝，減少糖原異生，促進糖原合成，抑制糖原分解，加速葡萄糖的無氧酵解和有氧氧化，促進組織對葡萄糖的利用，並能促進葡萄糖轉變為脂肪，因而可降低血糖。
[0004]糖尿病是世界上最常見的代謝疾病之一，據國際糖尿病聯盟2011年公布的最新數據顯示，全球糖尿病患病人數已達到3.66億。臨床糖尿病患者多使用胰島素療法以維持血糖的正常水平。近年來人胰島素在臨床上也得到了廣泛的應用。目前，應用基因工程和蛋白水解酶的轉肽方法已成功地生產出人胰島素。基因工程方法生產人胰島素投資大，工藝複雜。
[0005]傳統生產工藝從從動物(豬)提純胰島素，採用酸-醇液將其萃取分離，通過鹽析將其析出後進行分離純化。結果:去除雜質蛋白、陰陽離子、熱原性物質等，可得到胰島素。

【發明內容】

[0006]本發明的目的就是為了提高胰島素的收率，對傳統工藝加以改造，控制好酸-醇萃取液的鹼化、酸化PH值，得到了一種改良的從動物胰臟中提取胰島素的方法，該方法包括如下步驟:
[0007](I)原料預處理:胰臟離體後，要立即深凍，先在-20~_40°C下急凍後轉入-15~28°C°C保存備用。
[0008](2)酸醇液提取:胰臟凍乾粉碎後加入2.0~3.0倍量的酸性乙醇用冰乙酸調PH2.0~3.2，乙醇含量為60%~75%，在8~15°C攪拌提取3h，離心，取上清液。濾渣再用1.0~2.0倍量酸性乙醇同上述方法提取。合併兩次提取液。
[0009](3)鹼化、酸化:提取液在不斷攪拌下加入濃氨水調pH7.8~8.5(液溫10~15°C )，立即進行壓濾，除去鹼性蛋白，濾液應澄清，並及時用硫酸酸化至PH3.5~3.8，降溫至4~5°C，靜置4~8h，使酸性蛋白充分沉澱。
[0010](4)減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內，下層過濾，沉澱物棄去。濾液併入上清液，在30°C以下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液比重為1.04~1.06(約為原體積的I /10~I / 9為止)。
[0011](5)去脂、鹽析:濃縮液轉入去脂鍋內於5min內加熱至48~55°C後，立即用冰鹽水降溫至4~5°C，靜置3~4h，分離出下層清液。用鹽酸調pH2.3~2.5，於20~25°C在攪拌下加入0.25~0.3倍量固體氯化鈉，保溫靜置3~8h，析出沉澱。
[0012](6)洗滌、乾燥:過濾，沉澱用丙酮洗滌三次，10~30°C真空乾燥，得胰島素，稱重。
[0013]與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:
[0014]採用酸醇提取減壓濃縮法提取動物胰臟中的胰島素，可以提高提取胰島素的效率，並且使其理化性質和生物活性保持穩定，從而有利於下一步對胰島素進行精製，最終使胰島素的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得胰島素收率提高到0.4%~0.6%，節約成本，提高了經濟效益。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0016]實施例1
[0017](I)原料預處理:胰臟離體後，要立即深凍，先在_30°C以下急凍後轉入_20°C保存備用。
[0018](2)酸醇液提取:取凍幹胰塊4kg，用刨胰機刨碎後加入11.2L的酸性乙醇(酸性乙醇控制含量為68%，並用冰乙酸調pH2.5)，，在12°C攪拌提取3h，離心，取上清液10.1L。濾渣再用10.1L酸性乙醇同上述方法提取lh，離心，取上清液。合併兩次提取液。
[0019](3)鹼化、酸化:提取液在不斷攪拌下加入濃氨水調PH8.0(液溫12°C )，立即進行壓濾，除去鹼性蛋白，濾液應澄清，並及時用硫酸酸化至PH3.6，降溫至5°C，靜置4h，使酸性蛋白充分沉澱。
[0020](4)減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內，下層用帆布過濾，沉澱物棄去。濾液併入上清液，在20°C下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液比重為1.04(約為原體積的I / 10)。
[0021](5)去脂、鹽析:濃縮液轉入去脂鍋內與5min內加熱至50°C後，立即用冰鹽水降溫至5°C，靜置4h，分離出下層清液。用鹽酸調pH2.3，於20°C在攪拌下加入0.25倍量固體氯化鈉，保溫靜置4h，析出沉澱。
[0022](6)洗滌、乾燥:過濾，沉澱用丙酮洗滌三次，20°C真空乾燥，得胰島素，稱重20.4g0
[0023]實施例2
[0024](I)原料預處理:胰臟離體後，要立即深凍，先在_35°C以下急凍後轉入_15°C保存備用。
[0025](2)酸醇液提取:取凍幹胰塊4kg，用刨胰機刨碎後加入9.2L的酸性乙醇(酸性乙醇控制含量為75%，並用冰乙酸調pH2.9)，，在10°C攪拌提取3h，離心，取上清液7.95L。濾渣再用7.95L酸性乙醇同上述方法提取lh，離心，取上清液。合併兩次提取液。
[0026](3)鹼化、酸化:提取液在不斷攪拌下加入濃氨水調PH8.3(液溫10°C )，立即進行壓濾，除去鹼性蛋白，濾液應澄清，並及時用硫酸酸化至PH3.4，降溫至4°C，靜置6h，使酸性蛋白充分沉澱。
[0027](4)減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內，下層用帆布過濾，沉澱物棄去。濾液併入上清液，在20°C下減壓蒸去乙醇，濃縮至濃縮液比重為1.06(約為原體積的I / 9)。
[0028](5)去脂、鹽析:濃縮液轉入去脂鍋內與5min內加熱至55°C後，立即用冰鹽水降溫至4°C，靜置6h，分離出下層清液。用鹽酸調pH2.5，於20°C在攪拌下加入0.28倍量固體氯化鈉，保溫靜置6h，析出沉澱。
[0029](6)洗滌、乾燥:過濾，沉澱用丙酮洗滌三次，20°C真空乾燥，得胰島素，稱重19.2g0
[0030]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，並非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與`改型`，仍屬於本發明技術方案的保護範圍。
【權利要求】
1.一種提取胰島素的方法，其特徵在於，包括以下步驟:(I)原料預處理；(2)酸醇液提取；⑶酸化、鹼化；⑷減壓濃縮；(5)去脂、鹽析。
2.權利要求1所述製備方法，其特徵在於，各步驟具體為: (1)原料預處理:胰臟離體後，立即深凍。 (2)酸醇液提取:胰臟凍乾粉粹後，加入酸性乙醇攪拌提取，離心，取上清液。濾渣再用上述方法提取。合併兩次提取液。 (3)鹼化、酸化:提取液加入濃氨水調pH，壓濾，除去鹼性蛋白，濾液用硫酸酸化，降溫，靜置，使酸性蛋白充分沉澱。 (4)減壓濃縮:吸上層清液至減壓濃縮鍋內，下層過濾，沉澱物棄去。濾液併入上清液，減壓蒸去乙醇，濃縮 。 (5)去脂、鹽析:濃縮液加熱降溫去脂。用鹽酸調pH，加入0.25~0.3倍量固體氯化鈉，保溫靜置，析出沉澱。 (6)洗滌、乾燥:過濾，沉澱用丙酮洗滌，真空乾燥，得胰島素。
3.根據權利要求2所述的一種提取胰島素的方法，其特徵在於，所述胰臟為羊胰臟。
4.根據權利要求2所述的一種提取胰島素的方法，其特徵在於，所述步驟(1)中，胰臟採用-20~_40°C速凍法，貯存溫度為-15~28°C。
5.根據權利要求2所述的一種提取胰島素的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中酸醇液pH為2.0~2.9，乙醇含量為60%~75%，攪拌溫度為8~15°C。
6.根據權利要求2所述的一種提取胰島素的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中鹼化pH為7.8~8.5，酸化pH為3.4~3.8。
7.根據權利要求2所述的一種提取胰島素的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中採用減壓濃縮法蒸去乙醇，溫度為25~35°C。
8.根據權利要求2所述的一種提取胰島素的方法，其特徵在於，所述步驟(5)中濃縮液加入去脂鍋內迅速加熱降溫去脂，加熱去脂的溫度為:45~52°C。
9.根據權利要求2所述的一種提取胰島素的方法，其特徵在於，所述步驟(6)中採用電熱真空乾燥箱進行乾燥。
【文檔編號】C07K1/14GK103739702SQ201310643508
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月30日 優先權日:2013年11月30日
【發明者】劉乃山, 安迪, 劉君, 李靜潔, 張元澤 申請人:青島康原藥業有限公司