一種大豆矮杆性狀緊密連鎖的SNP標記及其應用的製作方法

2023-10-25 05:39:31

本發明屬於基因工程技術領域，具體涉及一種大豆矮杆性狀緊密連鎖的SNP標記及其應用。

背景技術：

作物矮杆性狀的應用實現了第一次綠色革命，是高產育種的第一個裡程碑。自1967年，大豆矮稈性狀應用於育種後，世界範圍內不斷創造大豆高產紀錄(Cooper，1981，Cooper，1991)，因此矮杆性狀已成為大豆育種的一個重要研究內容。然而在大豆育種中，雖然植株高矮很容易肉眼鑑別，但由於水、肥、種植密度和生育期等因素影響比較嚴重，尤其在育種早世代單株選擇時，矮杆性狀的鑑定不夠方便和準確。

隨著生物技術的發展，分子標記技術應用於作物育種，加快了作物育種的效率。分子標記技術能夠對目標性狀的基因型進行鑑定，不受環境，生育時期等很多限制。大豆矮杆性狀屬於簡單質量遺傳性狀，是由一對或兩對隱形主效基因控制的(kilen，1975；Boerma)，有的還伴若干修飾基因控制(何平，陳恆鶴，W.R.Feh)。因此，利用矮杆性狀連鎖的分子標記進行矮杆性狀的鑑定是可行的。

目前，關於矮杆基因的遺傳定位研究，目前利用矮杆或半矮稈材料進行了較多株高性狀QTL定位。統計大豆資料庫發現，在A1、B1、C1、C2、D1a、D1b、E、F、G、H、I、J、L、M、N和O等16條染色體上大約有31個QTL，其中在B1(47Mb-72Mb)，C2(106Mb-131Mb)，F(1Mb-22.5Mb，60Mb-85Mb)，J(11Mb-28Mb)，L(8Mb-15Mb)，65Mb-93Mb)，M(17Mb-41Mb)位點，在不同遺傳群體裡，發現了共性的QTL。但由於目前針對矮杆質量性狀進行的基因定位研究還未見報導，因此，我們對大豆矮杆的分子遺傳和機制還不了解。

現有大豆矮杆性狀的鑑定技術或方法是在大豆開花後期，株高穩定了，通過肉眼去鑑定是否為矮杆材料；鑑定受時間和生育時期的限制。另外，由於株高受栽培密度、機械損傷，田間降水等環境條件的影響，僅僅調查一株不能準確判斷是高還是矮，必須群體調查準確；在矮杆育種中，由於矮杆是隱性基因控制的，僅佔分離群體的1/2[1-(1/2)r]，如在育種早世代進行選育，育種群體中表現為矮杆材料較少，因此，育種規模要比較大，才能夠篩選出優良的矮杆育種材料，育種成本高，育種效率低。

技術實現要素：

為了解決上述現有技術中存在的問題，本發明提供了一種大豆矮杆性狀緊密連鎖的SNP標記，及其該標記用於篩選矮杆性狀大豆材料的應用和方法。

本發明主要通過以下技術方案實現：

一種大豆矮杆性狀緊密連鎖的SNP標記，根據本發明的實施例，所述的SNP標記包含：第一SNP標記GM19_45000827和第二SNP標記GM19_45361938，所述的第一SNP標記GM19_45000827為大豆基因組v1.0的第19號染色體45000827位置的鹼基為C或A；所述的第二SNP標記GM19_45361938為大豆基因組v1.0的第19號染色體44902890位置的鹼基為G或A。

本發明所述的GM19_45000827處鹼基是C的大豆為矮杆，鹼基是A的大豆為高杆；所述的GM19_45361938處鹼基是G的大豆為矮杆，鹼基是A的大豆為高杆。

本發明的另一個目的，本發明還提供了一種用於檢測前面所述的SNP標記的KASP引物對，具體的所述的引物對包括：

GM19_45000827的正向引物1：ACATGCCTACCAACAAAAG，正向引物2：CGGTGTAGTTCGGGAAACAA，反向引物：CGGTGTAGTTCGGGAAACAC；

GM19_45361938的正向引物1：AGATTCCCAGGCGCAACTTG，正向引物2：AGATTCCCAGGCGCAACTTA，反向引物：TTTGTAGCTTCTGTTTATAG。

利用本發明的引物對能夠有效地對待測大豆的上述與大豆矮杆性狀相關的SNP標記所在的片段進行PCR擴增，進而通過檢測PCR產物的螢光信號，確定待測大豆該種SNP標記位點的基因型，進而能夠有效預測待測大豆矮杆性狀。

本發明的另一個目的，本發明還提供了用於檢測前面所述的SNP標記的試劑盒，該試劑盒包含前面所述的用於檢測本發明的SNP標記的引物對，即本發明試劑盒包含具有SEQ ID NO：1-6所示的核苷酸序列的引物對。

本發明的另一個目的，本發明還提供了前面所述的本發明的SN P標記、引物對或試劑盒在大豆矮杆性狀分子標記輔助育種中的應用。

本發明的另一個目的，本發明還提供了一種篩選具有矮杆性狀的大豆材料的方法，其步驟如下：

1)提取待檢測大豆基因組DNA；

2)檢測：以待檢測大豆基因組DNA為模板，利用前面所述的引物進行PCR擴增反應；

3)結果判斷：利用LightCycler 480軟體(v1.5)的Endpoint分析模塊檢測PCR擴增產物，根據信號表現區分基因型。其中，綠信號與公交9112基因型一致，是高杆基因型。藍信號與吉密豆1號基因型一致，是矮杆基因型；紅信號為雜合基因型，下代高矮杆分離；粉色和其它為基因型不確定或樣品缺失。

其中，第一標記GM19_45000827的檢測矮杆準確率為96.77％，第二標記GM19_45361938檢測矮杆準確率為93.48％。

本發明的有益效果：

1)簡化基因組法遺傳定位到2個與大豆矮杆性狀連鎖最為緊密的SNP標記，利用這兩個SNP標記結合KASP PCR技術，能夠從基因型上鑑定矮稈性狀，可以在大豆不同生長時期，不受環境，群體大小和生育時期等條件的限制，能夠快熟、準確、規模化地鑑定大豆植株矮杆性狀。

2)在大豆矮稈育種中，解決了矮杆性狀僅僅在開花後期才能調查和單一植株受環境影響性狀調查不準確必須群體調查的問題；而且在矮杆育種後代材料選育中，在種子期就能夠鑑定出隱性基因控制的矮杆基因的材料。

3)在達到相同育種效果下，大大減少了田間育種面積，進而減少田間試驗材料和勞務成本。

附圖說明

圖1是本申請密豆1號×公交9112組合F2群體內377個個體株高分布頻率曲線；

圖2是本申請大豆20個染色體上個SNP的Δ(SNP_index)擬合曲線；

圖3是本申請11個SNP在密豆1號和公交9112間的多態性檢測結果；其中，a為公交9112，b為吉密豆1號，1-12分別GM19_44412186，GM19_44546232，GM19_44595030，GM19_44622364，GM19_44779426，GM19_44815533，GM19_44902890，GM19_45000827，GM19_45361938，GM19_45423153，GM19_4549471611個SNP引物；

圖4是8個穩定多態關聯SNP標記所構建的遺傳連鎖圖譜；Dwarf為矮杆基因；

圖5是本發明實施例緊密連鎖標記GM19_45000827對吉密豆1號和公交9112雜交後代KASP SNP PCR產物的檢測；

圖6是本發明實施例緊密連鎖標記GM19_45361938對吉密豆1號和公交9112雜交後代KASP SNP PCR產物的檢測。

具體實施方式

以下將配合附圖及實施例來詳細說明本申請的實施方式，藉此對本申請如何應用技術手段來解決技術問題並達成技術功效的實現過程能充分理解並據以實施。

實施例1與大豆矮杆性狀緊密連鎖的SNP標記的獲得

1、遺傳定位矮杆性狀

(1)利用「吉密豆1號」和「公交9112」雜交獲得的377個F2單株DNA及其F2:3株高表現進行大豆矮杆性狀的遺傳定位。

(2)調查F2:3遺傳群體各個株系的植株高度，55壟距，15釐米株距，2兩粒播種的栽培密度條件下，大於70的定義為非矮杆，小於等於70的定義為矮杆。利用X2測驗分析F2:3株系株高分離是否符合3:1(圖1)，如果符合3:1，則矮杆性狀為單基因控制的，視為質量性狀。

(3)CTAB法提取其F2單株DNA，無菌水溶解DNA，濃度要大於50ng/ul，OD260/280＝1.8-2.1；利用0.1％瓊脂糖凝膠檢測DNA，條帶完整。

(4)選擇其F2:3株高表現極端高的40F2單株和株高極端矮的40F2單株。等量混合40個F2單株DNA，分別構建矮杆基因池和非矮杆基因池。

(5)簡化基因組BSA法構建吉密豆1號、公交9112、矮杆基因池和非矮杆基因池文庫(Sun et al，2013)並測序。

(6)Δ(SNP_index)擬合曲線關聯分析法定位矮杆性狀(Hill，2013)，並確定Δ(SNP_index)擬合回歸閾值為0.8704。在基因組區間內，有3個或三個以上大於閾值且連續分布的SNP，這樣的基因組區間，即為與矮杆性狀關聯的區域。研究發現這樣的區間僅有一個(圖2)，位於williams 82大豆基因組(1.0版本)19號染色體44372629bp-45495014bp位置區間，區間物理距離為1.12Mb。這個區域有18個連續大於閾值的SNP標籤(表1)，區域平均擬合回歸值為0.8796。

表1矮杆性狀關聯區域18個連續大於閾值的SNP擬合值

實施例2矮杆性狀連鎖的SNP標記開發

(1)針對其中均勻分布的12個標籤(Marker1098514，Marker1168024，Marker1143721，Marker1110430，Marker1120990，Marker1086045，Marker1118571，Marker11080703，Marker1093726，Marker1102167，Marker1094495，Marker1061721)中的12個SNP位點(44412186，44546232，44595030，44622364，44779426，44815533，44902890，4,5000827，45361938，45423153，45494716)，利用KASP技術(LGC生物公司)設計併合成11個SNP引物，具體引物對序列如下：

GM19_44412186引物對序列：

F1:TACTTTATTTCGTTAGGTCT

F2:TACTTTATTTCGTTAGGTCC

R:TTACCATAACATACAAAGAC

GM19_44546232引物對序列:

F1:ATGGAAACAATTTAAATGA

F2:ATGGAAACAATTTAAATGT

R:ATTGTGACTAATTAATCGTA

GM19_44595030引物對序列:

F1:TTTAACTCATTAAGGTTTAT

F2:TTTAACTCATTAAGGTTTAG

R:CATTAGCAAACAAAAAAGGA

GM19_44622364引物對序列:

F1:TTCGCTAACTGCCTTGCCCG

F2:TTCGCTAACTGCCTTGCCCA

R:CTTTTCGGACACCCTCTTAG

GM19_44779426引物對序列:

F1:TCTAGATTATTAGTATAAGT

F2:TCTAGATTATTAGTATAAGC

R:AGTGAGACCTTTAATTTACT

GM19_44815533引物對序列:

F1:TCATGTGCGGTATACTTACT

F2:TCATGTGCGGTATACTTACC

R:ACCATTATC TATTCTAGGGA

GM19_44902890引物對序列:

F1:TGGCAATCACTTGTTTTAAA

F2:TGGCAATCACTTGTTTTAAT

R:CGTTTGACACTTCAGATGTT

GM19_45000827引物對序列:

F1:CGGTGTAGTTCGGGAAACAC

F2:CGGTGTAGTTCGGGAAACAA

R:ACATGCCTACCAACAAAAGA

GM19_45361938引物對序列:

F1:AGATTCCCAGGCGCAACTTG

F2:AGATTCCCAGGCGCAACTTA

R:TTTGTAGCTTCTGTTTATAG

GM19_45422153引物對序列:

F1:GTCTTGGTCCGCCTTCGTCC

F2:GTCTTGGTCCGCCTTCGTCT

R:CACAGGTAGCAGCTTAGCAA

GM19_45494716引物對序列:

F1:ATTAGCCCTGGCTGAAGAAG

F2:ATTAGCCCTGGCTGAAGAAA

R:GCTCATGTTGGATGAGCTTT

(2)KASP SNP PCR擴增父母本，即吉密豆1號和公交9112，設置三個重複，通過檢測SNP是否在吉密豆1號和公交9112存在多態性，來驗證是否可作為SNP標記。LightCycler 480軟體(v1.5)的Endpoint分析模塊檢測發現，8個SNP引物，即GM19_44412186，GM19_44546232，GM19_44595030，GM19_44779426，GM19_44902890，GM19_45000827、GM19_45361938和GM19_45494716在吉密豆1號和公交9112間，三個重複螢光顯色皆為為藍綠差異，即存在穩定的多態性(圖3，其中d表示綠色，e表示藍色，c表示粉色)。其中，PCR反應體系為3ul：DNA 1.5ul(5-30ng/ul)，2×KASP Master MIX緩衝液1.5ul，KASP assay 0.05ul；PCR反應條件為：95℃預變性10分鐘；95℃變性20秒，65℃退火延伸1.00(每循環降0.8度)，10個循環；95℃變性20秒，65℃退火延伸1分鐘，36個循環；最後降溫到10℃。

(3)在吉密豆1號和公交9112雜交的377個F2遺傳個體中，對8個多態SNP引物(GM1944412186，GM1944546232，GM1944595030，GM1944779426，GM1944902890，GM19_45000827、GM19_45361938和GM19_45494716)進行KASP PCR擴增，得到377個F2個體在8個SNP位點的基因型數據。

(4)結合377個F2:3株系株高表型數據，用JoinMap 3.0軟體進行連鎖分析，計算重組率；並利用Kosambi函數將重組率轉化成遺傳圖距，確定標記和基因之間的排列順序，利用MapChart 2.0進行連鎖圖譜的繪製(圖4)。將矮杆基因定位到SNP標記GM19_45000827和GM19_45361938標記間，矮杆基因與兩個緊密連鎖標記的遺傳距離分別為，2個SNP標記間的物理距離約為361kb。

施例3利用KASP SNP PCR技術對大豆矮杆性狀進行基因型鑑定

(1)採用CTAB法提取用於鑑定的大豆材料的DNA，無菌水溶解並稀釋到5-30ng/ul，用於KASP PCR反應鑑定基因型。

(2)KASP SNP PCR反應體系、反應條件和基因型分析方法按照實施例2中的條件進行。

(3)利用2個標記(GM19_45000827和GM19_45361938)的引物，對「吉密豆1號」×「公交9112」的272個雜交後代F4:5的株系進行鑑定，LightCycler 480軟體(v1.5)的Endpoint分析模塊檢測發現(圖5、圖6)，

對於標記GM19_45000827而言，共115綠色信號，93個藍色信號，40紅色信號，24個粉色信號或其它；對於GM19_45361938而言，共111綠色信號，92個藍色信號，48紅色信號，21個粉色信號或其它。其中，綠信號，與公交9112高杆親本基因型一致，為高杆基因型(DWDW)。藍信號，與吉密豆號基因型一致，為矮杆基因型(dwd w)；紅信號，雜合基因型(DWdw)；粉色信號或其它，無法確定基因型或無信號(unknown或negtive)。

(4)統計矮杆鑑定符合率發現，對於GM19_45000827而言，93個表現藍色信號的矮杆基因型(dwdw)的個體中90個是矮杆品系，矮杆鑑定準確率為96.77％。對於GM19_45361938而言，92個表現藍色信號的矮杆基因型(dwdw)的個體中86個是矮杆品系,矮杆鑑定準確率93.48％。因此，通過對株高性狀的表現型測定結果和KASP SNP基因型分型結果的統計分析，證明這2個SNP標記能夠高度準確地對大豆矮杆和高杆進行良好分型。

上述說明示出並描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明並非局限於本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用於各種其他組合、修改和環境，並能夠在本文所述發明構想範圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和範圍，則都應在發明所附權利要求的保護範圍內。