一種基於定量PCR技術的GSTM1分型檢測方法與流程
2023-10-07 04:50:04 2
本發明涉及基因檢測技術領域，具體是一種基於定量pcr技術的gstm1分型檢測方法。
背景技術：
gstm1為一種重要的代謝酶，參與對內生和外源性物質的轉化和代謝，賦予代謝物新的生物學特性。在人類gstm1具有多態性，gstm1缺失為一種常見的基因型。不同gstm1基因型的個體地物質的轉化功能存在差異。gstm1基因分型用於多種生物學性狀的研究。傳統的，由於gstm1缺失多態性可以通過普通pcr檢測，多採用常規基因特異性pcr，瓊脂糖電泳檢測方式確認gstm1基因型。雖然簡便，但是由於電泳操作必須開管加樣和電泳，容易造成實驗室汙染，難於在高通量下確保實驗可靠性。同時常規pcr電泳分析法也難於發現雜合子基因型，影響基因性狀分析的準確定。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種避免有毒dna染色劑汙染、提高檢測通量的基於定量pcr技術的gstm1分型檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
一種基於定量pcr技術的gstm1分型檢測方法，具體步驟如下：
（1）採用二代測序驗證的人gstm1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna作為相應對照物；
（2）採用gstm1基因特異性的引物seq1和seq2擴增gstm1基因片段，同時在gstm1基因特異性的引物界定的擴增區域內設計gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam；若存在gstm1基因，則gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam釋放fam螢光信號而被定量pcr儀器檢到；若沒有gstm1片段，則無gstm1擴增，無fam螢光信號釋放；
（3）採用albumin特異性的pcr引物seq4和seq5擴增albumin基因片段，同時在albumin基因特異性的引物界定的擴增區域內設計albumin基因特異性taqman探針seq6-vic；若存在合格樣本，則有albumin擴增，釋放vic螢光信號，定量pcr儀器檢測到vic螢光信號；若樣本不合格，則樣本無albumin擴增，無vic螢光信號釋放；
（4）對比擴增fam/vic信號確認待檢測樣本基因型；
所述引物seq1的核苷酸序列號如下：5´-cctggctgtctaaacagtcct-3´；
所述引物seq2的核苷酸序列號如下：5´-cactcactgtgcctgctcat-3´；
所述gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam的核苷酸序列號如下：
fam-5´-tgctgcccatccctgccctcacaacca-3´；
所述引物seq4的核苷酸序列號如下：5´-actccaaacctgatgcttct-3´；
所述引物seq5的核苷酸序列號如下：5´-ccttagggcagaattatcca-3´；
所述albumin基因特異性taqman探針seq6-vic的核苷酸序列號如下：
fam-5´-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3´。
作為本發明再進一步的方案：所述步驟（1）中人gstm1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna的濃度為10ng/μl。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
本發明採用基於taqman探針的定量pcr實現閉管一次檢測確定gstm1基因拷貝數的目的，解決了常規gstm1檢測需要pcr後開管電泳，而容易引起實驗室內pcr產物汙染，難於高通量穩定獲得準確基因分型結果的問題，同時簡化了pcr檢測方法，防止電泳檢測方法的操作過程複雜、存在潛在dna染料等環境汙染危險以及人為結果誤判的可能；可以有效預防pcr產物汙染，避免有毒dna染色劑汙染，可以大大簡化檢測與結果分析過程，提高檢測通量；另外，本發明也建立一種定量機制，提供鑑定發現雜合子的技術路線。
附圖說明
圖1為本發明實施例中albumin基因擴增和gstm1特異性片段擴增曲線示意圖。
具體實施方式
下面結合具體實施方式對本專利的技術方案作進一步詳細地說明。
請參閱圖1，一種基於定量pcr技術的gstm1分型檢測方法，具體步驟如下：
（1）採用二代測序驗證的濃度為10ng/μl的人gstm1正常純合子、雜合子和缺失純合子基因組dna作為相應對照物；
（2）採用gstm1基因特異性的引物seq1和seq2擴增gstm1基因片段，同時在gstm1基因特異性的引物界定的擴增區域內設計gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam；若存在gstm1基因，則gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam釋放fam螢光信號而被定量pcr儀器檢到；若沒有gstm1片段，則無gstm1擴增，無fam螢光信號釋放；
（3）採用albumin特異性的pcr引物seq4和seq5擴增albumin基因片段，同時在albumin基因特異性的引物界定的擴增區域內設計albumin基因特異性taqman探針seq6-vic；若存在合格樣本，則有albumin擴增，釋放vic螢光信號，定量pcr儀器檢測到vic螢光信號；若樣本不合格，則樣本無albumin擴增，無vic螢光信號釋放；
（4）對比擴增fam/vic信號確認待檢測樣本基因型；
所述引物seq1的核苷酸序列號如下：5´-cctggctgtctaaacagtcct-3´；
所述引物seq2的核苷酸序列號如下：5´-cactcactgtgcctgctcat-3´；
所述gstm1基因特異性taqman探針seq3-fam的核苷酸序列號如下：
fam-5´-tgctgcccatccctgccctcacaacca-3´；
所述引物seq4的核苷酸序列號如下：5´-actccaaacctgatgcttct-3´；
所述引物seq5的核苷酸序列號如下：5´-ccttagggcagaattatcca-3´；
所述albumin基因特異性taqman探針seq6-vic的核苷酸序列號如下：
fam-5´-cagcctgttgccccttttagagttcctttt-3´。
本發明基於基因特異性pcr結合taqman探針判斷基因片段存在時學界一致認為可靠的技術方法。採用albumin基因對照擴增也是學界一致認為的提示樣本質量和相對定量的參照體系。本發明採用的技術方案採用gstm1特異性的基因擴增和taqman探針，同時採用對照albumin基因對照擴增可以明確gstm1基因分型結果。基於taqman探針定量pcr方法不需要開管電泳，可以有效預防pcr產物汙染，避免有毒dna染色劑汙染，可以大大簡化檢測與結果分析過程，提高檢測通量。
實施例1
（1）測試用正常人基因組dna製備：採取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提製備，正常人基因組dna濃度稀釋到10ng/μl；
（2）pcr特異性引物和探針設計合成：根據人gstm1基因序列設計合成基因特異性引物seq1，seq2和gstm1特異性taqman基因探針標記fam；依據人albumin基因設計內參基因特異性pcr引物seq4，seq5和探針seq6標記vic；
（3）gstm1定量pcr檢測：
1）引物探針混合物配置：
2）反應體系：引物探針混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，標準模板1.5μl，ddh2o9.5μl。
3）定量pcr儀：abi7500
4）反應條件：95℃、2min；95℃、15s---60℃、32s，42循環。
（4）基因驗證結果讀取：
參見圖1，圖1是人gstm1正常檢測結果，albumin基因擴增曲線，gstm1特異性片段擴增曲線，橫坐標是以0-42的偶數標示的循環數，縱坐標是相應的螢光信號。
檢測到vic、fam信號確定為擴增成功；樣本fam/vic與三個對照樣本之一擴增fam/vic比值為3-6，確定為對應對應基因型；無法對應三個樣本之一或者對應多個則實驗失敗.
上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利並不限於上述實施方式，在本領域的普通技術人員所具備的知識範圍內，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。