A型肉毒桿菌毒素中和組合物及人抗a型肉毒桿菌毒素抗體的製作方法

2023-09-23 05:56:30

專利名稱：A型肉毒桿菌毒素中和組合物及人抗a型肉毒桿菌毒素抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及對於A型肉毒桿菌毒素具有結合活性且具有完全人可變區的基因重 組抗體、編碼該抗體的核酸分子、生產該抗體的轉化體、使用該轉化體的抗體製備方法以及 使用該抗體的A型肉毒桿菌毒素中和組合物等。
背景技術：
肉毒桿菌(Clostridium botulinum)產生的毒素根據血清型的不同分類為A型 G型。A、B、E、F型毒素對人健康有重大影響。在人的肉毒桿菌中毒疾病中，有「食物性肉毒 桿菌病(肉毒桿菌食物中毒)」、「嬰兒肉毒桿菌病」、「創傷型肉毒桿菌病」和「感染型肉毒 桿菌病」4種。A型毒素與肉毒桿菌食物中毒的26%有關。A型毒素與肉毒桿菌食物中毒的 26%有關。B和E型次之，F型毒素與肉毒桿菌食物中毒的相關比例比較低。另外，有報告 創傷型肉毒桿菌中毒只由A型或B型毒素引起(非專利文獻1)。成人的肉毒桿菌食物中毒通常為，菌或芽孢在食品中增殖，結果產生的毒素經口 攝取而發病，另一方面，在新生兒肉毒桿菌病中，在蜂蜜等的食品中存在的菌或芽孢經口攝 取，結果菌在腸管發育、增殖，並產生毒素，由此引起中毒症狀。食物中毒的原因毒素根據國 家的不同而異，但有報告A型、B型和E型引起的病例。另外，嬰兒肉毒桿菌病的一大半是A 型、B型，但也有報告C. butiricum引起的E型毒素、引起的F型毒素。肉毒桿菌毒素是重鏈和輕鏈S-S鍵合(二硫鍵)的結構的分子。肉毒桿菌毒素阻 滯向肌肉的神經傳遞，由此引起弛緩性麻痺。如果肉毒桿菌毒素進入氣道、呼吸肌，則引起 致死性的呼吸障礙。肉毒桿菌中毒導致的死亡率為12%，在特定的危險人群中，死亡率更高 (非專利文獻3)。另一方面，由於肉毒桿菌毒素作為生物學毒素是致死性最高的毒素(純化 的A型毒素對70kg的人的致死量為，靜注或肌肉注射時為0. 09-1. 5μ g，在吸入時為 0. 70-0. 90&micro ；g,經 口時為 70 μ g (JAMA. 2001Feb28 ；285 (8) 1059-70)，因此除 了通常 的中毒以外，具備用於生物恐怖的特殊性，在社會上也受到廣泛關注。作為對於肉毒桿菌毒素的中和劑，在日本得到批准的物質是以馬血清為原材料的 製劑。該製劑為源自馬血清的球蛋白，即由於對人是以異種蛋白作為主成分，因此存在引起 過敏反應等的免疫反應的危險性。另外，還存在未知病毒感染、血清病的問題。而且，也難 以穩定地供給。進而，該製劑的製備需要1年以上，因此存在難以應對生物恐怖等非常時期 的情況。此外，由於馬的飼養管理存在問題，因此該製劑不適用於儲備目的。對於嬰兒肉毒桿菌病，為了避免過敏反應等的嚴重的副作用，現實情況是不進行 利用該馬球蛋白製劑的治療。在美國，利用由使健康人對肉毒桿菌類毒素免疫而得到的中 和抗體效價高的血漿調製的人球蛋白製劑，進行對於嬰兒肉毒桿菌病的特異性治療。實際 上，「BabyBIG」的商品名下，以嬰兒肉毒桿菌病為對象的藥品在美國FDA是作為罕用藥而批 準製造許可的。但是，該方法除了倫理上的問題以外，還存在得到原材料、生物危害的問題，而且從確保安全性的觀點考慮，有在製造時必須進行各種病毒檢查這樣的問題等。另外，在 日本，該製劑未得到批准，不能使用。有報告成功製作對於A型毒素的重組中和嵌合體抗體(專利文獻1).但是，在使 用該抗體時，必須解決HACA(人抗嵌合體抗體)出現的問題、過敏反應等的問題。另一方面，在美國，特別是從具備生物恐怖威脅的角度考慮而進行毒素中和的研 究開發，嘗試由對肉毒桿菌毒素五聚物免疫的人的B淋巴細胞製作噬菌體抗體文庫，由其 中選擇期望的完全人中和抗體的方法。但是，對於A型病毒，沒有成功取得單獨發揮充分的 中和活性的抗體克隆。因此，通過在由噬菌體呈現篩選的結果得到的1種人抗體中，混合源 自XENO小鼠的克隆1種，進而混合將通過小鼠免疫得到的小鼠抗體人化得到的抗體(寡克 隆化)，從而必須使中和活性強化，尚未達到期望的目的，即通過完全人中和抗體引起的毒 素中和(專利文獻2、3，非專利文獻4、5、6)。專利文獻1 日本特開2006-311857號公報專利文獻2 國際公開第2005/016232號小冊子專利文獻3 國際公開第2007/094754號小冊子非專利文獻1 :H. Sugiyama, Microbiol. Rev. 44 :419，1980專利文獻2 :S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3 :45，1981非專利文獻3 :C. 0. Tacket et al.，Am. J. Med. 76 :794，1984非專利文獻 4 :P. Amersdorfer et al.，Infect. Immun. 65(9) :3743，1997非專利文獻5 :P. Amersdorfer et al.，Vaccine 20:1640,2002非專利文獻6 :Α· Nowakowski et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA99 (17) 11346, 200
發明內容
本發明鑑於以上的背景，提供中和A型肉毒桿菌毒素的有效的組合物，從而解決 以往技術中的各種問題(過敏反應，異種蛋白、病毒的混入等)。另外，鑑於在現有的重組抗 體的檢測法中難以客觀地評價中和活性的情況，本發明的課題還在於，作為其它方面，在提 供A型肉毒桿菌毒素中和組合物時，通過適合於國際標準的數值表示中和活性。本發明人首先仿效現有技術，構建人噬菌體抗體文庫，嘗試分離特異性識別肉毒 桿菌毒素A的抗體克隆。在重複實施篩選時，可知雖然通過每次篩選選擇多個抗體克隆，但 反覆選擇表位相同的抗體。對於產生該現象的原因進行研究，結果認為，存在抗原性極高的 表位，其引起表位的重疊。依據該假設，將該表位封閉是用於有效地取得表位不同的抗體的 有效方法。因此，確立了以下的策略通過添加用多次篩選重複取得的抗體的片段，將抗原 性強的表位封閉(遮蔽)以後，使噬菌體抗體文庫與肉毒桿菌A型毒素反應。通過依照該 策略再次實施篩選，成功取得表位不同的多個抗體克隆。對成功取得的各抗體的表位進行 分析，結果根據表位的不同，分類為4種。即，判明成功取得與4個表位相關的特異性抗體 克隆。接著，依據國際標準(以日本藥局法在醫藥品各條記錄的生物學製劑醫藥品中記 載的「乾燥肉毒桿菌馬抗毒素(乾燥肉毒桿菌抗毒素)」項3. 2.7 「效價試驗」為基準)，進 行比較和評價將這些抗體3種或4種組合時的中和活性。結果發現，作為提供高中和活性的抗體克隆的組合，有3種抗體克隆的組合。另外，表明如果進一步組合1種抗體克隆，則 中和活性提高。以上，本發明人成功取得多個對於A型肉毒桿菌毒素具有高中和活性的抗體克 隆，同時明確被該抗體識別的4種表位與中和活性的關係。本發明主要基於這些成果，如下 所示。[1]A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其含有識別具有由序列編號4的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號8的胺基酸 序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位的第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，識別具有由序列編號36的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號40的氨基 酸序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位的第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，和識別具有由序列編號44的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號48的氨基 酸序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位、或者具有由序列編號52的胺基酸序列構成的重 鏈可變區和由序列編號56的基酸序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位的第3人抗A型肉 毒桿菌毒素抗體。[2]根據[1]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自下述(1) (3)中任一種的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是下述(4)或(5)的抗體，第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是選自下述(6) ⑶中任一種的抗體(1)具有由序列編號1的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號2的氨 基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號3的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、 由序列編號5的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號6的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號7的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(2)具有由序列編號9的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號10的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號11的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號13的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號14的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號15的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(3)具有由序列編號17的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號18的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號19的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號21的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號22的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號23的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(4)具有由序列編號25的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號26的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號27的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號29的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號30的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號31的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(5)具有由序列編號33的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號34的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號35的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號37的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號38的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號39的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(6)具有由序列編號41的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號42的
7胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號43的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號45的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號46的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號47的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(7)具有由序列編號49的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號50的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號51的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號53的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號54的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號55的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(8)具有由序列編號57的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號58的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號59的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號61的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號62的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號63的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體。[3]根據[2]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自所述⑴ ⑶中任一種的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(4)或(5)的抗體，第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體，進一步含有所述(7)或(8)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。[4]根據[2]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體，第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體。[5]根據[4]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，進一步含有所述(7)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。[6]根據[2]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體，第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(7)的抗體。[7]根據[6]所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，進一步含有所述(4)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。[8]根據[2] [7]任一項所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，所述(1)的抗體的重鏈可變區具有序列編號4的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號8的胺基酸序列，所述(2)的抗體的重鏈可變區具有序列編號12的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號16的胺基酸序列，所述(3)的抗體的重鏈可變區具有序列編號20的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號24的胺基酸序列，所述(4)的抗體的重鏈可變區具有序列編號28的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號32的胺基酸序列，所述(5)的抗體的重鏈可變區具有序列編號36的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號40的胺基酸序列，
所述(6)的抗體的重鏈可變區具有序列編號44的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號48的胺基酸序列，所述(7)的抗體的重鏈可變區具有序列編號52的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號56的胺基酸序列，所述(8)的抗體的重鏈可變區具有序列編號60的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號64的胺基酸序列。[9] 一種分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，其包含[2]規定的(1) (8)中任一 種的抗體。[10]根據[9]所述的分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，其中，所述(1)的抗體的重鏈可變區具有序列編號4的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號8的胺基酸序列，所述(2)的抗體的重鏈可變區具有序列編號12的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號16的胺基酸序列，所述(3)的抗體的重鏈可變區具有序列編號20的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號24的胺基酸序列，所述(4)的抗體的重鏈可變區具有序列編號28的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號32的胺基酸序列，所述(5)的抗體的重鏈可變區具有序列編號36的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號40的胺基酸序列，所述(6)的抗體的重鏈可變區具有序列編號44的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號48的胺基酸序列，所述(7)的抗體的重鏈可變區具有序列編號52的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號56的胺基酸序列，所述(8)的抗體的重鏈可變區具有序列編號60的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序 列編號64的胺基酸序列。[11] 一種分離的核酸分子，編碼[10]所述的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區。[12] 一種載體，保持[11]所述的核酸分子。[13] 一種轉化體，用[12]所述的載體進行轉化而得到的。[14] 一種人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的製備方法，其包含培養[13]所述的轉化體，生產人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序，回收培養上清液，由培養上清液純化人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序。(用語)為了方便說明，對於用於本說明書的用語的一部分，總結其定義如下所示。在本說明書中，用語「包含 」或「包含 而成」用作也包括「由 構成」的意思的 表達。因此，例如在記載「含有多個要素(構件)而構成的物質(或者方法)」時，作為其意 思，也當然可考慮為「由該多個要素(構件)構成的物質(或者方法)」。「分離」的意思是指，由其本來的環境(例如，為天然物質時是天然的環境)取出的 狀態，即，通過人為的操作，以與本來的存在狀態不同的狀體存在。
「分離的抗體」中不包括天然且未實施任何另外操作(人為操作)的抗體，即，不包 括在某個個體體內產生，在其中停留狀態的抗體。應予說明，分離的抗體典型的是不與其它 種類的抗體混合存在的狀態，即，單獨(作為同種抗體的集合)存在。對於「互補決定區(CDR)」，依據 kabat 等(參照 Sequences of Proteinsof Immunological Interest,4th edition US Department of Health andHuman Services (1987))的定義。「Α型肉毒桿菌毒素中和組合物」是指，含有多種抗體作為有效成分，對於A型肉毒 桿菌毒素表現出中和活性的藥學上的混合物。本發明中的「抗毒素效價」只要沒有特別提及，以國際單位表示。「抗毒素效價」 依據日本藥局法在醫藥品各條記錄的生物學製劑醫藥品中記載的「乾燥肉毒桿菌馬抗毒素 (乾燥肉毒桿菌抗毒素)」項3. 2. 7 「效價試驗」確定。在本說明書中，根據需要，依據習慣使用以下簡寫(括號內)。重鏈(H鏈)，輕鏈(L鏈)，重鏈可變區(VH)，輕鏈可變區(VL)，互補決定區 (CDR)，互補決定區1(⑶R1)，互補決定區2(⑶R2)，互補決定區3(⑶R3)，重鏈互補決定區 1(VH CDR1)，重鏈互補決定區2(VH CDR2)，重鏈互補決定區3 (VH CDR3)，輕鏈互補決定區 1 (VIXDRl)，輕鏈互補決定區2 (VL⑶R2)，輕鏈互補決定區3 (VL⑶R3)


圖1 抗體文庫的構成。圖2 在篩選實驗1取得的抗體的結合活性。將在對於無毒成分蛋白質的ELISA中 表現出ABS492 < 0. 2的克隆作為陽性克隆(箭頭)。圖3:以在篩選實驗1取得的抗體為樣本的中和試驗(動物實驗)的結果。表中 的符號(+、_等)表示症狀的強度。按士、+、++的順序症狀增強。圖4 在篩選試驗2採用的、表位遮蔽法的概要。圖5 在篩選實驗2取得的抗體的結合活性(圖5下(4th))和在篩選實驗3取得 的抗體的結合活性(圖5上(3rd-2))。圖6 在篩選試驗3取得的抗體的胺基酸序列的比對。由上方開始依次為BT-058 的VH序列(序列編號20)、BT-047的VH序列(序列編號12)、BT-015的VH序列序列編號 4)、BT-058的VL序歹Ij (序列編號24)、BT-047的VL序列(序列編號16)、BT-015的VL序 列(序列編號8)。圖7 在篩選實驗4取得的抗體的結合活性。將在此所示的全部的抗體克隆作為 陽性克隆。圖8 以在篩選實驗4取得的抗體為樣本的中和試驗(動物實驗)的結果。表中 的符號(+、++等)表示症狀的強度。按++、+++的順序症狀增強。d表示「小鼠死亡」。圖9 使用肉毒桿菌類毒素的篩選過程。圖10 在篩選實驗5取得的抗體的結合活性。圖11 在篩選實驗5取得的抗體的結合活性。圖12 在篩選實驗6取得的抗體的結合活性。圖13 在篩選實驗6取得的抗體的結合活性。
10
圖14:以在篩選實驗5和6取得的抗體為樣本的中和試驗(動物實驗)的結果。 表中的符號(+、++等)表示症狀的強度。按士、+、++、+++的順序症狀增強。d表示「小鼠
死亡」。圖15 使用神經毒素的篩選過程(神經毒素特異性抗體的濃縮)。圖16 在篩選實驗1 6取得的抗體的胺基酸序列的比對。由上方開始依次為 BT-175的VH序列(序列編號36)、NT_221的VH序列(序列編號28)、NT_320的VH序列(序 列編號44)、NT-539的VH序列(序列編號60) ,BT-015的VH序列(序列編號4)、NT_523的 VH序列(序列編號52)、NT-320的VL序列(序列編號48)、NT-539的VL序列(序列編號 64)、NT-221的VL序列(序列編號32)、BT_175的VL序列(序列編號40) ,BT-015的VL序 列(序列編號8)、NT-523的VL序列(序列編號56)。應予說明，與種系(Germline)的同 源性也一併表示。圖17 利用Biacorel的結合常數分析的結果(樣品為BT-015的Fab-PP型抗體)。圖18 利用Biacorel的結合常數分析的結果(樣品為BT-015的IgG型抗體)。圖19 利用Biacorel的結合常數分析的結果(樣品為BT-175的Fab-PP型抗體)。圖20 利用Biacorel的結合常數分析的結果(樣品為BT-175的IgG型抗體)。圖21 利用Biacorel的結合常數分析的結果(樣品為NT-221的Fab-PP型抗體)。圖22 利用Biacorel的結合常數分析的結果(樣品為NT-320的Fab-PP型抗體)。圖23 利用Biacorel的競爭實驗的結果(與BT-015的競爭)。表示BT-015與 NT-221 競爭。圖24:利用Biacorel的競爭實驗的結果(與BT-175的競爭)。表示BT-175與 NT-221 競爭。圖25:利用Biacorel的競爭實驗的結果(與NT-221的競爭)。由於NT-539在 250秒附近發生強噪音，因此刪除該區域。圖26 利用Biacorel的競爭實驗的結果(與NT-320的競爭)。圖27:利用Biacorel的競爭實驗的結果(與NT-523的競爭)。表示NT-523與 NT-539 競爭。圖 28 以 5 種抗體克隆(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523)為樣品的中和 試驗的結果。表中的符號(+、++等)表示症狀的強度。按+、++、+++的順序症狀增強。-表 示「未發現症狀」，d表示「小鼠死亡」。圖29 利用ELISA的抗體的表位分析和對於毒素亞型 A2毒素的反應性。更詳細地分析6種中和抗體(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523、 NT-539)的表位，另外，同時為了還確認對於作為其亞型的A2型的神經毒素(CHIBA-H)的反 應性，使用下述抗原實施ELISA。每個克隆以表形式表示0D492nm處的值。圖30 利用免疫印跡法的表位分析。對於神經毒素(NT)和重鏈C末端側的神經 細胞結合區域(He，大腸桿菌重組體蛋白質)，利用免疫印跡法進行表位分析，示出其結果。 對於各抗體克隆，稀釋到2種濃度(50 μ g/ml (實線的泳道)、5 μ g/ml (虛線的泳道))，使 其反應。確認NT-523為Hc區域的一級結構。另一方面，在該實驗中，對於其它抗體未檢出 條帶。圖31 利用免疫沉澱的表位分析。使用3種抗原(神經毒素、H鏈、L鏈)進行各克 隆的免疫沉澱，進行表位分析的結果。對照為直接將H鏈、L鏈進行上層電泳，使其與親和 純化的兔抗A型肉毒桿菌神經毒素抗體(稀釋1000倍)反應。BT-015、NT-523、NT-539識
11別H鏈(實線圓)、BT_175識別L鏈的可能性高(虛線圓)。另一方面，由該實驗不能判斷 NT-221、NT-320識別H鏈和L鏈中的哪一個。圖32 總結表位分析的結果，分類6種抗體的表位的表。綜合地判斷表位分析的 結果，在表的最下端總結抗體表位候補。應予說明，對於各克隆的結合性(表位候補)，與神 經毒素具有結合性時用NT表示，具有H鏈結合性時用H表示，與H鏈C末端側的神經細胞 結合區域具有結合性時用Hc表示，與L鏈具有結合性時用L表示。(-)表示不能判斷。
具體實施例方式本發明的第一方面涉及A型肉毒桿菌毒素中和組合物(以下，也稱為「本發明的組 合物」)。在本發明的組合物中，至少使用3種抗體。該3種抗體都是識別A型肉毒桿菌毒 素的人抗體。在本說明書中，該3種抗體稱為「第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體」、「第2人 抗A型肉毒桿菌毒素抗體」、「第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體」。此外，為了方便說明，以下 將「第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體」簡稱為「第1抗體」，將「第2人抗A型肉毒桿菌毒素 抗體」簡稱為「第2抗體」，將「第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體」簡稱為「第3抗體」。本發明人成功取得有效中和A型肉毒桿菌毒素的人抗體克隆(BT-015、BT-047、 BT-058、NT-221、BT-175、NT-320、NT-523、NT-539)(參照實施例欄)。另外，成功取得的抗 體克隆基於表位的異同，示出分類為4種。第1抗體為，對應於如果與其它抗體克隆組合使 用則表現出有效中和A型肉毒桿菌毒素的抗體克隆BT-015的抗體，抗體克隆BT-015的特 徵在於，即識別「具有由序列編號4的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號8的氨基 酸序列構成的輕鏈可變區的抗體」的表位。由於第1抗體的表位與抗體克隆BT-015的表位 一致，因此如果使第1抗體和抗體克隆BT-015同時與A型肉毒桿菌毒素反應，則發現競爭。 因此，作為第1抗體的適認性可以通過利用抗體克隆BT-015的競爭實驗進行確認。第2抗體為，對應於如果與其它抗體克隆組合使用則表現出有效中和A型肉毒杆 菌毒素的抗體克隆BT-175的抗體，抗體克隆BT-175的特徵在於，即識別「具有由序列編號 36的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號40的胺基酸序列構成的輕鏈可變區的抗 體」的表位。應予說明，對於作為第2抗體的適認性，可以與第1抗體的情況同樣地進行確 認。第3抗體為，對應於如果與抗體克隆BT-015和抗體克隆BT-175組合使用則表現 出有效中和A型肉毒桿菌毒素的抗體克隆(NT-320或NT-523)的抗體，抗體克隆NT-320的 特徵在於，即識別「具有由序列編號44的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號48的 胺基酸序列構成的輕鏈可變區的抗體」的表位，另外，抗體克隆NT-523的特徵在於，即識別 「具有由序列編號52的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號56的胺基酸序列構成 的輕鏈可變區的抗體」的表位。應予說明，對於作為第3抗體的適認性，可以與第1抗體的 情況同樣地進行確認。在本發明的一個方式中，第1抗體是選自下述(1) (3)中任一種的抗體。第2 抗體是下述⑷或(5)的抗體。第3抗體是選自下述(6) ⑶中任一種的抗體。(1)具有由序列編號1的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號2的氨 基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號3的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、 由序列編號5的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號6的胺基酸序列構成的輕
12鏈互補決定區2和由序列編號7的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(2)具有由序列編號9的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號10的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號11的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號13的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號14的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號15的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(3)具有由序列編號17的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號18的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號19的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號21的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號22的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號23的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(4)具有由序列編號25的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號26的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號27的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號29的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號30的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號31的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(5)具有由序列編號33的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號34的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號35的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號37的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號38的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號39的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(6)具有由序列編號41的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號42的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號43的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號45的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號46的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號47的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(7)具有由序列編號49的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號50的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號51的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號53的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號54的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號55的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(8)具有由序列編號57的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號58的 胺基酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號59的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區 3、由序列編號61的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號62的胺基酸序列構成 的輕鏈互補決定區2和由序列編號63的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體(1)對應於人抗體克隆BT-015，(2)對應於人抗體克隆BT-047，(3)對應於人抗體 克隆BT-058，(4)對應於人抗體克隆NT-221，(5)對應於人抗體克隆BT-175，(6)對應於人 抗體克隆NT-320，(7)對應於人抗體克隆NT-523，(8)對應於人抗體克隆NT-539。以下，表 示各克隆的序列信息。(BT-015)VH CDRl 序列編號 1VH CDR2 序列編號 2VH CDR3 序列編號 3VH:序列編號4VL CDRl 序列編號 5
(NT-320)VH CDRl 序列編號 41VH CDR2 序列編號 42VH CDR3 序列編號 43VH:序列編號44VL CDRl 序列編號 45VL CDR2 序列編號 46VL CDR3 序列編號 47VL:序列編號48(NT-523)VH CDRl 序列編號 49VH CDR2 序列編號 50VH CDR3 序列編號 51VH:序列編號52VL CDRl 序列編號 53VL CDR2 序列編號 54VL CDR3 序列編號 55VL:序列編號56(NT-539)VH CDRl 序列編號 57VH CDR2 序列編號 58VH CDR3 序列編號 59VH:序列編號60VL CDRl 序列編號 61VL CDR2 序列編號 62VL CDR3 序列編號 63VL 序列編號64在優選的一個方案中，(1)的抗體的重鏈可變區具有序列編號4的胺基酸序列，輕 鏈可變區具有序列編號8的胺基酸序列。對於(2)的抗體，重鏈可變區具有序列編號12的 胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編號16的胺基酸序列。對於(3)的抗體，重鏈可變區具 有序列編號20的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編號24的胺基酸序列。對於(4)的抗 體，重鏈可變區具有序列編號28的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編號32的胺基酸序 列。對於(5)的抗體，重鏈可變區具有序列編號36的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號40的胺基酸序列。對於(6)的抗體，重鏈可變區具有序列編號44的胺基酸序列，輕鏈可 變區具有序列編號48的胺基酸序列。對於(7)的抗體，重鏈可變區具有序列編號52的氨 基酸序列，輕鏈可變區具有序列編號56的胺基酸序列。對於(8)的抗體，重鏈可變區具有 序列編號60的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編號64的胺基酸序列。各抗體的來源、種類、級別、形態等沒有限定。優選的是，作為完全人IgG抗體而調 制各抗體。此時，規定區域的種類沒有特別限定。即，重鏈不限定於 鏈，還可以是μ鏈、α鏈或ε鏈。同樣地，輕鏈可以是κ鏈，也可以是λ鏈。可以調製各抗體作為？313、？313，、？(313，)2、80 ￥或(18 ￥抗體等的抗體片段。Fab 是通過將IgG抗體在半胱氨酸存在下進行木瓜蛋白酶消化而得到的，由L鏈和H鏈可變區 以及由CHl區和鉸鏈部的一部分構成的H鏈片段構成的分子量約5萬的片段。如果有期望 的IgG抗體，可以通過將其進行木瓜蛋白酶消化得到Fab。另外，還可以將編碼H鏈的一部 分和L鏈的DNA重組入適當的載體，使用該載體通過轉化了的轉化體調製Fab。Fab'是通過將後述的F(ab』)2的H鏈間的二硫鍵切斷而得到的分子量約為5萬 的片段。如果有期望的IgG抗體，可以通過將其進行胃蛋白酶消化，使用還原劑切斷二硫鍵 而得到Fab，。另外，與Fab相同地，還可以使用編碼Fab』的DNA進行基因工程上的調製。F(ab' )2是將IgG抗體進行胃蛋白酶消化而得到的，由L鏈和H鏈可變區以及由 CHl區和鉸鏈部的一部分構成的H鏈片段構成的片段(Fab』 )以二硫鍵結合的分子量約10 萬的片段。如果有期望的IgG抗體，可以通過將其進行胃蛋白酶消化得到F(ab』)2。另外， 與Fab相同地，還可以使用編碼F(ab，)2的DNA進行基因工程上的調製。scFv是將由H鏈可變區和L鏈可變區構成的Fv通過將一方的鏈的C末端與另一 方的N末端以適當的連接肽連接而單鏈化的抗體片段。作為連接肽，例如可以使用柔軟性 高的(GGGGS) 3等。例如，可以使用編碼H鏈可變區和L鏈可變區的DNA和編碼連接肽的DNA 構建編碼scFv抗體的DNA，將其重組入適當的載體，使用該載體通過轉化了的轉化體調製 scFv。dsFv是在H鏈可變區和L鏈可變區的適當位置引入Cys殘基，通過二硫鍵使H鏈 可變區和L鏈可變區穩定化的Fv片段。在各鏈中的Cys殘基的導入位置可以基於利用分 子模型預測的立體結構而確定。例如，可以由H鏈可變區和L鏈可變區的胺基酸序列預測 立體結構，基於所述立體結構，構建分別編碼導入了變異的H鏈可變區和L鏈可變區的DNA， 將其重組入適當的載體，並且使用該載體通過轉化了的轉化體調製dsFv。其中，在本發明的組合物中，作為優選的抗體組合，可以列舉以下的組合。該組合 對應於在後述的實施例所示的中和試驗中發現非常高的中和活性的組合。第1抗體⑴的抗體第2抗體(5)的抗體第3抗體(6)的抗體在採用上述組合時，優選並用(7)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體(第 4抗體)。這樣得到的4種抗體的組合對應於在後述的實施例所示的中和試驗中發現最高 的中和活性的抗體的組合。優選的抗體組合的其它例子如下所示。該組合對應於在後述的實施例所示的中和 試驗中發現非常高的中和活性的組合。第1抗體⑴的抗體第2抗體(5)的抗體第3抗體(7)的抗體應予說明，在有效成分的抗體限於3種時，在A型毒素中，對於其亞種的A2毒素， 優選使用保持比(7)更強的結合性的(8)抗體作為上述第3抗體。在採用上述組合時，優選並用(4)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體(第4抗體)。並用4種抗體時的組合不限於上述的兩個例子。以下，表示並用4種抗體時的優 選的組合。第1抗體選自(1) (3)中任一種的抗體第2抗體⑷或(5)的抗體第3抗體(6)的抗體第4抗體(7)或(8)的抗體(1) ⑶的抗體用作對於A型肉毒桿菌毒素表現出高中和活性的組合物的有效 成分，其自身具有高效價。因此，作為本發明的第2方面，提供包含(1) (8)任一項的抗 體的A型肉毒桿菌毒素中和抗體。另外，作為本發明的第3方面，提供編碼該抗體的重鏈可 變區和/或輕鏈可變區的、分離的核酸分子。以下，示出對應於⑴ ⑶的抗體克隆的鹼 基序列(重鏈可變區和輕鏈可變區)。(BT-015)VH 序列編號65VL 序列編號66(BT-047)VH:序列編號67VL 序列編號68(BT-058)VH 序列編號69VL 序列編號70(NT-221)VH 序列編號71VL 序列編號72(BT-175)VH 序列編號73VL:序列編號74(NT-320)VH 序列編號75VL 序列編號76(NT-523)VH 序列編號77VL 序列編號78(NT-539)VH 序列編號79VL 序列編號80應予說明，即使對於作為A型的亞種的A2毒素，上述各(1) (8)的抗體也可以 保持強結合性，形成表現出強中和活性的組合物的有效成分。本發明的抗體((1) (8)的抗體)可以以基因工程的方法以各抗體克隆序列信
17息為基礎進行調製。即，典型的是，可以通過一系列工序調製本發明的抗體，該一系列工序 包括編碼目的抗體的基因表達構建物的調製、利用適當表達體系的表達和表達產物的回 收。表達體系沒有特別限定。即，只要使目的重組抗體得到表達，可以使用任意的表達 體系。其中，使IgG型的重組抗體表達時，可以使用利用動物細胞的表達體系。另外，使源 自可變區的Fab、Fab，、F(ab，)2、scFv或dsFv等的抗體片段表達時，除了動物細胞之外，還 可以使用利用大腸桿菌、酵母等微生物的表達體系。根據使用的宿主，可以使用適當的表達 載體。如果利用信號肽，可以使目的重組抗體分泌到細胞外，輸送至周質區域，或在細胞內 儲留。以下，對於最一般的利用動物細胞的表達方法，進行詳細敘述。首先，將編碼目的 抗體的重鏈可變區(VH)的DNA通過化學合成、生化切斷/再結合等進行製作。將得到的編 碼H鏈可變區的DNA與編碼人H鏈規定區域的DNA進行連接，重組入表達用載體，得到H鏈 表達載體。用同樣的方法製作L鍊表達載體。應予說明，在夾著CDR區域而存在的FR(框 架區域)中，還可以使用導入了若干變異的可變區。即，由於CDR區域全部相同的抗體識別 相同的表位，因此最終得到的抗體識別A型肉毒桿菌毒素，只要表現出充分的結合活性，可 以改變FR。其中，如果胺基酸序列明確，則可以預測可變區的立體結構(空間配置)，還 可以預測對FR施加特定的改變引起的立體結構的變化。另外，還可以利用電腦程式 ENCAD (Energy Calculation and Dynamics)，構建可變區的分子模型，或者可以確定為了與 ⑶R潛在地相互作用而充分接近的、FR中的胺基酸等(例如，參照W097/002290)。另外，還 可以利用定量地評價各胺基酸殘基是否處於適當的環境中的電腦程式Verify-3D、免疫 球蛋白專用的模型方法(WAM-ffeb Antibody Modeling 或 OxfordMoleclelar 公司的 AbM) 等。可變區的變異的最優化可以通過利用隨機PCR、噬菌體呈現法等常規的操作進行。(參 照 Manuel B, et al J. Biol ChemVo1. 272 no. 16 10678 "Antibody humaniζation using monovalent pagedisplay，，、W02007/094754 等)。所改變的胺基酸的數量優選為FR全體的15%以下，進一步優選為FR全體的10% 以下，進一步更優選為FR全體的5%以下，最優選為FR全體的1 %以下。「表達載體」是指，可以將插入其的核酸導入目的細胞(目標細胞)內，且在該細胞 內使其表達的核酸性分子，包括病毒載體和非病毒載體。使用病毒載體的基因導入法巧妙 地利用病毒對細胞的感染現象，得到高基因導入效率。作為病毒載體，可以示例SV40virUS based載體、EB virusbased載體、BPV(牛乳頭瘤病毒)based載體等，但不限定於這些。 作為非病毒載體，開發有脂質體、正電荷型脂質體(Feigner, P. L.，Gadek, T. R.，Holm, Μ. et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. ,84 7413-7417,1987) 、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan) -月旨質體(Dzau, V. J. , Mann, Μ. , Morishita, R. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci.， 93 :11421-11425，1996、Kaneda, Y. ， Saeki, Y. Morishita, R. ， Molecular Med. Today, 5 298-303,1999)等。表達載體還可以構建為這樣的非病毒載體。作為在表達載體中所含的啟動子，利用SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、巨細 胞病毒啟動子、雞β肌動蛋白啟動子等。準備H鍊表達載體和L鍊表達載體後，使用它們對宿主細胞進行共轉化。作為宿主
18細胞，優選使用CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)(A. ffright&S. L. Morrison, J. Immunol. 160， 3393-3402 (1998))、SP2/0 細胞(小鼠骨髓瘤)(K. Motmans et al. ,Eur. J. Cancer Prev. 5, 512-519(1996)，R. P. Junghans et al.，Cancer Res. 50，1495-1502 (1990))等。在轉化中 優選使用脂質體轉染法(R. W. Malone et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,6077(1989), P. L. Feigner et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84，7413 (1987)、電穿孔法、磷酸鈣法 (F. L. Graham&A. J. van der Eb, Virology52,456-467 (1973)) > DEAE-Dextran 法等。對H鍊表達載體和L鍊表達載體的比例、導入的時機等沒有特別地限定。兩載體 的比例(H鍊表達載體L鍊表達載體(摩爾比))例如為1 0.5 5，優選為1 0.8 1.2。對於導入的時機，可以將H鍊表達載體和L鍊表達載體同時導入宿主細胞，還可以首 先導入任一種。另外，如上所述，還可以不分別構建H鍊表達載體和L鍊表達載體，而構建 重組了編碼VH的DNA和編碼VL的DNA兩者的表達載體，用該表達載體對宿主細胞進行轉 化。作為用於轉化體的選擇的標記(選擇標記)，可以利用氨基糖苷-3』-磷酸轉移酶 (neo)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因、嘌呤黴素耐性酶基因、穀氨醯胺合成酶(GS)基因 等一般的標記基因(例如參照MichaelKriegler著、加藤鬱之進監譯、實驗室手冊動物細胞 的基因工程、寶酒造(1994))。通過轉化體的細胞內或培養液回收(分離、純化)抗體。抗體的回收依照常規方 法即可。即，利用離心分離、硫酸銨分級、鹽析、超濾、親和層析(使用蛋白質A樹脂、蛋白質 G樹脂等)、離子交換層析、凝膠過濾層析等，回收抗體。如上得到的抗體用作本發明的組合物的有效成分。構成本發明的組合物時的製劑 化依照常規方法即可。在製劑化時，可以含有製劑上容許的其它成分(例如，載體、賦型劑、 崩解劑、緩衝劑、乳化劑、懸濁劑、去痛劑、穩定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等)。作為賦型 劑，可以列舉水、生理食鹽水溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液、各種緩衝液(磷酸緩衝液、重 碳酸鹽緩衝液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝液等)、乳糖、澱粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白 糖等。作為崩解劑，可以使用澱粉、羧甲基纖維素、碳酸鈣等。作為緩衝劑，可以使用磷酸鹽、 檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為乳化劑，可以使用阿拉伯樹膠、海藻酸鈉、黃蓍膠等。作為懸濁劑， 可以使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、十二烷 基硫酸鈉等。作為去痛劑，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作為穩定劑，可以使用丙二 醇、亞硫酸二乙酯、抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨、苄醇、氯丁醇、對羥 基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。進行製劑化時的劑型也沒有特別限定，但優選注射劑、外用劑或栓劑等有即效性 的製劑處方。作為有效成分的各抗體的混合比沒有特別限定，但典型的是，使各抗體的存在量 相同(每種等摩爾混合)。應予說明，對於本領域技術人員來說，通過與後述的實施例所示 的中和試驗相同的試驗，可以使混合比最優化。另外，各抗體的級別或形態等是任意的。因此，本發明的組合物可以以不同級別的 抗體混合的狀態，或者不同形態的抗體混合的狀態而構成。優選本發明的組合物中的抗體濃度在參考最終的給藥形態和給藥方案後，反向計 算而確定。
本發明的組合物的狀態也沒有特別限定。例如，將本發明的組合物調製為液狀或 乾燥狀態(優選凍幹狀態)。例如，在凍幹時，可以在調整濃度後進行凍幹，以使在用溶劑溶 解後的最終ImL中作為有效成分的抗毒素效價為500單位以上。應予說明，依照在日本藥局 法醫藥品各條記錄的生物學製劑醫藥品中記載的「乾燥肉毒桿菌馬抗毒素(乾燥肉毒桿菌 毒素)」的項5. 2 「小容器的含有單位數」，優選使小容器的含有單位數為抗毒素效價10000 單位以上。本發明的組合物典型的是用於肉毒桿菌中毒疾病的治療和預防。本發明的組合物 根據其形態，通過口服給藥或非口服給藥(靜脈內、動脈內、皮下、肌肉、腹腔內注射、直接 導入目標細胞等)用於對象(患者)。本發明的組合物的給藥量根據症狀、患者年齡、性別以及體重等而異，但本領域技 術人員可以設定適宜的適當給藥量。例如，以成人(體重約60kg)為對象可以進行適當設 定，以使每一次的抗毒素的給藥量為10000單位 100000單位。在給藥量、方案的設定中， 可以以馬抗毒素時的使用量、方案(日醫雜誌第128卷，第1號/平成14(2002)年7月1 日)為參考，參照本發明的組合物和馬抗毒素的相對效價，考慮患者的病症、效果的持續時 間等。為了使其適用於國際使用，優選以國際標準評價本發明的組合物的抗毒素效價。 以日本藥局方在醫藥品各條記錄的生物學製劑醫藥品中記載的「乾燥肉毒桿菌馬抗毒素 (乾燥肉毒桿菌抗毒素)」項、詳細為生物學製劑基準的「乾燥肉毒桿菌馬抗毒素」3. 2. 7 「效 價試驗」為基準進行檢測，就可以算出基於國際標準的抗毒素效價。實施例1.肉毒桿菌類毒素免疫抗體文庫的製作1-1.肉毒桿菌類毒素對人志願者的接種培養各A、B、E和F型菌，以純化得到的毒素而得到的毒素為材料，進行類毒素的 調製。特別是A型為，將用作現在治療用毒素的由肉毒桿菌97株(C. botulinum 97)或 62A株(C. botulinum 62A)產生的神經毒素依據在B型神經毒素中進行的方法(Infect. Immun. 18 :761_766，1977)進行純化。純化的各型毒素用福馬林使其失活，與鋁佐劑混合 得到沉澱ABEF型多元混合類毒素。以該多元類毒素為基礎免疫，以3 4周間隔皮下注射 0. 5mL 3次，進一步約12個月後皮下注射0.5mL 1次。進一步10年後，20年後追加注射， 進一步在以下的成分採血時約3周前注射相同量。1-2.抗體文庫的製作由接種了 ABEF型肉毒桿菌類毒素人通過成分採血採取相當於3升血液的單核細 胞成分血(約50ml)。用PBS稀釋2倍，回收血細胞後，以IOml/試管分裝的Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare Bioscience)上重層，在400g、RT、30分鐘的條件下進行離心處理，只 對單核細胞部分再純化，分離1. 8 X IO9細胞。使用0. 9 X IO9細胞進行總RNA的提取(RNA ExtractionKit =Amersham)，回收 1. 89mg。使用隨機引物調製 cDNA 後(Super ScriptII Invitrogen)，使用對抗體的H鏈(VH)特異性的引物組(參照下述)和對抗體的L鏈(VLCL κ鏈、λ鏈)特異性的引物組(參照下述)，擴增目的抗體基因。H鏈重組入pscFvCA-ESVHd 載體(利用Sfil-Xhol)，L鏈重組入噬菌粒載體(pFCAH9-E8d:參照再表01/062907，利用 SfiI-AscI)，得到H鏈文庫、κ鏈文庫和λ鏈文庫。文庫的大小是，H鏈文庫為7. 05X 109，κ鏈文庫為5. 87X 108，λ鏈文庫為5. 05Χ108。(1)對VH特異性的引物組人抗體重鏈基因的取得用5』末端側引物(VHl VH7)和3』末端側引物(將human JH引物4種(697 700)等量混合的引物)用於各VH家族的擴增的引物人VH引物(SfiI位點用下劃線表示)628hVHla (序列編號 81)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG629hVH2a (序列編號 82)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG630hVH3a (序列編號 83)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG631hVH4a (序列編號 84)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG632hVH5a (序列編號邪)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC633hVH6a (序列編號邠)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG629-2hVH2a-2 (序列編號 87)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC631-2hVH4a-2 (序列編號 88)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG632-2hVH5a-2 (序列編號 89)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG712hVH7 (序列編號 90)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT人JH引物(BstPI，XhoI位點用下劃線表示)697hJHl-2 (序列編號 91)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC698hJH3 (序列編號 92)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC699hJH4-5 (序列編號 93)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC700hJH6 (序列編號 94)GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC(2)對L鏈(VLCL :κ鏈、λ鏈)特異性的引物組輕鏈基因取得用VL的在5』側芳基化的引物(κ 1 κ 6、λ 1 λ 6)和在Ck、 CX的3』側芳基化的引物(hCKASC引物或hCLASC引物)L 鏈(VLCL κ 鏈、λ 鏈)
21
5，-引物 κ 1 κ 6hVKla (序列編號 95)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCChVK2a (序列編號 96)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTTGTGATGACTCAGTCTCChVK3a (序列編號 97)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCChVK4a (序列編號 98)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCChVK5a (序列編號 99)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAACGACACTCACGCAGTCTCChVK6a (序列編號 100)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC5，-引物 λ 1 λ 6hVLl (序列編號 101)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCChVL2(序列編號 102)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGChVL3a (序列編號 103)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCCTATGTGCTGACTCAGCCACChVL3b (序列編號 104)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCChVL4(序列編號 105)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCACGTTATACTGACTCAACCGCChVL5(序列編號 106)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGCChVL6(序列編號 107)GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA3，-引物 hCKASC(序列編號 108)TCGACTGGCGCGCCGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG3，-引物 HCLASC(序列編號 109)TCGACTGGCGCGCCGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC由H鏈文庫用HindIII、XhoI切出H鏈基因，重組入將κ鏈文庫和λ鏈文庫等摩 爾混合而製作的L鏈文庫，最終得到文庫大小為1.3Χ IOltl的抗肉毒桿菌毒素篩選用Fab型 抗體文庫(圖1)。認為抗體的種類由VH的CDR3的多樣性而產生，此次製作的巨大的抗體 文庫充分覆蓋分離的抗體基因的多樣性。2.使用A型肉毒桿菌類毒素和肉毒桿菌毒素的無毒成分蛋白質的抗體文庫的篩 選2-1.篩選實驗1
(1)特異性克隆的選擇、回收為了取得中和抗體，理想的是篩選在具有神經毒的活性的神經毒素部位結合的抗 體。但是，對獻血志願者免疫毒素全長製作的類毒素，與無毒成分蛋白質結合的抗體(在此 時不需要的抗體)也在體內產生。另外，取得具有神經毒的活性的神經毒素也是受限制的。 因此，採用以下的篩選策略最初使無毒成分蛋白質和人抗體文庫反應，將不需要的抗體吸 收至無毒成分蛋白質後，回收反應上清液，接著使肉毒桿菌類毒素與未吸收至無毒成分蛋 白質的人抗體文庫反應。首先，在微型杯(Nunc公司制，Maxisorp) 6孔分別分裝用PBS調製至10 μ g/ml 的濃度的肉毒桿菌類毒素和無毒成分蛋白質各100μ 1，在4°C反應過夜並固相化。除去溶 液後，分別分裝BSA/PBS各200μ 1，在37°C下進行1小時封閉。將製作的人抗體文庫 1.0X IO13克隆當量首先分裝(130μ1/孔)入最初將無毒成分蛋白質固相化的微型杯，在 37°C下反應2小時。之後，回收反應上清液重新分裝入將肉毒桿菌類毒素固相化的微型杯， 在37°C下反應2小時。反應完畢後，除去反應液，用PBS洗淨5次。分裝0. IM HCl (溶解甘 氨酸調製為PH2. 2) 100 μ 1/孔，在室溫下反應15分鐘，回收與抗原結合了噬菌體抗體。將其對OD 0. 5的大腸桿菌DH12S 20ml進行1小時感染，添加至60ml的SBGA培養 基(在 SB 培養基(將 MOPS IOg,Typtone 3Og 和 Yeast Extract2Og 溶解，用 3N NaOH 調節 至PH7後，使最終溶液量為1升)作為最終濃度添加125 μ g/ml氨苄青黴素硫酸鹽和0. 5% glucose)，在37°C下培養2小時後，添加至500ml的SBA培養基進一步在37°C下培養2小 時。接著，添加IX IO12當量的輔助噬菌體K07，在37°C下培養2小時後，添加卡那黴素以使 終濃度為50μ g/ml，在30°C下培養18小時。將其以8000rpm進行10分鐘離心處理，回收 上清液，在其中混合IlOml的PEG液(20%聚乙二醇6000，2. 5M NaCl)充分攪拌混合後，以 8500rpm進行15分鐘離心處理，使噬菌體沉澱。將其在2. 5ml的PBS中懸濁，使用其一部分 研究大腸桿菌感染數。這樣，得到第一次(1st)篩選的噬菌體(第一次噬菌體)。第二次(2nd)篩選為，除了使用第一次噬菌體400 μ 1和使PBS洗淨次數為20次 以外，在與第一次篩選相同的條件下實施。第三次(3rd)篩選為，除了使用第二次噬菌體 400μ1以外，在與第二次篩選相同的條件下實施。在第三次篩選後，提取46克隆。(2)抗體克隆的鹼基序列確定將通過篩選得到的大腸桿菌稀釋，撒在添加了氨苄青黴素(100μ g/ml)的普通瓊 脂培養基上。挑取得到的菌落(相當於上述(1)的46克隆)，以2xYTGA培養基在30°C下 培養過夜後，以PI_50(倉敷紡織株式會社)提取DNA，用雙脫氧法確定鹼基序列。(3)各抗體克隆的cp3融合蛋白質的表達、調製將通過篩選得到的大腸桿菌稀釋，撒在添加了氨苄青黴素(100μ g/ml)的普通瓊 脂培養基上。挑取得到的菌落(相當於上述(1)的46克隆)，以2xYTGA培養基在30°C下 培養過夜後，將20 μ 1接種至2ml的0. 05%葡萄糖2xYTA(2xYT，100 μ g/ml氨苄青黴素硫 酸鹽，0.05%葡萄糖)。在30°C下培養3小時後，添加IM IPTG20y 1，進一步培養20小時。 接著，以微量離心機以15000rpm離心處理5分鐘，回收上清液。在上清液中含有各抗體克 隆的cp3融合蛋白質。使用該上清液進行與類毒素、無毒成分的ELISA。(4)與肉毒桿菌類毒素以及無毒成分的ELISA反應以使用肉毒桿菌類毒素以及無毒成分蛋白質的ELISA判定抗體的結合能力。只與
23肉毒桿菌類毒素反應的抗體是分離目的的抗體(即中和抗體)。首先，在微型杯(Nunc公司制，Maxisorp)分別分裝用PBS調製至10 μ g/ml的濃度 的肉毒桿菌類毒素和無毒成分蛋白質各ΙΟΟμΙ，在4°C反應過夜並固相化。除去溶液後，分 別分裝1%BSA/PBS各200μ1，在37°C下進行1小時封閉。分裝在(3)得到的上清液(含 有抗體的cp3融合蛋白質)各100μ 1，在37°C下反應1小時。除去溶液後，用PBS洗淨， 將用PBS稀釋為2. 5 μ g/ml的兔抗cp3抗體(MBL)在37°C下反應1小時。除去溶液後，用 PBS洗淨，將用PBS稀釋10000倍的HRP標記山羊抗兔IgG抗體(MBL)在37°C下反應1小 時。除去溶液後，用PBS洗淨，在室溫下使100 μ 1的OPD液反應5分鐘。以2Ν硫酸使反應 停止，以 SPECTRAmax340PC(Molecular Devices)測定 492nm 處的吸光度。如上所述，研究在(1)回收的46克隆的結合能力的結果為，40克隆(作為胺基酸 序列不同的為22種)對於肉毒桿菌類毒素表現出反應性。另外，對於肉毒桿菌毒素的無毒 成分蛋白質，19種反應。(5)抗體蛋白質的調製另一方面，在以上述肉毒桿菌類毒素為抗原的篩選中得到的抗體中，對於肉毒杆 菌毒素的無毒成分蛋白質不表現出反應性，而與肉毒桿菌類毒素反應的抗體有3種(圖2)。 應予說明，以對於無毒成分蛋白質的ABS <0.2為判定標準。用箭頭表示的BT-015、37、39、 44中，BT-037和與無毒成分蛋白質反應的BT-014的胺基酸序列相同)。以限制酶SalI將 這些噬菌粒DNA消化後，使其自身再結合，轉變為ProteinA融合抗體(Fab-pp型抗體)，使 用其對DH12S進行轉化。轉化後，以25ml的2xYTGA在30°C下培養過夜。將該培養液20ml 與2升的2xYTA混合培養3小時後，添加2ml的IM IPTG，在30°C下培養20小時。將培養 液在4°C、8000rpm條件下進行10分鐘的離心處理，回收上清液。在回收的上清液中緩慢加 入1122g的硫酸銨，在室溫下攪拌混合1小時後，在4°C、8500rpm條件下進行30分鐘的離 心處理。將沉渣放入100ml的加有Complete (Roche公司制)的PBS中懸濁。接著，對於 PBS，在4°C下透析過夜後，在4°C、IOOOOrpm條件下進行10分鐘的離心處理。回收上清液， 將其添加至填充了 3ml的IgG瓊脂糖(GE Healthcare Bioscience)的柱，在室溫下以自然 滴下的方式使其通過柱內。用300ml的PBS洗淨柱後，用6ml的0. 2M甘氨酸(pH3)、3ml的 0. 2M甘氨酸(pH2. 5) UOml的0. 2M甘氨酸(pH3)洗脫。將洗脫液分別以2M Tris調節pH 至7. 0後，裝入透析濃縮用管中(Millipore公司制，Amicon Ultra-15，4°C、轉速5530rpm)， 對PBS進行透析，濃縮。之後進行SDS-PAGE，算出蛋白質濃度。(6)利用動物試驗的抗體評價通過將分離、調製的Fab-pp型抗體與毒素混合皮下給藥後，觀察小鼠的麻痺等 的症狀這樣的半定量試驗法，評價各抗體的中和能力。方法以參考文獻(MTakahashi et al. , International Journal of Food Microbiology,11,271-278,1990. Jpn. J. Med. Sci. Biol. ,43. 163-170,1990)為標準。作為比較對照，將A型肉毒桿菌毒素抗毒素日本標準品 (10單位/ml)稀釋10倍，得到作為儲備溶液的抗毒素原液(1單位/ml)，進一步調製將其 用PBS進行每次3倍的6步稀釋而得到的的溶液(以下，稱為「標準稀釋」)。另一方面，將 在(5)得到的抗體溶液用PBS稀釋5倍製成抗體原液，進一步進行每次5倍的4步稀釋，得 到樣本(以下稱為「樣本稀釋液」)。另外，將肉毒桿菌神經毒素(3. 8 X 105LD50/ml)稀釋400倍得到儲備溶液
24(950LD50/ml)，進一步稀釋500倍製作試驗毒素(1. 9LD50/ml)。準確量取試驗毒素0. 25ml、 各標準稀釋以及樣本稀釋液0. 25ml，充分混合在室溫下反應1小時後，對1組2隻的小鼠進 行每隻0. 2ml的皮下接種，觀察3天。根據試驗組的小鼠的臨床症狀(完全緩解、麻痺的程 度)，判定樣本的效價。結果，BT-015表現出中和能力(圖3)。2-2.篩選實驗2在篩選實驗1取得的抗體中，用以下的方法調製混合了判斷為陰性(與無毒素部 位也反應的抗體)的19克隆的抗體蛋白質的抗體。首先，將該19克隆的DNA混合，以限制酶SalI消化後，使其自身再結合，轉變為 Fab-pp型抗體，使用其對DH12S進行轉化。轉化後，以IOOml的2xYTGA在30°C下培養過 夜。將該培養液40ml與4升的2xYTA混合培養3小時後，添加4ml的IM IPTG，在30°C下 培養20小時。將培養液在4°C、8000rpm條件下進行10分鐘的離心處理，回收上清液。在 回收的上清液中緩慢加入2244g的硫酸銨，在室溫下攪拌混合1小時後，在4°C、8500rpm條 件下進行30分鐘的離心處理。將沉渣放入200ml的加有Complete (Roche公司制)的PBS 中懸濁。接著，對於PBS，在4°C下透析過夜後，在4°C、IOOOOrpm條件下進行10分鐘的離心 處理。回收上清液，將其添加至填充了 3ml的IgG瓊脂糖(GE Healthcare Bioscience)的 柱，在室溫下以自然滴下的方式使其通過柱內。用500ml的PBS洗淨柱後，用6ml的0. 2M甘 氨酸(PH3)、3ml的0. 2M甘氨酸(pH2. 5) UOml的0. 2M甘氨酸(pH3)洗脫。將洗脫液分別 以2M Tris調節pH至7.0後，裝入透析濃縮用管中(Millipore公司制，Amicon Ultra-15， 4°C、轉速5530rpm)，對PBS進行透析，濃縮。之後進行SDS-PAGE，算出蛋白質濃度。將以上的方法調製的抗體混合蛋白質以230μ g/ml添加來遮蔽抗原後(參照圖 4)，用與篩選實驗1相同的方法實施篩選。結果，回收46克隆。用ELISA分析各抗體克隆， 結果可知類毒素特異性反應的新型抗體克隆含有27種。這樣，通過將抗原遮蔽，大幅減少 與無毒素部位反應的抗體(2/46)，提高篩選效率(圖5下方(第四次(4th)))。2-3.篩選實驗3由於在篩選實驗1的第三次篩選中判斷為陰性的克隆數多，因此認為在該階段已 經產生偏差，中和抗體的存在比例降低。因此，使用篩選中途階段的第二次篩選後的噬菌體 抗體(第二次噬菌體)，實施篩選(第三次_2)。首先，在微型杯(Nunc公司制，MaXiS0rp)6 孔分別分裝用PBS調製至10 μ g/ml的濃度的肉毒桿菌類毒素100μ 1，在4°C反應過夜並固 相化。除去溶液後，分別分裝1%BSA/PBS 200μ1，在37°C下進行1小時封閉。除去封閉溶 液後，以30μ g/孔分裝在2-2.調製的抗體混合蛋白質，在37°C下反應1小時來遮蔽抗原。 除去抗體蛋白質溶液後，將第二次噬菌體3. 6X IO13當量和在2-2.調製的抗體混合蛋白質 180 μ g混合後，分裝入微型杯，在37°C下反應2小時。以後的操作與上述篩選實驗1相同。最後挑取46克隆，用ELISA確認它們的結合能力。結果，類毒素特異性反應的新 型抗體克隆有20種。通過將抗原遮蔽，大幅減少與無毒素部位反應的抗體(1/46)，提高篩 選效率(圖5上方(第三次-2))。由這些各抗體克隆調製抗體蛋白質，實施毒素的中和試驗。結果，兩個克隆 (BT-058、BT-047)表現出中和活性，但它們的H鏈的胺基酸序列與在篩選實驗1取得的克 隆BT-015的H鏈的胺基酸序列基本相同(圖6)。因此，認為這3個克隆的表位相同。2-4.篩選實驗4(同時實施利用抗體群共存的群體排除和利用抗體共存的相同克隆排除)通過使判斷為陰性的抗體與篩選系共存，進行改善，以有效地取得類毒素特異性 抗體克隆，但只能取得與在篩選實驗1取得的抗體克隆BT-015相同或類似的抗體克隆。因 此，為了取得新型抗體克隆，採取以下的策略除了判斷為陰性的抗體克隆19種的抗體蛋 白質以外，也使抗體克隆BT-015的抗體蛋白質共存，由此遮蔽這些抗體克隆的表位(第四 次_2篩選)。首先，在微型杯6孔分別分裝用PBS調製至10 μ g/ml的濃度的肉毒桿菌類毒素 100μ 1，在4°C反應過夜並固相化。除去溶液後，分別分裝1%BSA/PBS 200 μ 1，在37°C下進 行1小時封閉。除去封閉溶液後，分裝在2-2.調製的抗體混合蛋白質和由抗體克隆BT-015 調製的抗體蛋白質(各自30yg/孔)，在37°C下反應1小時來遮蔽抗原。除去抗體蛋白質 溶液後，將在篩選實驗3得到的噬菌體(第三次-2噬菌體)7. 2X IO12當量和在2-2.調製 的抗體混合蛋白質180 μ g以及由抗體克隆BT-015調製的抗體蛋白質180 μ g混合後，分裝 入微型杯，在37°C下反應2小時。以後的操作與上述篩選實驗1相同。挑取94克隆，用ELISA確認它們的結合能力，全都與類毒素特異性反應(圖7)。 在這些克隆中，具有新型胺基酸序列的克隆有26種。另外，不含有與抗體克隆BT-015相同 或類似的抗體。應予說明，以上的篩選過程如圖9所示。接著，通過觀察與毒素混合進行皮下給藥時小鼠的生死、麻痺等的症狀這樣的簡 易的試驗方法，評價各抗體克隆的中和能力。具體的試驗方法以參考文獻(日本生物學制 劑基準厚生勞動省)為標準。在試驗中，使用由各抗體克隆調製的Fab-pp型抗體。作為比 較對照，將A型肉毒桿菌毒素抗毒素日本標準品(10單位/ml)稀釋10倍，得到作為儲備溶 液的抗毒素原液(1單位/ml)，將其用PBS稀釋調製成0. 1單位的溶液進一步調製進行每次 2倍的5步稀釋的溶液(以下，稱為「標準稀釋」)。樣本直接使用調製的原液。將肉毒桿菌神經毒素稀釋400倍，得到儲備溶液(950LD50/ml)，進一步稀釋10倍， 製作試驗毒素(95LD50/ml)。準確量取試驗毒素0. 25ml和各標準稀釋以及樣本0. 25ml，充 分混合在室溫下反應1小時後，對1組2隻的小鼠進行每隻0. 2ml的皮下接種，觀察4天。 根據試驗組的小鼠的臨床症狀(完全緩解、麻痺的程度)，判定樣本的效價。結果，抗體克隆 BT-175表現出中和能力(圖8)。2-5.篩選實驗5 (使用A型肉毒桿菌神經毒素的篩選)由肉毒桿菌 62A 株，依照文獻 INFECTION AND IMMUNITY, Vol. 12，No. 6Dec. 1975， p. 1262-1270，由純化的肉毒桿菌毒素除去無毒成分蛋白質，純化調製的神經毒素(毒素的 活性中心150kDa)。實施以其為抗原的篩選，嘗試取得識別與抗體克隆BT-015、BT-175不 同的表位的中和抗體。首先，在微型杯6孔分別分裝用PBS調製至10 μ g/ml的濃度的肉毒桿菌神經毒素 100 μ 1，在4°C反應過夜並固相化。除去溶液後，分別分裝BSA/PBS 20(^1，在371下 進行1小時封閉。除去封閉溶液後，分裝人抗體文庫1.0Χ1013(130μ 1/孔)，在37°C下反 應2小時。以後的操作與上述篩選實驗1相同(實施到第四次篩選為止。在第四次篩選使 用第三次噬菌體400 μ 1)。實施第四次篩選後，挑取188克隆，用ELISA確認它們的結合能力的結果為，類 毒素特異性反應的克隆有6種(圖10、11)。其中，大量含有與至此取得的2種抗體克隆
26(BT-015、BT-175)相同或相似的克隆(對於BT-015為6克隆，對於BT-175為5克隆)。2-6.篩選實驗6 (利用BT-015和BT-175抗體共存的相同克隆排除)在以神經毒素為抗原的篩選(2-5.)中，以排除大量的所取得的抗體克隆(與 BT-015或BT-175相同或類似的克隆)為目的，進一步實施篩選實驗。首先，在微型杯8孔分別分裝用PBS調製至10 μ g/ml的濃度的神經毒素100 μ 1， 在4°C反應過夜並固相化。除去溶液後，分別分裝l%BSA/PBS200y 1，在37°C下進行1小時 封閉。除去封閉溶液後，分裝由抗體克隆BT-015及BT-175調製的抗體蛋白質(各自30yg/ 孔)，在37°C下反應1小時來遮蔽抗原。除去抗體蛋白質溶液後，將在篩選實驗5的第三次 篩選得到的噬菌體(第三次噬菌體)2.0X1013和由抗體克隆BT-015以及BT-175調製的 抗體蛋白質(各180yg)混合後，分裝入微型杯，在37°C下反應2小時。挑取188克隆，用 ELISA確認它們的結合能力，與神經毒素特異性反應的新型克隆有24種(圖12、13)。應予 說明，以上的篩選過程如圖15所示。2-7.利用動物試驗的抗體評價由在以神經毒素為抗原的篩選(篩選實驗5和6)取得的30種的抗體克隆調製 Fab-pp型抗體。對於各Fab-pp型抗體，通過與毒素混合進行皮下給藥觀察小鼠的生死、麻 痺等的症狀這樣的試驗方法，判斷中和能力。試驗方法以參考文獻(生物學製劑基準厚生 勞動省日本藥局方)為標準，樣本的效價作為對於日本標準品的相對效價求出。將A型肉 毒桿菌抗毒素日本標準品(10單位/ml)稀釋10倍，得到作為儲備溶液的抗毒素原液(1單 位/ml)，將其用PBS稀釋調製成0. 1單位/ml的溶液進一步調製進行每次2倍的5步稀釋 的溶液(以下，稱為「標準稀釋」)。樣本直接使用調製的原液。將肉毒桿菌神經毒素稀釋400倍，得到儲備溶液(950LD50/ml)，進一步稀釋10倍， 製作試驗毒素(95LD50/ml)。準確量取試驗毒素0. 25ml和各標準稀釋以及樣本0. 25ml，充 分混合在室溫下反應1小時後，對1組2隻的小鼠進行每隻0. 2ml的皮下接種，觀察40天。 根據試驗組的小鼠的臨床症狀(完全緩解、麻痺的程度)，判定樣本的效價。結果，4種抗體 克隆(NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)表現出中和能力(圖 14)。3.抗體序列的比較在以上的篩選(篩選實驗1 6)取得的抗體的序列信息如下所示。應予說明，在 圖16中，比較這些抗體(其中，除去BT-015的類似克隆，即BT-047和BT-058)的胺基酸序 列，同時示出與種系的同源性。(DBT-015
(胺基酸序列)
VH CDRl 序列編號1
VH CDR2 序列編號2
VH CDR3 序列編號3
VH 序列編號4
VL⑶Rl 序列編號5
VL CDR2 序列編號6
VL⑶R3 序列編號7
VL 序列編號8
(鹼基序列)VH 序列編號77VL 序列編號78(8) NT-539(胺基酸序列)VH CDRl 序列編號 57VH CDR2 序列編號 58VH CDR3 序列編號 59VH 序列編號60VL CDRl 序列編號 61VL CDR2 序列編號 62VL CDR3 序列編號 63VL 序列編號64(鹼基序列)VH 序列編號79VL 序列編號804.抗體的分析4-1. IgG抗體的調製由在Fab-pp型抗體中觀察到中和活性的抗體克隆(BT-015、BT-175、NT-221、 NT-320、NT-523)調製IgG抗體。首先，對於各抗體克隆，將編碼VH的基因片段與人Yl鏈 規定區域DAN連接後，重組入表達載體「BCMGS Neo載體」(鳥山一「牛乳頭狀瘤病毒載體」， 村松正實和網山博人編，實驗醫學別冊基因工程手冊，羊土社，PP- 297-299 (1991)，製作伴 有規定區域的H鏈載體。同樣地，將各抗體克隆的L鏈全長基因重組入載體，得到L鍊表達 抗體表達載體。使用脂質轉染法將抗體表達載體轉染入中國倉鼠卵巢細胞株CH0-K1，在37°C 下培養規定時間後，移入96孔板，選擇高表達細胞。使用無血清培養基(CHO-S-SFM II: Invitrogen 公司制，(ν/ν)青黴素-鏈黴素溶液Sigma_Aldrich 公司制，700&micro ；g/ ml G418 =Sigma-Aldrich公司制)，將選擇的各細胞在大量培養燒瓶(BectonDickinson公 司制CELLine 1000燒瓶)中培養2周。回收培養上清液，供給Protein G結合親和柱。用 PBS洗淨柱後，用甘氨酸鹽酸緩衝液(pH2. 7)洗脫，用Tris鹽酸緩衝液(pH8. 9)進行中和。 接著，將洗脫液放入透析濃縮用管(Millipore公司制，Amicon Ultra-15)對PBS進行透析 濃縮。將這樣得到的IgG型抗體用於以後的實驗。4-2.利用Biacore的結合常數分析分析使用BiaCOre3000生物傳感器裝置。首先將神經毒素880RU在傳感器晶片 (CM5)上固相化後，依次改變濃度(1.9nM ΙμΜ)注入(40 μ 1，2分鐘)Fab-pp型或IgG 型抗體。分析結果如圖17(BT-015的Fab-PP型抗體)、圖18(BT_015的IgG型抗體)、圖 19 (BT-175 的 Fab-PP 型抗體)、圖 20 (BT-175 的 IgG 型抗體)、圖 21 (NT-221 的 Fab-PP 型抗 體)、圖22(NT-320的Fab-PP型抗體)所示。分析的結果為，都是具有強結合力的抗體。4-3.利用Biacore的表位分析
30
調製對於A型肉毒桿菌毒素表現出中和活性的6種抗體克隆(BT-015、BT-175、 NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)的Fab-PP型抗體，使用其進行Biacore的競爭實驗。將 神經毒素800RU固化於傳感器晶片(CM5)後，以以下的濃度依次注射抗體，測定有無競 爭。注射為每次流過40 μ 1(2分鐘)。所有的分析實驗都是在HBS-EP流速20 μ 1/分鐘 HBS-EP(Biacore)中，在 25°C下進行。再生是將 IOOmM Glycine-HCl (ρΗ2. 0)以 20 μ 1 (流 速60 μ 1/分鐘，20秒)進行的。[表 1]表1 抗體的注射濃度(單獨或混合、最終濃度)
權利要求
一種A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其含有識別具有由序列編號4的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號8的胺基酸序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位的第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，識別具有由序列編號36的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號40的胺基酸序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位的第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，和識別具有由序列編號44的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號48的胺基酸序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位、或者具有由序列編號52的胺基酸序列構成的重鏈可變區和由序列編號56的胺基酸序列構成的輕鏈可變區的抗體的表位的第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
2.根據權利要求1所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自下述(1) (3)中任一種的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是選自下述(4)或(5)的抗體，第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是選自下述(6) (8)中任一種的抗體(1)具有由序列編號1的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號2的胺基酸 序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號3的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由序 列編號5的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號6的胺基酸序列構成的輕鏈互 補決定區2和由序列編號7的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(2)具有由序列編號9的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號10的氨基 酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號11的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由 序列編號13的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號14的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號15的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(3)具有由序列編號17的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號18的氨基 酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號19的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由 序列編號21的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號22的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號23的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(4)具有由序列編號25的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號26的氨基 酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號27的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由 序列編號29的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號30的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號31的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(5)具有由序列編號33的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號34的氨基 酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號35的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由 序列編號37的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號38的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號39的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(6)具有由序列編號41的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號42的氨基 酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號43的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由 序列編號45的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號46的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號47的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(7)具有由序列編號49的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號50的氨基 酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號51的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由序列編號53的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號54的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號55的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體；(8)具有由序列編號57的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區1、由序列編號58的氨基 酸序列構成的重鏈互補決定區2、由序列編號59的胺基酸序列構成的重鏈互補決定區3、由 序列編號61的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區1、由序列編號62的胺基酸序列構成的輕 鏈互補決定區2和由序列編號63的胺基酸序列構成的輕鏈互補決定區3的抗體。
3.根據權利要求2所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，第1人抗A型肉毒桿菌 毒素抗體是選自所述⑴ ⑶中任一種的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(4)或(5)的抗體，第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體，進一步含有所述(7)或(8)的抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
4.根據權利要求2所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中， 第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體， 第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(6)的抗體。
5.根據權利要求4所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，進一步含有所述(7)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
6.根據權利要求2所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中， 第1人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(1)的抗體，第2人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(5)的抗體， 第3人抗A型肉毒桿菌毒素抗體是所述(7)的抗體。
7.根據權利要求6所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，進一步含有所述(4)的 抗體作為第4人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。
8.根據權利要求2 7中任一項所述的A型肉毒桿菌毒素中和組合物，其中，所述(1)的抗體的重鏈可變區具有序列編號4的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號8的胺基酸序列，所述(2)的抗體的重鏈可變區具有序列編號12的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號16的胺基酸序列，所述(3)的抗體的重鏈可變區具有序列編號20的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號24的胺基酸序列，所述(4)的抗體的重鏈可變區具有序列編號28的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號32的胺基酸序列，所述(5)的抗體的重鏈可變區具有序列編號36的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號40的胺基酸序列，所述(6)的抗體的重鏈可變區具有序列編號44的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號48的胺基酸序列，所述(7)的抗體的重鏈可變區具有序列編號52的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號56的胺基酸序列，所述(8)的抗體的重鏈可變區具有序列編號60的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編號64的胺基酸序列。
9.一種分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，其包含權利要求2規定的(1) (8)中任 一種的抗體。
10.根據權利要求9所述的分離的人抗A型肉毒桿菌毒素抗體，其中，所述(1)的抗體的重鏈可變區具有序列編號4的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號8的胺基酸序列，所述(2)的抗體的重鏈可變區具有序列編號12的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號16的胺基酸序列，所述(3)的抗體的重鏈可變區具有序列編號20的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號24的胺基酸序列，所述(4)的抗體的重鏈可變區具有序列編號28的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號32的胺基酸序列，所述(5)的抗體的重鏈可變區具有序列編號36的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號40的胺基酸序列，所述(6)的抗體的重鏈可變區具有序列編號44的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號48的胺基酸序列，所述(7)的抗體的重鏈可變區具有序列編號52的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號56的胺基酸序列，所述(8)的抗體的重鏈可變區具有序列編號60的胺基酸序列，輕鏈可變區具有序列編 號64的胺基酸序列。
11.一種分離的核酸分子，編碼權利要求10所述的抗體的重鏈可變區和/或輕鏈可變區。
12.—種載體，保持權利要求11所述的核酸分子。
13.一種轉化體，是用權利要求12所述的載體進行轉化而得到的。
14.一種人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的製備方法，其包含培養權利要求13所述的轉化體，生產人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序， 回收培養上清液，由培養上清液純化人抗A型肉毒桿菌毒素抗體的工序。
全文摘要
本發明的課題在於提供一種對於肉毒桿菌中毒疾病和其中毒發病的預防有效的方法。本發明提供表位不同的多種人抗A型肉毒桿菌毒素抗體。另外，本發明還提供將它們組合的、中和活性高的A型肉毒桿菌毒素中和組合物。
文檔編號A61K39/395GK101965403SQ200980107100
公開日2011年2月2日 申請日期2009年1月23日 優先權日2008年1月29日
發明者東成見, 向本雅鬱, 小崎俊司, 幸田知子, 高橋元秀, 黑澤仁, 黑澤良和 申請人:株式會社抗體研究所;國立感染症研究所所長代表的日本國;公立大學法人大阪府立大學