一種複合多肽的聯合提取製備方法

2023-09-23 12:37:45

一種複合多肽的聯合提取製備方法
【專利摘要】本發明提供一種複合多肽的聯合提取製備方法。本發明採用溫和的弱酸法提取其中天然生物活性多肽，然後再將溫和弱酸法提取多肽過程中所殘留和廢棄的沉澱物質再採用酶解法進行水解，即將同一種原料分別採用酸解法和酶解法聯合進行複合多肽提取，其提取方法不僅體現在被提取的原料或資源得到充分利用、且使原廢棄物得到最大限度使用、並使提取製備的複合多肽的得率明顯提高；而且，節省寶貴的自然資源、減少環境汙染、安全隱患消除、生產周期縮短、提取試劑和儀器減少、投資和生產成本減低、多肽生物利用度提高、未來使用應用範圍擴大、人體應用價值提高。
【專利說明】一種複合多肽的聯合提取製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學美容保健及抗衰老產品等相關領域的應用，特別是涉及一種複合多肽的聯合提取製備方法。
【背景技術】
[0002]1、多肽及其應用的技術背景
[0003]肽類(p印tide)分為寡肽和多肽，是由兩個或兩個以上胺基酸縮合併以肽鍵相連的一類生物活性物質，它是蛋白質的中間產物，其分子結構介於胺基酸和蛋白質之間的片段。肽類物質與生物體內其它物質相比，其最大的特點是它們具有很高的生物活性和生物多樣性。正是因為它們具有廣泛的生物活性，也被稱之為活性生物多肽。多肽(polypeptide)是肽類的其中一部分，也是構成生命的最基本和重要的物質之一。事實上，活性生物多肽廣泛分布並存在於大自然之中，生物體內有很多生物活性物質大都是以多肽的結構形式存在的。大量科學研究表明，活性生物多肽實際上是由20餘種天然胺基酸通過肽鏈以不同的排列方式和形態構成，即從兩肽到多肽的複雜線性和環形結構形成，它們均是源於蛋白質中間產物及天然構象的多功能化合物。
[0004]在生物體內，這些活性生物多肽不僅以多肽分子結構及天然構象的形式存在，且也以天然生物活性的作用方式在機體發揮著重要的生物學效應。正如有些學者所言:活性生物多肽可謂生物體生命象徵的基本存在形式，它在生物體的生長發育和新陳代謝中起著至關重要的生物學作用。而且，人體內的各種生命活動、代謝進程和生理機能等，也幾乎都是受特定胺基酸序列組成的生物活性多肽或蛋白質所主導和調控。
[0005]理論上講，這些活性生物多肽的生物活性主要表現在它們能夠參與生物體內蛋白質的合成代謝和分解代謝，能夠促進生物體內相關細胞的有絲分裂與增殖分化，能夠主動調節細胞內外蛋白質的合成與分泌，能夠確保生命遺傳基因的表達與複製，能夠保證細胞中生命物質的正常合成及蛋白質轉錄和的數量、質量和速度；同時，還能夠提高和調控機體生命活動對蛋白質的生理利用率與生物利用度，增強機體組織與細胞的新陳代謝，進而，有效調控人體的生長與發 育、成長與成熟、衰老與疾病。或者說，活性生物多肽在人體內所有的細胞以及由細胞組成的組織、器官乃至整個生理系統都受活性多肽的調節和控制，它決定和控制著人體蛋白質的合成，而蛋白質又是生命最為重要的表現形式。長期以來，很多人根據分子的大小和形狀去判斷其吸收與否，及小分子物質容易被吸收和利用的觀點而片面地認為，人體所需的蛋白質主要依靠其最終分解產物胺基酸的形式吸收後補充。然而，近年來的科學研究卻證實，人體所吸收蛋白質的主要形式不都是胺基酸，而是活性生物肽。活性生物多肽與人類健康、抗衰老及延年益壽等密切相關、且意義重大。這是因為，活性生物多肽作為機體生長和發育的智能化生物監控器，能主動調節，並有效監視和調控機體內各個細胞中蛋白產物的表達、翻譯、複製等過程。當機體生命活動正常及各類細胞分裂、增殖正常時，活性生物多肽以確保生命活動和細胞正常分裂和蛋白質正常合成。當機體生命活動異常及各細胞增殖異常時，活性生物多肽即會立即發現並實施對錯誤細胞進行調控、並可能停止對它進行主動修復和遷移，且通過及時剪切和剪接、修正和修復異常錯誤細胞以保證蛋白質正常合成和人體處於健康狀態。因此，目前學術觀點認為，活性生物多肽不僅是機體生命活動的主因，也是人體細胞健康和整體抗衰老的要素。可以說，機體如果沒有活性生物多肽，就等於機體沒有生物活性物質，而機體也就失去了生命的活力和代謝的動力。
[0006]2、目前多肽的提取製備方法及其所存在的缺陷或不足:
[0007]目前，以大自然中活的生物(包括動物及其臟器、植物及中草藥、微生物、昆蟲、海洋生物等)為原料提取和製備多肽的方法很多，包括酸水解法、鹼水解法、酶水解法、酸醇提取法、膜分離法、超聲提取法、微波提取法、以及兩種方法結合應用等方法。然而，與其他生物小分子的提取、分離方法不同的是，蛋白質和多肽類等生物大分子化合物的提取、分離是一個梯度純化的過程，即在不改變這些化合物的結構和性質的條件下，儘量將提取物中的雜質分離出來，因此，提取的條件必須是較為溫和的，且不會明顯改變蛋白質和多肽的理化性質及其生物活性和抗氧化活性等。
[0008]但採用單純的酸解或鹼解法提取多肽，若所選擇的溶液體系酸性或鹼性太強，都可能使被提取物發生不可逆變性或過度水解以及分子構象等發生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學活性和功能，從而使所提取的多肽失去應有的功效作用和應用價值。採用酶解法通常選用的具有內切功能的各種蛋白水解酶。如採用酶解法時使用的水解酶量過大或pH條件過於劇烈等，同樣可能使被提取物發生不可逆變性或過度水解以及分子構象等發生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學活性和功能，從而使所提取的多肽失去應有的功效作用和應用價值。因為維持酸性蛋白酶的最適合pH值為2.0~2.5，鹼性蛋白酶的最適PH值為11，其反應條件均較為劇烈，這不僅對設備的要求較高且水解度不容易控制，在生產中不具有實際意義。而中性蛋白酶雖然是從蛋白質內部將肽鍵打開，專一性突出，反應條件較為溫和(PH = 7)，水解效力適中，操作易於控制，並且不會破壞胺基酸結構和其它營養成分，在有效成分 的保留上有著不可比擬的優勢，而且價格低廉，適用於大規模的工業化生產，但如水解酶量過多或過少、酶類選擇不合理、或pH條件太劇烈，其提取得率往往偏低、又得不償失。而且，為了阻止在完成多肽提取後所加入的蛋白酶繼續發生水解、通常需要煮沸進行滅酶活，這樣可能在一定程度上造成多肽生物活性的降低或破壞。
[0009]而採用酸醇法提取多肽，其提取液體的pH值通常在3.5或以下才能有更好的提取得率和分離效果，然而，此pH值雖然不能嚴重改變其分子結構和生物活性，但此法提取的多肽在PH高於3.5或以上以及一般條件下較難溶解，這不僅影響其溶解度，也影響著實際應用。如果為了該提取多肽的溶解而將其溶解體系的PH降低到3.5或以下，則在某些領域，如皮膚美容品和化妝品中難以直接應用。而且，採用酸醇法提取多肽，使用的乙醇不僅增加提取成本，又汙染環境、影響操作者的健康，而且，殘存在多肽提取液中的乙醇其分離、剔除以及乙醇的後期回收等過程工藝繁瑣、難度較大。而單純使用超濾法提取分離多肽，雖然方法簡單、適合規模化生產，但膜的堵孔現象、實際使用壽命和成本、以及多肽提取得率等技術瓶頸等尚需要進一步完善和改進。而且，目前採用的多肽超聲提取法、微波提取法等也不同程度存在著這樣或那樣的問題或不足。為此，現在需要設計和研製一種更加適合應用的複合多肽及其製備方法。

【發明內容】
[0010]本發明的目的是針對【背景技術】中存在的缺點和問題加以改進、創新，提供一種複合多肽的聯合提取製備方法，並克服和解決上述【背景技術】中存在的缺點:
[0011 ] (I)單純的酸解或鹼解法提取多肽，若所選擇的溶液體系酸性或鹼性太強，都可能使被提取物發生不可逆變性或過度水解以及分子構象等發生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學活性和功能，從而使所提取的多肽失去應有的功效作用和應用價值
[0012](2)酶解法通常選用的具有內切功能的各種蛋白水解酶。如採用酶解法時使用的水解酶量過大或PH條件過於劇烈等，同樣可能使被提取物發生不可逆變性或過度水解以及分子構象等發生明顯改變，使其逐步失去了多肽的生物學活性和功能，從而使所提取的多肽失去應有的功效作用和應用價值。
[0013](3)酸醇法提取多肽，其提取液體的pH值通常在3.5或以下才能有更好的提取得率和分離效果，但此法提取的多肽在PH高於3.5或以上以及一般條件下較難溶解，這不僅影響其溶解度，也影響著實際應用。如果為了該提取多肽的溶解而將其溶解體系的PH降低到3.5或以下，則在某些領域，如皮膚美容品和化妝品中難以直接應用。而且，採用酸醇法提取多肽，使用的乙醇不僅增加提取成本，又汙染環境、影響操作者的健康，而且，殘存在多肽提取液中的乙醇其分離、剔除以及乙醇的後期回收等過程工藝繁瑣、難度較大。
[0014](4)單純使用超濾法提取分離多肽，雖然方法簡單、適合規模化生產，但膜的堵孔現象、實際使用壽命和成本、以及多肽提取得率等技術瓶頸等尚需要進一步完善和改進.[0015]本發明所提供的一種複合多肽的聯合提取製備方法，正是針對上述存在的諸多問題或局限設計研製和改進創新一種複合多肽的提取製備方法，從而避免了當前同類方法和技術的一些不足之處。
[0016]本發明一種複合多肽的聯合提取製備方法，其特徵在於，包括以下步驟:
[0017](I)取新鮮的待提取物，勻漿後加入10~30倍重量的白醋，並將PH值調至3.5~4.5，再在冰浴條件下進行超聲破碎處理O~40min ;將燒杯置於4°C冰箱中進行磁力攪拌4~24h ;然後，12000r/min,離心20`min,沉澱稱重，同時收集上清液進行超濾，I μ m膜粗濾，透過液進行10萬膜超濾，未透過濾液用於下個步驟提取，透過液再進行I萬膜超濾，最後進行納濾，納濾液進行冷凍乾燥，即可得到複合酸解多肽，也可稱為複合天然多肽；
[0018](2)取步驟(1)所得的沉澱和未透過液，加入2倍體積的蒸餾水和中性蛋白酶，攪拌均勻，加入IM NaOH鹼液將pH調至至5.5~7.5，在水浴溫度45~65°C下提取I~3h，結束後用白醋調酶解液至中性酶PH至4.0，終止酶解反應，12000r/min，離心20min，收集上清液進行超濾，I μ m膜粗濾，10萬膜超濾，透過液I萬膜超濾，濾液進行納濾，納濾獲得的濃縮液冷凍乾燥得到複合酶解多肽。
[0019]步驟(1)或(2)所述的透過液進行超濾，它包括兩次超濾，第一次經過10萬膜超濾，第二次經過I萬膜超濾。
[0020]步驟(1)中採用蒸餾水調節白醋的PH值；步驟⑵所述調節PH值的鹼液為I摩爾的氫氧化鈉；步驟(1)或(2)所述的冷凍乾燥條件為-45°c預凍lh，-80°c，4.5Pa冷凍乾燥約20h。
[0021]本發明將同一種原料分別採用酸解法和酶解法聯合進行複合多肽提取，不僅其聯合提取製備技術本身就具有明顯創新性，而且，其中一些提取製備條件、工藝路線設計、具體操作方法等均有鮮明創新。[0022]本發明的創新點主要表現在三個方面:第一，採用食用級白醋進行酸解法提取；第二，採用食用級中性蛋白水解酶進行酶解提取；第三，採用級聯超濾進行提取分離等。
[0023]1、採用食用級白醋進行酸解法提取的創新點主要有:
[0024](I)採用食用白醋水解蛋白質多肽鏈進行複合多肽提取，其提取工藝更加簡單，甚至可以在確定該食用白醋來源和一定比例時直接將食用白醋添加至被提取組織或原料勻漿之中直接進行提取，與傳統多肽提取製備相比，不僅省去了多次添加提取試劑的繁瑣工藝，而且還省去了提取試劑配製和pH調校等繁瑣步驟。
[0025](2)採用食用白醋水解蛋白質多肽鏈進行複合多肽提取，其提取工藝更有效成效，體現在採用本發明方法所提取的複合多肽不僅工藝穩定、得率較高、生物活性保持較好、且在實際應用時的相溶性及溶解性更佳。
[0026](3)採用食用白醋水解蛋白質多肽鏈進行複合多肽提取，其提取工藝更安全，這不僅是因為整個提取過程不需要再添加乙醇等易燃易爆性化學試劑，免除後續提取分離的繁瑣，降低提取製備成本，減少環境汙染，而且直接用食用白醋提取，其後期應用無論是經口服途徑、還是經皮外用等均更加安全可靠。
[0027](4)採用食用白醋水解蛋白質多肽鏈進行複合多肽提取，其提取工藝更方便；這不僅因為將食用級白醋作為提取溶液條件溫和、提取簡單、且提取原料來源十分方便，而且，食用級白醋溶液的溫和條件，克服了提取溶液酸性或鹼性太強都可能使被提取物的多肽發生劇烈變性或水解以及分子構象發生改變並逐步失去生物活性。
[0028](5)由於多肽源於蛋白，故應先使帶有活性肽的蛋白質溶解。複合多肽提取的勻漿液，傳統方法可用水溶液、鹽溶液或緩衝溶液等作為提取溶劑，而本發明採用食用級白醋水溶液作為其提取溶劑，實驗證明，它不僅能夠充分溶解蛋白質或肽類化合物，而且通過調節穩定的PH，使其提取的微環境及其穩定性更`好，不易與樣品發生反應，可更好地保證所提取的多肽不失去生物活性。這是因為食用級白醋水溶液為弱酸溶液，而提取複合多肽的蛋白質在弱酸性環境中不僅其肽鏈可被溫和水解、且複合多肽在該溶液中的溶解度比在水中更大，而且食用級白醋水溶液為弱酸溶液的存在尚不會改變擬提取複合多肽的理化性質和生物學特性，也不會影響其良好的生物活性和抗氧化活性。
[0029]2、採用食用級中性蛋白水解酶進行酶解法提取的創新點主要有:
[0030](I)本發明採用食用級中性蛋白水解酶水解蛋白質多肽鏈進行剩餘或殘留物質進行複合多肽提取，該中性蛋白酶是具有內切功能的中性蛋白酶，而中性蛋白酶主要從蛋白質內部將肽鍵打開，專一性突出，反應條件溫和(pH = 7.0)，水解效力適中，操作易於控制，並且不會破壞胺基酸結構和其它營養成分，在有效成分的保留上有著不可比擬的優勢，而且價格低廉，適用於大規模的工業化生產。
[0031](2)本發明採用食用級中性蛋白水解酶水解蛋白質多肽鏈進行剩餘或殘留物質進行複合多肽提取，其提取所採用溶液的酸鹼度值控制在中性的條件之中(PH7.0)，這樣可避免使用酸性蛋白水解酶和鹼性蛋白水解酶水解蛋白質多肽鏈時必須使用過強的酸性或鹼性環境條件，而提取溶液的酸性或鹼性過強，都可能使被提取的複合多肽發生變性或水解以及分子構象發生改變並逐步失去生物活性。因為酸性蛋白酶的最適合PH值為2.0~2.5，鹼性蛋白酶的最適PH值為11，其反應條件均較為劇烈，對設備的要求較高且水解度不容易控制，在生產中不具有實際意義。[0032]雖然，目前也有人曾使用過食用級中性蛋白水解酶進行蛋白質水解和多肽提取，但本發明通過我們自己的正交試驗，探索並得到最佳的提取條件，而這，是與目前同類提取方法完全不同的，也是本發明的創新之處。
[0033]特別是，目前使用食用級中性蛋白水解酶進行蛋白質水解和多肽提取後需要加熱甚至高溫對該酶進行滅活，而滅酶的溫度過高，都可能使被提取的複合多肽發生變性或水解以及分子構象發生改變並逐步失去生物活性。而本發明則採用常溫或低溫超濾方式去除殘留水解酶，不僅減少工藝、節省能源，而且，可完整保留提取複合多肽的理化性質和生物學特性，也不會影響其良好的生物活性和抗氧化活性。
[0034]3、採用級聯超濾進行提取分離的創新點主要有:
[0035](I)本發明設計並採用的是級聯超濾方法，即首先通過粗濾器初濾經過自然沉澱的粗提液，這樣不僅可省去無大容量低溫離心機的條件限制，還可在常溫或低溫條件下有效過濾掉肉眼明顯可見的顆粒物。
[0036](2)本發明還設計了對經過粗濾器過濾的粗提液再以10萬分子量的超濾膜進行截留，這樣它不僅可快速對粗濾液進行第二次過濾，也可使提取液中某些肉眼不可見的不溶性微粒及雜蛋白或微生物、以及未經完全酸解的大分子蛋白質截留而除去，而且通過此法還可確保後續小分子超濾膜不被或少被異物堵塞，從而可提高提取分離複合多肽的效率和效果。
[0037](3)在此基礎上，本發明再設計了 I萬分子量的超濾膜，對經過10萬分子量的超濾膜超濾後的透過液再次進行透過，使大於I萬分子量和小於10萬分子量的蛋白質或非複合多肽等雜質進一步被分離或截留；同時，使小於I萬分子量的複合多肽順利透過，從而使較低分子量的複合多肽得到進一步的提取和分離。而這些小於I萬分子量的複合多肽未來將可通過經皮給藥途徑應用。
[0038](4)本發明最後還設計了分子量為300納米以下的納濾膜，對經過I萬分子量的超濾膜超濾後的透過液進行納濾，使小於I萬分子量和大於300納米的複合多肽得以截留，這不僅起到常溫或低溫條件了快速濃縮大容量超濾透過液的目的，而且，還能將300納米以下的非複合多肽物質及無機鹽、非蛋白氮、激素等有效濾除，從而使複合多肽的純度進一步提高。特別是，採用本發明的級聯超濾進行提取分離，確保複合多肽提取條件完全溫和，這也與某些傳統多肽的提取、分離方法不同，而且，本發明正好符合複合多肽類提取、分離這樣一種梯度純化的過程，即在不改變這些多肽生物活性和多肽化合物的結構和性質的條件下，儘量將提取物中複合多肽提取出來、而將那些非複合多肽的雜質分離出去。
[0039]雖然，目前也有人曾使用過超濾膜進行蛋白質和多肽提取分離，但本發明通過我們自己設計的級聯超濾再結合納濾濃縮和分離技術探索並得到更好的綜合效應，而這，並與目前同類提取方法在設計思路和實施方法有很大不同，而這，也是本發明的創新之處。 [0040]綜上所述，本發明主要具有以下有益效果，即本發明將同一種原料分別採用酸解法和酶解法聯合進行複合多肽提取，其發明的有益效果，不僅體現在被提取的原料或資源得到充分利用、且使原廢棄物得到最大限度使用、並使提取製備的複合多肽的得率明顯提高；而且，節省寶貴的自然資源、明顯減少環境汙染、安全隱患消除、生產周期縮短、提取試劑和儀器減少、投資和生產成本減低、生物利用度提高、未來使用應用範圍擴大、人體應用價值提聞。[0041]本發明的有益效果具體表現在如下幾個方面:
[0042](I)節省寶貴的自然資源:過去提取製備天然生物活性多肽一般採用單一方法進行提取和製備，這些方法對提取單一多肽後的餘料或其它多肽以及所謂的沉澱廢除物將直接丟棄而不會再回收和利用，造成本來寶貴的自然資源及蛋白多肽資源的大量浪費。本發明則首先採用溫和的弱酸法提取其中天然生物活性多肽，然後再將溫和弱酸法提取多肽過程中所殘留和廢棄的沉澱物質再採用酶解法進行水解，如此可得到更多的數量和種類的多肽，節省和利用了本來就非常寶貴的自然資源。
[0043](2)節省能源、減少環境汙染:過去提取製備天然生物活性多肽，常採用酸-醇提取法，該方法對提取多肽雖然經典和傳統，但提取過程中使用乙醇量較大，有一定的環境汙染和人體刺激；而且，由於提取所用的乙醇回收難度較大、或即使能夠使乙醇回收，但操作較為繁瑣、實際丟失較多，造成較大的能源浪費和較明顯的環境汙染、且存在較多的安全隱患。本發明直接採用單純食用級白醋以弱酸性條件進行提取，省略乙醇添加，不僅節省能源、確保安全生產、且也大大減少環境汙染及對長期乙醇刺激對人體健康的影響。
[0044](3)投資和生產成本減低:過去大量提取製備天然生物活性多肽，無論採用酸-醇提取法，還是酶解法，其提取試劑較多、製備儀器和設備眾多，尤其在提取製備過程及多肽分離等環節，必須使用大容量低溫勻漿機、大容量冷凍離心機、超聲細胞破碎儀、透析、層析和梯度洗脫以及濃縮裝置等，甚至需要濾菌系統和有機溶劑回收體系等，其耗資較多、投資較大，但採用本發明方法，只要增加本發明設計和製造的級聯超濾和納濾系統，即可省去上述大部分儀器和設備及提取試劑，甚至無需冷凍離心和過濾除菌設備等，不僅使大規模生產複合多肽的投資大大降低，而且也可使複合多肽的生產成本大大減少。
[0045](4)操作簡便、易於產業化:本發明提取條件已通過正交實驗優化、操作方法也基本程序化、且實施過程已經簡化，使整個提取製備操作簡便、生產程序減少、生產周期縮短、且易於產業化和規模化生產，特別是本發明的納濾濃縮部分，不僅簡便而快速、保留多肽生物活性，還可除去應用中忌諱的某些激素類成分和重金屬離子等，這是過去傳統方法旋轉濃縮所無法達到的有益效果。
[0046](5)多肽提取效率及純度和得率均提高明顯:本發明採用酸解法和酶解法聯合提取，不僅大大減少蛋白及多肽資源浪費，而且，大大提高了複合多肽的提取效率，特別是採用本發明的級聯超濾結合納濾提取法，使複合多肽提取的得率和純度等明顯提高。
[0047](6)生物利用度提高、未來使用應用範圍擴大、人體應用價值提高:本發明提取製備的複合多肽，其顯著的特點是分子量較小、而生物活性較高，且含有多種功能性多肽等，因此，與傳統多肽提取法所製備的多肽相比，本發明提取製備的複合多肽其生物利用度更高、未來應用範圍更大、人體應用價值更好。總之，本發明提取製備多肽，其基本處理過程為單純物理過程，無任何相變。設備操作溫度低，避免了傳統工藝的種種弊端；而且，聯合體提取製備最終提取系統均採用先進的超濾膜和納濾膜相結合的分離技術，其工藝簡單，運行穩定可靠，處理效率高；同時，可以對首次提取製備過程中剩餘蛋白資源及其有用物質進行多肽提取製備和綜合利用，實現經濟、環保雙贏；除此之外，多肽提取儀器和設備投資少、運行費用低、但提取製備多肽得率明顯提高。 【專利附圖】

【附圖說明】[0048]圖1.一種複合多肽的聯合提取製備方法工藝流程及技術路線。
[0049]圖2.海蝦酸解多肽的標準曲線
[0050]圖3.Bicinchoninic acid(BCA)法測定奸酸解多肽正交試驗得到的多肽含量
[0051]圖4.海蝦酸解正交試驗結果因素指標分析
[0052]圖5.海蝦酶解多肽的標準曲線
[0053]圖6.BCA法測定鮮蝦酶解正交試驗得到的多肽含量
[0054]圖7.海蝦酶解正交試驗結果因素指標分析
[0055]圖8.鮮蝦酸解正交試驗所得鮮蝦天然多肽樣品20% SDS-PAGE圖
[0056]圖9.鮮蝦酶解多肽的20% SDS-PAGE圖
【具體實施方式】
[0057]本發明實施例公開了一種複合多肽聯合提取製備方法。為了進一步理解本發明，下面以海蝦多肽提取為例對本發明進行詳細說明。
[0058]實施例1:海蝦複合多肽的聯合提取製備方法
[0059](I)酸解法海蝦複合多肽提取製備的實驗設計和製備方法
[0060]按照實驗設計要求，準確取一定量的新鮮海蝦，洗淨後浙幹；添加一定量的預冷勻漿液，以後，立即置於組織勻漿器中進行勻漿；待勻漿充分後，再稱重並記錄之；然後，即可進行四因素三水平的正交試驗(如表1所示)。
[0061]表1L9-3-4正交表(軟體:正交設計助手II v3.1)
【權利要求】
1.一種複合多肽的聯合提取製備方法，其特徵在於它包括以下步驟: (1)取新鮮的待提取物，勻漿後加入10~30倍重量的白醋，並將PH值調至3.5~4.5，再在冰浴條件下進行超聲破碎處理O~40min ;將燒杯置於4°C冰箱中進行磁力攪拌4~24h ;然後，12000r/min,離心20min,沉澱稱重，同時收集上清液進行超濾，Ium膜粗濾,透過液進行超濾，未透過濾液用於下個步驟提取，最後進行納濾，納濾液進行冷凍乾燥，即可得到複合酸解多肽； (2)取步驟(1)所得的沉澱和未透過液，加入2倍體積的蒸餾水和中性蛋白酶，攪拌均勻，加入鹼液將pH調至5.5~7.5，在水浴溫度45~65°C下提取I~3h，結束後用白醋調酶解液至中性酶PH至4.0,終止酶解反應，12000r/min,離心20min，收集上清液進行超濾，I μ m膜粗濾，透過液進行超濾，濾液再進行納濾，納濾獲得的濃縮液冷凍乾燥得到複合酶解多肽。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)或(2)所述的透過液進行超濾，它包括兩次超濾，第一次經過10萬膜超濾，第二次經過I萬膜超濾。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)中採用蒸餾水調節白醋的PH值。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟⑵所述調節PH值的鹼液為I摩爾的氫氧化鈉。
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)或(2)所述的冷凍乾燥條件為-45°C預凍lh，-80°C,4. 5Pa冷凍乾燥約20h。
【文檔編號】C12P21/06GK103882085SQ201410142330
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】楊永鵬, 郝林琳, 董萍, 丁克祥, 張鑫, 左夏林, 虞偉民, 劉莉, 梁虹, 丁振華 申請人:楊永鵬, 董萍, 丁克祥