一株蠟狀芽孢桿菌JK‑XZ3及其在防治櫻花根癌病中的應用的製作方法

2023-10-06 21:46:54 3

本發明屬於植物保護領域，尤其涉及一株蠟狀芽孢桿菌jk-xz3及其在防治櫻花根癌病中的應用。
背景技術：
：櫻花(cerasusmill.)是我國重要的觀賞花木，被廣泛用於美化公園、小區、道路等綠地，多年來櫻花苗木需求量大，產業市場前景廣闊。根癌病(crowngall)是由根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)引起的一種世界範圍的細菌性病害。該病寄主範圍廣，可危害93個科，331個屬，643個不同種的植物。患根癌病的植株表現葉黃，勢弱，果實產量或觀賞性下降，嚴重時能導致植株死亡。該病在歐洲、北美、非洲和亞洲的一些國家與地區普遍發生，我國主要分布在河北、遼寧、吉林、河南、山東、浙江和福建等省區。重茬苗圃發病率在20％—100％之間不等，有的甚至造成毀園。根癌病菌可長時間存活在土壤中，從植株的傷口侵入，隨苗木的調運進行遠距離傳播，是土傳加苗傳的細菌性病害。目前對櫻花根癌病的防治主要靠加強檢疫檢查和栽培管理，這些措施只能起到局部的控制作用，而生物防治不失為一種經濟、安全、有效的防治措施之一，其中拮抗細菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用。kerr(1972)從土壤桿菌中分離得到放射土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)k84菌株，這是應用較早且有效的生物製劑。k84本身無致瘤性，它的質粒可以合成一種細菌素agrocin84，抑制很多種有致病性的菌株，而對非致病性的菌株則無影響。另外，它還可以通過與病原菌競爭附著位點而控制病原菌的侵入。陳曉英(1986)等從山東啤酒花(humuluslupulus)冠癭瘤中分離出無致病性的hlb-2菌株，能產生細菌素抑制根瘤。同年，南非webster報導從南非李樹冠癭中分離到j73菌株，產細菌素，本身是致病菌，但對葡萄不致病，且可通過產細菌素來抑制葡萄根癌病的發生。王關林(2004)等以髮根土壤桿菌k84為供試菌株，對其進行紫外誘變，篩選出高產細菌素的wjk84-1菌株，通過櫻桃接瘤試驗表明，wjk84-1菌株和其產生的細菌素均可抑制根瘤發生，抑瘤率達到83.4％左右。陳凡(2007)等利用水生拉恩氏菌(rahnellaaquatilis)hx2菌株對葡萄根癌病進行了防治，防效達到80.2％。王樹芳(2013)等通過平板對峙方法篩選出耐氰放線菌(actinomycetessp.)g-19，對桃樹根癌病有較好防治效果。高之蕾(2015)等從桃樹根際土壤分離出兩株糞產鹼菌(alcaligenesfaecalis)，對根癌病抑制率達90％以上。目前報導的根癌病生防菌株很多，但是以芽孢桿菌為材料來防治根癌病未見報導。芽孢桿菌(bacillusspp.)是一類好氧或兼性厭氧杆狀菌，能產生抗逆性的芽孢，是典型的革蘭氏陽性菌。儘管發現芽孢桿菌已長達一個多世紀的時間，但是對它的研究仍有待進一步深入。在目前看來，大多數的研究集中於尋找特定基因功能並在需要的物種中克隆或者通過誘變、基因工程等生物手段改造它；還有研究熱點就是研究芽孢桿菌的抗菌物質。能產生抗菌物質的芽孢桿菌種類有：枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(b.cereus)、解澱粉芽孢桿菌(b.amyloquefaciens)、地衣芽孢桿菌(b.lichenifomis)、短小芽孢桿菌(b.pumilus)、蘇雲金芽孢桿菌(b.thuringiensis)、環狀芽孢桿菌(b.cirulans)和短芽孢桿菌(b.brevis)等。蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)是芽孢桿菌屬中具有生防應用價值的拮抗細菌之一。除了被用作微生物菌劑和微生物肥料外，蠟狀芽孢桿菌也能產生活性較強的酶類，加上有促進植物生長和增產的作用，因此在醫藥、食品和飼料工業，尤其在農林業上具有廣泛的應用價值。最常見的是蠟狀芽孢桿菌在農林業上用作生防製劑，但在防治櫻花根癌病方面未見報導。技術實現要素：發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一株高效防治櫻花根癌病的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3。本發明另一目的是提供上述蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的應用。技術方案：為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下：一株蠟狀芽孢桿菌，其分類命名為蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)jk-xz3，已保藏於中國典型培養物保藏中心cctcc，其保藏編號是：cctccno：m2017215，保藏日期：2017年4月27日，保藏地址為中國武漢武漢大學。所述的蠟狀芽孢桿菌在拮抗櫻花根癌病菌根癌土壤桿菌中的應用。所述的蠟狀芽孢桿菌在防治櫻花根癌病中的應用。所述的蠟狀芽孢桿菌在促進櫻花生長中的應用。所述的蠟狀芽孢桿菌的發酵液在拮抗櫻花根癌病菌根癌土壤桿菌中的應用。所述的蠟狀芽孢桿菌的發酵液在防治櫻花根癌病中的應用。所述的蠟狀芽孢桿菌的發酵液在促進櫻花生長中的應用。本發明提供的蠟狀芽孢桿菌，從櫻花根際土壤篩選獲得，其在牛肉膏蛋白腖培養基平板上菌落不規則毛玻璃狀，蠟白色，邊緣起伏，表面溼潤；菌體直杆狀，大小為3-4μm，常成短鏈；具橢圓形芽孢，且芽孢中生；革蘭氏染色表現為陽性；v.p試驗和伴孢晶體陰性；甲基紅試驗、澱粉水解、酪氨酸水解、過氧化氫、卵黃、檸檬酸鹽試驗均呈陽性。測得16srdna大部分序列1428bp，具體如seqidno.1所示。將所測16srdna序列通過blast比對，能在genbank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與jk-xz3菌株相似性最高的是bacilluscereus和bacillusthuringiensis，同源性都達到99％。構建進化樹發現，jk-xz3與bacilluscereus同屬一個遺傳分枝，親緣關係十分接近。biolog細菌自動鑑定系統以每種細菌形成各自特有的「代謝指紋」圖譜為鑑定依據，選用四唑紫作為細菌能否利用供試碳源的指示劑，通過細菌對95種不同碳源的代謝情況鑑定菌種。與傳統方法相比，該系統採用標準化程序，操作簡便，自動化程度高,鑑定快速，且菌種資料庫大，鑑定範圍廣，包括約2000種微生物，適合於環境、食品、工業、臨床和動植物病原菌各類微生物的鑑定分析。通過biolog系統對jk-xz3進行鑑定，該菌株在鑑定板培養16～24h時的讀數相似值(sim值)為0.503，大於0.50，符合biolog系統關於理想結果的要求，而且鑑定結果的相似性(prob)都為99％，因此該菌株利用biolog系統，準確鑑定到了種，為蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)，分類命名為：蠟狀芽孢桿菌(bacilluscereus)jk-xz3。有益效果：本發明與現有技術相比，具有如下優勢：1)蠟狀芽孢桿菌jk-xz3為植物根際土壤細菌，對櫻花根癌病菌抑制作用強，在植物病害生物防治中可起到重要的作用；該菌株繁殖速度快；並具有促進植物生長等優點，尤其是對櫻花根癌病的防治具有重要意義。2)蠟狀芽孢桿菌jk-xz3培養條件簡單、容易保存，易於工業化生產，便於生產應用，具有良好的開發應用前景。附圖說明圖1是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對根癌土壤桿菌平板生長抑制情況圖；圖中，a是單接種櫻花根癌病病原根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)的帶菌平板；b是在帶病原菌平板上打孔接種的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3；圖2是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3在溫室櫻花苗上的防治效果圖；圖中，a是單接種根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)；b是根癌土壤桿菌和蠟狀芽孢桿菌jk-xz3混接；圖3是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對田間櫻花根系生長的影響圖；圖中，(a，a)是agrobacteriumradiobacterk84菌劑處理；(b，b)是蠟狀芽孢桿菌jk-xz3處理；(c，c)是ck。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。以下實施例中，蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的斜面保存方法為：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基(na)：3g牛肉膏，5gnacl，10g蛋白腖，15g瓊脂；4℃冷庫長期保存。蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的活化方法為：牛肉膏蛋白腖(nb)：3g牛肉膏，5gnacl，10g蛋白腖；28℃恆溫搖床180r/min搖培24h。蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的發酵液製備方法為：nb培養基(25l)：75g牛肉膏，125gnacl，250g蛋白腖)，以50l自動發酵罐(上海國強公司生產)，按5％接種量，28℃發酵24h。蠟狀芽孢桿菌jk-xz3的菌懸液製備方法為：將發酵罐製備的發酵液和水1:5v/v稀釋，製得菌懸液。實施例1蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對櫻花根癌病原根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)平板抑菌作用。將na瓊脂培養基放入滅菌鍋滅菌(121℃/20min)，待na培養基冷卻到50℃時，將活化的櫻花根癌病原菌株與na瓊脂培養基按5％v/v均勻混合，製成帶菌平板，每個平板用8mm打孔器打三個孔，每個孔中用移液槍注入50ul活化的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3，放入28℃恆溫培養箱培養48h。觀察jk-xz3對病原菌生長的抑制情況(圖1)，測量菌落直徑，計算抑菌率(表1)。試驗結果表明，蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對根癌土壤桿菌有較強的抑制作用，與對照相比，抑菌率達到91.3％。表1jk-xz3對櫻花根癌病病原菌的抑制註：ck(a.tumefaciens)：病原菌單獨培養；jk-xz3+a.tumefaciens：蠟狀芽孢桿菌jk-xz3和病原菌共同生長。實施例2蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對溫室櫻花苗根癌病的防治效果。將一年生櫻花種植於滅菌土中，置於25℃溫室培養15d，選取長勢相近的櫻花進行接種(每個處理18個重複)。每株櫻花接櫻花根癌病原菌(na液體培養基，培養24h)2ml，接種斜面保存的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3於50ml錐形瓶中28℃/200rpm培養48h，測od600nm值，用無菌水將蠟狀芽孢桿菌稀釋到濃度1×108cfu，製成菌懸濁液備用，用無菌手術刀於櫻花主根劃1cm創口，以無菌棉球吸取根癌土壤桿菌包裹於創口處；7d後用無菌移液管吸取10ml蠟狀芽孢桿菌懸濁液緊貼櫻花苗根系將其注入土壤，然後覆土填平至塑料盆。以單接根癌土壤桿菌的櫻花苗作為發病對照，6個月後觀察並統計櫻花的發病率和病瘤直徑。試驗結果表明蠟狀芽孢桿菌jk-xz3在溫室櫻花苗根癌病防治上有顯著的效果(表2、圖2)。表2蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對溫室櫻花苗根癌病的防治效果註：a.tumefaciens：單接種病原菌；a.tumefaciens+jk-xz3：病原菌和拮抗菌混接。實施例3蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對田間櫻花根癌病的防治效果。將蠟狀芽孢桿菌jk-xz3活化後，製備發酵培養基(25l：75g牛肉膏，125g氯化鈉，250g蛋白腖)，以50l自動發酵罐(上海國強公司生產)按5％接種量發酵24h，製成的蠟狀芽孢桿菌jk-xz3發酵液濃度約為1×108cfu/ml。以10l無菌桶封裝放4℃恆溫冷藏室備用，並且購買市售對根癌病防效好的放射土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)k84菌劑(購自中國農業大學)作為防效對照。田間防治試驗首先選取三年生長勢相似且感病的櫻花(每個處理50株)，起根並去除根部土壤，用滅菌手工刀對櫻花根部病瘤進行人工切除，傷口處用75％酒精消毒。將供試拮抗細菌發酵液與水1:5稀釋(使土壤中細菌密度約為107cfu/ml)後加少許土拌成泥漿對傷口進行塗抹，種植一個月後，將菌株jk-xz3發酵液與水1:5稀釋成菌懸濁液進行復施處理。復施：在每株櫻花根部離主徑20cm處挖15cm深土坑，將菌懸濁液以500ml/株灌根，之後覆土，以切瘤但不施用菌劑處理的櫻花作為發病對照。6個月後起根調查不同處理櫻花發病率(表3)。試驗結果表明，相對於k84菌劑處理的櫻花，jk-xz3處理的發病率更低，說明蠟狀芽孢桿菌jk-xz3在田間櫻花根癌病防治上有顯著的效果。表3不同處理櫻花根癌病發病狀況實施例4蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對促進田間櫻花生長的作用。具體方法步驟同實施例3，處理6個月後測量櫻花的樹高(cm)和胸徑(mm)，試驗結果表明：相較於未施菌處理的櫻花和k84菌劑處理的櫻花，蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對櫻花生長有促進作用，尤其在樹高生長方面有顯著促進作用(圖3、表4)。表4蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對櫻花生長的影響處理樹高/cm高增長量/％胸徑/mm徑增長量/％k84330.75±3.10b1.7249.38±0.61a5.13jk-xz3352.00±2.32a8.2647.26±0.41b0.62ck325.15±2.75b046.97±0.39b0實施例5：蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對模式植物苜蓿的接種試驗。將jk-xz2接種到nb培養基中，28℃下震蕩(180mrp)培養24h，用無菌水調節菌懸液濃度到109cfu/ml左右用於接種。用laura的方法準備要接種的苜蓿種子(lauraetal.，2002)。將紫花苜蓿種子用98％濃硫酸浸泡20分鐘(約10ml浸300顆種子)，用500ml滅菌水清洗4次，然後泡在60ml滅菌水中，32℃下震蕩(150prm)浸種6～8小時，再清洗2次，換水後同樣條件培養過夜。次日再用滅菌水清洗2次後(每次60ml水)，用無菌鑷子擺放到1％的水瓊脂平板上等待接種，每皿擺放20顆種子。7d後將水瓊脂平板上的苜蓿幼苗用接種針在子葉上刺一個小孔，取20ml準備好的菌懸液點在傷口處，每菌株接種3個重複，每重複20株幼苗，設2種ck處理，其中1個不作任何處理，另l個針刺接種無菌水。接種後的種子在37℃、70％相對溼度、定時光照(12h光照，12h黑暗)條件的人工氣候箱中培養，7天後檢查發病率。苜蓿接種結果顯示，無論是ck還是接種處理，均無發病症狀(接種點附近壞死、黃化和根畸)出現。苜蓿是代替小白鼠作為測定bcc對動物毒性的模式植物(steveetal.，2003)，用苜蓿模型可簡單快捷的檢測出bcc菌株對哺乳動物是否具有致病性。上述試驗結果說明蠟狀芽孢桿菌jk-xz3對哺乳動物沒有毒害性。sequencelisting南京林業大學一株蠟狀芽孢桿菌jk-xz3及其在防治櫻花根癌病中的應用1001patentinversion3.311428dnabacilluscereus1gcggctggctccaaaaaggttaccccaccgacttcgggtgttacaaactctcgtggtgtg60acgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattac120tagcgattccagcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaacggtttt180atgagattagctccacctcgcggtcttgcagctctttgtaccgtccattgtagcacgtgt240gtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgt300caccggcagtcaccttagagtgcccaacttaatgatggcaactaagatcaagggttgcgc360tcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacct420gtcactctgctcccgaaggagaagccctatctctagggttttcagaggatgtcaagacct480ggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccc540cgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtgcttaatgcg600ttaacttcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgtttacggcgt660ggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcagtgtcagtta720cagaccagaaagtcgccttcgccactggtgttcctccatatctctacgcatttcaccgct780acacatggaattccactttcctcttctgcactcaagtctcccagtttccaatgaccctcc840acggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccacctgcgcgcgctttacgcc900caataattccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttag960ccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccagcttattcaactagcacttgttctt1020ccctaacaacagagttttacgacccgaaagccttcatcactcacgcggcgttgctccgtc1080agactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtg1140tctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttgccttggtga1200gccgttacctcaccaactagctaatgcgacgcgggtccatccataagtgacagccgaagc1260cgcctttcaatttcgaaccatgcagttcaaaatgttatccggtattagccccggtttccc1320ggagttatcccagtcttatgggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaac1380ttcataagagcaagctcttaatccattcgctcgacttgcagtataggc1428當前第1頁12