一種利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法與流程
2023-10-06 22:02:24 1
技術領域
本發明涉及植物組織培養技術領域，具體涉及一種利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法。
背景技術：
油菜作為世界上第三大油料作物，滿足了全世界至少13%的食用油的需求。而我國的產量位居世界首位，具有較高的經濟價值。我國栽培的油菜主要有白菜型油菜（Brassica rapa，n=10）、芥菜型油菜（Brassica juncea，n=18）和甘藍型油菜（Brassica napus，n=19）三大類型。其中因甘藍型油菜的產量高、抗性強、品質優、口感好等特性，自引入我國後被大力推廣，種植面積迅速擴增，也是目前國內油菜育種工作者主要的研究對象。在常規油菜品種選育過程中，要育成一個穩定的自交系，至少需要5年。然而，通過油菜小孢子胚胎再生技術，易於進行早期選擇，可以在較短的時間裡獲得純合的育種材料，顯著縮短了育種年限。利用小孢子培養途徑比傳統選育途徑具有明顯的優勢。通過小孢子培養得到的單倍體植株有利於篩選隱性突變體，提高選擇效率，有利於隱性基因控制性狀的選擇；還可以快速獲得自交系的超雄株，構建DH群體作為遺傳圖譜的構圖群體等。因此，建立高效快速的油菜小孢子培養體系具有十分重要的應用價值，是植物基因工程的一個新研究方向。自Licther等（1982）首次報導甘藍型油菜小孢子培養並獲得再生植株以來，許多相關研究者對影響油菜小孢子培養及胚狀體再生的諸多因素進行了研究，包括培養基組成和培養條件、供體植株基因型及其生長條件、小孢子發育時期等。但培養基成分中的滲透調節劑的研究鮮有報導。因此，尋找一種更加適合的滲透調節劑對於甘藍型油菜小孢子的培養顯得極其重要。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法，該方法小孢子出胚率高，小孢子胚狀體植株再生率高，加倍率高，大大增加了培養的效率。
本發明的目的通過下述技術方案實現：
一種利用甘露醇作為滲透調節劑的油菜小孢子培養方法，包括以下步驟：
（1）取甘藍型油菜作為小孢子培養的供體植株。
（2）從供體植株開花後的花序上取花蕾並滅菌，再將滅菌後的花蕾加入到NLN-13液體培養基中，研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉澱；在沉澱中加入含甘露醇的NLN液體培養基將小孢子細胞密度調至3×105～5×105個細胞/mL，再加入30～50µL秋水仙鹼溶液和50～150µL活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。
所述的NLN-13液體培養基，以1L計，組成為： NLN液體培養基1L，蔗糖130g，pH 5.6～6.2。所述的含甘露醇的NLN液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L和蔗糖1～65g，甘露醇18.3～73g，pH 5.6～6.2。所述的秋水仙鹼溶液的質量百分濃度為0.3～0.8%，將秋水仙鹼加到NLN-13液體培養基中配製得到；所述的活性炭混合液，以1L計，組成為：NLN-13液體培養基1L，瓊脂糖2～5g和活性炭8～15g。
（3）將小孢子混合懸浮液在黑暗條件下於30～33℃恆溫熱激處理0～3天，取出在黑暗條件下於22～28℃培養10～15天（直至肉眼可見胚狀體時），再在黑暗條件下於22～28℃搖動培養5～10天，得到子葉期胚狀體。
（4）將子葉期胚狀體接種至再生培養基中，在每天12～18小時光照、光照強度1000～2000lux和22～28℃條件下培養，形成再生芽。其中，所述再生培養基，以1L計，組成為：MS液體培養基1L，細胞分裂素1～1.5mg，蔗糖20～30g，瓊脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。
（5）切取再生芽接種至生根培養基上，在每天12～18小時光照、光照強度2000～3000lux和22～28℃條件下進行生根培養。將根生長健壯的苗經煉苗和移栽到土壤中，得到再生植株，鑑定倍性。其中，所述生根培養基，以1L計，組成為：MS液體培養基1L，萘乙酸（NAA）0.5～1mg，蔗糖20～30g，瓊脂粉6.5～8.5g，pH5.6～6.0。
本發明中：
所述的NLN液體培養基，以1L計，組成為：KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，維生素B1 0.5mg，維生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，葉酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，煙酸5mg，L-穀氨醯胺800mg，穀胱甘肽30mg，絲氨酸100mg和餘量的無菌水，pH 5.6～6.2。
所述MS液體培養基，以1L計，組分為：NaH2PO4·H2O 150mg，CaCl2 113.24mg，KI 0.75mg，KNO3 2500mg，（NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 125mg，H3BO33.0mg，MnSO4·H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 2mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O0.025mg，10mg維生素B1，1mg維生素B6，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，煙酸1mg，1L無菌水；
所述的滅菌採用本領域常規的滅菌方法，可採用次氯酸鈉溶液通過表面消毒法將花蕾滅菌15～30分鐘，無菌水清洗3～5遍後得到滅菌後的花蕾。所述次氯酸鈉溶液，以1L計，組成為：次氯酸鈉56～100mL、無水乙醇100mm、洗潔精8～10滴和餘量用無菌水補齊。配製的次氯酸鈉溶液的體積百分濃度為5.6～10%。
優選的技術方案中：
步驟（2）中，所述的花蕾為長度2～4mm、花粉母細胞處於單核晚期至雙核早期，花蕾數目為80～100個。
步驟（2）中，所述的研磨、離心、棄上清及用NLN-13液體培養基重懸浮小孢子細胞的操作可以重複進行1～2次，即步驟（2）的具體步驟可以如下：從供體植株上取適宜的花蕾並滅菌，再將滅菌後的花蕾加入到NLN-13液體培養基中研磨成懸浮液，過濾所得濾液經離心、棄上清液得到沉澱；在沉澱中再次加入NLN-13液體培養基研磨成懸浮液，再次過濾所得濾液經離心、棄上清液，再次得到沉澱；在沉澱中先加入10～20mL含甘露醇的NLN液體培養基，在顯微鏡下利用血細胞計數器計算小孢子細胞濃度，用一定量的含甘露醇的NLN液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105～5×105個細胞/mL，再加入秋水仙鹼溶液和活性炭混合液，得到小孢子混合懸浮液。
步驟（2）中，所述的過濾可採用44µm無菌濾網。
步驟（2）中，所述的離心的條件一般為：900～1200rpm離心3～5min。
步驟（3）中，所述的小孢子混合懸浮液在黑暗條件下於30～33℃恆溫熱激處理，熱激後的小孢子懸浮液能夠更促進小孢子細胞的胚胎發生。
步驟（3）中，所述的子葉期胚狀體可放入3～8℃冰箱中冷藏保存，以延長胚狀體的保存期限。
步驟（3）中，在黑暗條件下的培養溫度優選為25±2℃，即：在黑暗條件下25±2℃於培養至肉眼可見胚狀體時，再在黑暗條件下於25±2℃條件下搖動培養。在黑暗條件下搖動培養相對於不搖動培養的小孢子吸收營養更充分，因此胚生長得較迅速以及較健壯。
步驟（4）中，所述的培養條件優選為：每天16小時光照和25℃下培養。一般培養時間為20～30天。
步驟（4）中，所述的子葉期小孢子胚狀體接種到再生培養基上，只需要留下已經直接成苗的幼芽，其他愈傷組織都不再保留，這樣既保證了苗的質量也避免了不必要的時間浪費。
步驟（5）中，所述的再生芽（即直接成苗的幼苗）接種到生根培養基上，培養條件為：每天16小時光照和25℃下培養。一般培養時間為25～30天。
步驟（5）中，移栽時用蒸餾水洗淨組培苗根部培養基，剪去較長的根，以便於移栽。隨後植於裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保溼5～7天，在溫室中培養15～20天後移栽到大的盆缽中。
步驟（5）中，所述的鑑定採用本領域常用的倍性鑑定方法，如取再生植株最嫩的葉片檢測各再生植株倍性。可用美國BD公司的BD FACSCanto流式細胞儀進行倍性分析鑑定。
本發明中，採用含甘露醇的NLN液體培養基，以甘露醇部分代替NLN-13液體培養基中的蔗糖。甘露醇是一種高度溶於水的無毒中性化合物，熱水條件下溶解度更高，是一種非常常用的高滲物質，能夠營造出有利的一個低水勢的培養環境。在NLN-13液體培養基中減少蔗糖含量，並加入一定量的甘露醇作為滲透調節物，產生的胚胎比現有技術中完全用蔗糖培養的要大一些，再生植株的能力有所增強。由含甘露醇的NLN液體培養基誘導的小孢子植株的加倍率高於常規方法（43～52%），而完全用蔗糖作為滲透調節劑的NLN-13液體培養基中只有2～18%的植株會發生自發加倍。
可見，本發明在小孢子胚胎發生過程中採用含甘露醇的NLN液體培養基，以甘露醇部分代替NLN-13液體培養基中的蔗糖（甘露醇的質量百分濃度從6.25%遞增到25%，相應地，蔗糖的質量百分濃度從6.5%遞減到0.1%），始終保持0.1%含量的蔗糖以保證碳元素的供給量，超過部分的蔗糖作為滲透調節劑與甘露醇一起將溶液的滲透壓保持衡定，取得更好的培養效果。此外，在小孢子游離過程中加入秋水仙鹼溶液與常規的浸泡再生植株根部的方法相比，加倍率比較高，而且用量少，汙染小。
與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：
採用易出胚的油菜品種作為供體植株，以甘露醇部分代替NLN-13液體培養基中蔗糖的作用，在保證碳元素供給的條件下，利用甘露醇代替或者部分代替蔗糖的滲透調節作用，提供了一種新型的油菜小孢子培養方法。本發明方法培養出的油菜出胚率最高達32個/蕾，小孢子培養技術的利用效率高。經觀察記錄數據以及流式細胞儀檢測發現，甘露醇法培養的小孢子胚狀體植株再生率高達94.3%，加倍率能夠達到52.4%，比常規的80%左右再生率及2～18%的加倍率要高，效果好。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1
（1）培養基配製
① NLN液體培養基，以1L計，組成為：KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg，MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 10mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，維生素B1 0.5mg，維生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，葉酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，煙酸5mg，L-穀氨醯胺800mg，穀胱甘肽30mg，絲氨酸100mg和餘量的無菌水，過濾滅菌。
② NLN-13液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L和蔗糖130g，pH 6.0，過濾滅菌。
③含甘露醇36.5g/L的NLN液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L，甘露醇36.5g，蔗糖65g，pH6.0，過濾滅菌。
④ MS液體培養基，以1L計，組成為：NaH2PO4·H2O 150mg，CaCl2 113.24mg，KI 0.75mg，KNO3 2500mg，（NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 125mg，H3BO33.0mg，MnSO4·H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 2mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，10mg維生素B1，1mg維生素B6，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，煙酸1mg，1L無菌水。
⑤再生培養基，以1L計，組成為：MS液體培養基1L，細胞分裂素1.5mg，蔗糖25g，瓊脂粉6.5g，pH5.8，高溫高壓滅菌。
⑥生根培養基，以1L計，組成為：MS液體培養基1L，萘乙酸（NAA）1.0mg，蔗糖25g，瓊脂粉6.5g，pH5.8，高溫高壓滅菌。
（2）利用甘露醇作為滲透調節劑的小孢子培養方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養的供體植株；取花序上花瓣和花葯長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精10滴+無菌水配製成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的油菜花蕾放入無菌培養皿中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒15分鐘，再在超淨工作檯上用無菌水蕩洗5次後，備用。
3）在超淨工作檯上將40個滅菌後的油菜花蕾置於無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養基至30mL；該懸浮液用44µm無菌濾網過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm離心3min，離心後倒掉上清液，往沉澱中加入5mL NLN-13液體培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉澱；向沉澱中加入含甘露醇36.5g/L的NLN液體培養基10mL，在顯微鏡下利用血細胞計數器，計算小孢子細胞濃度，再用一定量的含甘露醇36.5g/L的NLN液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105個細胞/mL後，加入40µL秋水仙鹼溶液（質量百分濃度為0.5%）及100µL高壓滅菌後的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養皿中，每60mm培養皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋後用parafilm®封口膜（美國parafilm公司）封口，後置於30℃恆溫生化培養箱裡、黑暗條件下熱激處理2天，然後取出置於25℃恆溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養至肉眼可見胚狀體時，置於25℃搖床上、黑暗條件下搖動培養10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養基中，在每天16小時光照、光照強度1000lux、25℃條件下培養20～25天，直接形成再生幼芽。
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、光照強度2000lux、25℃條件下進行生根培養；25～30天後將根生長健壯的苗用蒸餾水洗淨組培苗根部培養基，剪去較長的根，以便於移栽。隨後植於裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保溼5天，在溫室中培養15天後移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細胞儀進行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結果：小孢子出胚率為32個/蕾，經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，小孢子胚狀體的植株再生率為高達88.5%，加倍率達67.8%。
實施例2
（1）培養基配製
① NLN液體培養基，同實施例1。
② NLN-13液體培養基，同實施例1。
③含甘露醇54.8g/L的NLN液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L，54.8g甘露醇，蔗糖32.5g，pH 6.0，過濾滅菌。
④MS液體培養基，同實施例1。
⑤再生培養基，同實施例1。
⑥生根培養基，同實施例1。
（2）利用甘露醇作為滲透調節劑的小孢子培養方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養的供體植株；取花序上花瓣和花葯長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精8滴+無菌水配製成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒15分鐘，再在超淨工作檯上用無菌水蕩洗5次後，備用。
3）在超淨工作檯上將40個滅菌後的油菜花蕾置於無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養基至30mL；該懸浮液用44µm無菌濾網過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心後倒掉上清液，往沉澱中加入5mL NLN-13液體培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉澱；向沉澱中加入含甘露醇54.8g/L的NLN液體培養基10mL，在顯微鏡下利用血細胞計數器，計算小孢子細胞濃度，再用一定量的含甘露醇54.8g/L的NLN液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105個細胞/mL後，加入40µL秋水仙鹼溶液（質量百分濃度為0.5%）及100µL高壓滅菌後的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養皿中，每60mm培養皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋後用parafilm®封口膜（美國parafilm公司）封口，後置於30℃恆溫生化培養箱裡、黑暗條件下熱激處理2天；然後取出置於25℃恆溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養至肉眼可見胚狀體時，置於25℃搖床上、黑暗條件下搖動培養10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養基中，在每天16小時光照、光照強度1000lux、25℃條件下培養20～25天，直接形成再生幼芽。
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、光照強度2000lux、25℃條件下進行生根培養；25～30天後將根生長健壯的苗用蒸餾水洗淨組培苗根部培養基，剪去較長的根，以便於移栽。隨後植於裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保溼5天，在溫室中培養15天後移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細胞儀進行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結果：小孢子出胚率為30個/蕾，經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，小孢子胚狀體的植株再生率高達89.1%，加倍率達47.6%。
實施例3
（1）培養基配製
①NLN液體培養基，同實施例1。
②NLN-13液體培養基，同實施例1。
③含甘露醇73g/L的NLN液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L，73g甘露醇，蔗糖1g，pH6.0，過濾滅菌。
④MS液體培養基，同實施例1。
⑤再生培養基，同實施例1。
⑥生根培養基，同實施例1。
（2）利用甘露醇作為滲透調節劑的小孢子培養方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養的供體植株；取花序上花瓣和花葯長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配製成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒15分鐘，再在超淨工作檯上用無菌水蕩洗5次後，備用。
3）在超淨工作檯上將40個滅菌後的油菜花蕾置於無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養基至30mL；該懸浮液用44µm無菌濾網過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心後倒掉上清液，往沉澱中加入5mL NLN-13液體培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉澱；向沉澱中加入含甘露醇73g/L的NLN液體培養基10mL，在顯微鏡下利用血細胞計數器，計算小孢子細胞濃度，再用一定量的含甘露醇73g/L的NLN液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105個細胞/mL後，加入40µL秋水仙鹼溶液（質量百分濃度為0.8%）及100µL高壓滅菌後的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養皿中，每60mm培養皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋後用parafilm®封口膜（美國parafilm公司）封口，後置於30℃恆溫生化培養箱裡、黑暗條件下熱激處理2天；後取出置於25℃恆溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養至肉眼可見胚狀體時，置於25℃搖床上、黑暗條件下搖動培養10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養基中，在每天16小時光照、光照強度1000lux、25℃條件下培養20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、光照強度2000lux、25℃條件下進行生根培養；25～30天後將根生長健壯的苗用蒸餾水洗淨組培苗根部培養基，剪去較長的根，以便於移栽。隨後植於裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保溼5天，在溫室中培養15天後移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細胞儀進行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結果：小孢子出胚率為24個/蕾，經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，小孢子胚狀體植株再生率高達94.3%，加倍率達52.4%。
實施例4
（1）培養基配製
①NLN液體培養基，同實施例1。
②NLN-13液體培養基，同實施例1。
③含甘露醇73g/L的NLN液體培養基，以1L計，組成為：NLN液體培養基1L，73g甘露醇，蔗糖1g，pH6.0，過濾滅菌。
④MS液體培養基，同實施例1。
⑤再生培養基，同實施例1。
⑥生根培養基，同實施例1。
（2）利用甘露醇作為滲透調節劑的小孢子培養方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養的供體植株；取花序上花瓣和花葯長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配製成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒15分鐘，再在超淨工作檯上用無菌水蕩洗5次後，備用。
3）在超淨工作檯上將40個滅菌後的油菜花蕾置於無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養基至30mL；該懸浮液用44µm無菌濾網過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心後倒掉上清液，往沉澱中加入5mL NLN-13液體培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉澱；向沉澱中加入含甘露醇73g/L的NLN液體培養基10mL，在顯微鏡下利用血細胞計數器，計算小孢子細胞濃度，再用一定量的含甘露醇73g/L的NLN液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105個細胞/mL後，加入40µL秋水仙鹼溶液（質量百分濃度為0.8%）及100µL高壓滅菌後的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養皿中，每60mm培養皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋後用parafilm®封口膜（美國parafilm公司）封口，不用30℃熱激處理，直接置於25℃恆溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養至肉眼可見胚狀體時，置於25℃搖床上、黑暗條件下搖動培養10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養基中，在每天16小時光照、光照強度1000lux、25℃條件下培養20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、光照強度2000lux、25℃條件下進行生根培養；25～30天後將根生長健壯的苗用蒸餾水洗淨組培苗根部培養基，剪去較長的根，以便於移栽。隨後植於裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保溼5天，在溫室中培養15天後移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細胞儀進行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結果：小孢子出胚率為22個/蕾，經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，小孢子胚狀體植株再生率高達91.6%，加倍率達50.1%。
實施例5
（1）培養基配製
①NLN液體培養基，同實施例1。
②NLN-13液體培養基，同實施例1。
③MS液體培養基，同實施例1。
④再生培養基，同實施例1。
⑤生根培養基，同實施例1。
（2）利用蔗糖作為滲透調節劑的小孢子培養方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養的供體植株；取花序上花瓣和花葯長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配製成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒15分鐘，再在超淨工作檯上用無菌水蕩洗5次後，備用。
3）在超淨工作檯上將40個滅菌後的油菜花蕾置於無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養基至30mL；該懸浮液用44µm無菌濾網過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心後倒掉上清液，往沉澱中加入5mL NLN-13液體培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉澱；向沉澱中加入NLN-13液體培養基10mL，在顯微鏡下利用血細胞計數器，計算小孢子細胞濃度，再用NLN-13液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105個細胞/mL後，加入40µL秋水仙鹼溶液（質量百分濃度為0.8%）及100µL高壓滅菌後的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養皿中，每60mm培養皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋後用parafilm®封口膜（美國parafilm公司）封口，後置於30℃恆溫生化培養箱裡、黑暗條件下熱激處理2天；後取出置於25℃恆溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養至肉眼可見胚狀體時，置於25℃搖床上、黑暗條件下搖動培養10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養基中，在每天16小時光照、光照強度1000lux、25℃條件下培養20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、光照強度2000lux、25℃條件下進行生根培養；25～30天後將根生長健壯的苗用蒸餾水洗淨組培苗根部培養基，剪去較長的根，以便於移栽。隨後植於裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保溼5天，在溫室中培養15天後移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細胞儀進行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結果：小孢子出胚率為48個/蕾，經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，小孢子胚狀體植株再生率達43.2%，加倍率達38.6%。
實施例6
（1）培養基配製
①NLN液體培養基，同實施例1。
②NLN-13液體培養基，同實施例1。
③MS液體培養基，同實施例1。
④再生培養基，同實施例1。
⑤生根培養基，同實施例1。
（2）利用蔗糖作為滲透調節劑的小孢子培養方法
1）供體植株花蕾的選擇：取甘藍型油菜生長健康、無病蟲害的初花期的花序作為小孢子培養的供體植株；取花序上花瓣和花葯長度比在0.5、單核晚期至雙核早期的花蕾40個。
2）花蕾的滅菌：用次氯酸鈉56mL/L+無水乙醇100mL/L+洗潔精9滴+無菌水配製成的體積百分濃度為5.6%的次氯酸鈉水溶液滅菌液；把步驟（1）取得的花蕾放入無菌小瓶中，加入50mL次氯酸鈉水溶液滅菌液，放到搖床上搖動進行表面消毒15分鐘，再在超淨工作檯上用無菌水蕩洗5次後，備用。
3）在超淨工作檯上將40個滅菌後的油菜花蕾置於無菌燒杯中，加入5mL NLN-13液體培養基，用滅過菌的平頭玻璃棒擠碎、研磨成懸浮液，加入新鮮NLN-13液體培養基至30mL；該懸浮液用44µm無菌濾網過濾到50mL離心管中，蓋緊，900rpm/min離心3min，離心後倒掉上清液，往沉澱中加入5mL NLN-13液體培養基，按上述方法再離心2次，棄上清液，再次得到沉澱；向沉澱中加入NLN-13液體培養基10mL，在顯微鏡下利用血細胞計數器，計算小孢子細胞濃度，再用NLN-13液體培養基將小孢子細胞濃度調至3×105個細胞/mL後，加入40µL秋水仙鹼溶液（質量百分濃度為0.8%）及100µL高壓滅菌後的活性炭混合液（1L活性炭混合液的組成為：NLN液體培養基1L、瓊脂糖2g和10g活性炭），得到小孢子混合懸浮液。
4）將該小孢子混合懸浮液分裝到60mm玻璃無菌培養皿中，每60mm培養皿加4mL小孢子混合懸浮液，加蓋後用parafilm®封口膜（美國parafilm公司）封口，不用30℃熱激處理，直接置於25℃恆溫培養箱中、黑暗條件下繼續培養至肉眼可見胚狀體時，置於25℃搖床上、黑暗條件下搖動培養10～15天得到子葉期胚狀體，放入4℃冰箱中冷藏保存。
5）將子葉期胚狀體接種至再生培養基中，在每天16小時光照、光照強度1000lux、25℃條件下培養20～25天，直接形成再生幼芽；
6）切取生長健康的再生幼芽接種至生根培養基上，在每天16小時光照、光照強度2000lux、25℃條件下進行生根培養；25～30天後將根生長健壯的苗用蒸餾水洗淨組培苗根部培養基，剪去較長的根，以便於移栽。隨後植於裝有滅菌土的穴盤中，塑料膜罩住保溼5天，在溫室中培養15天後移栽到大的盆缽中，得到再生植株。
7）取再生植株的嫩葉，用美國BD公司的BD FACSCanto流式細胞儀進行倍性分析，檢測各植株倍性，僅保存雙單倍體植株。
結果：小孢子出胚率為5個/蕾，經肉眼觀察及流式細胞儀檢測發現，小孢子胚狀體植株再生率達38.7%，加倍率達40.6%。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。