輪狀病毒抗原ELISA定量檢測方法與流程
2023-10-11 10:47:09 2
本發明涉及生物醫藥領域，尤其病毒抗原定量檢測方法。
背景技術：
人輪狀病毒（Human Rotavirus, HRV）自上世紀70年代發現以來，至今仍是造成嬰幼兒腹瀉最主要的病原體。每年全球感染輪狀病毒的人數約為1.1億，其中近200萬患者需要住院治療，病死人數約60萬，還包括2400萬門診病例。自上世紀80年代初，科學家即開始著手研製抗輪狀病毒感染的疫苗，疫苗研製的種類主要是減毒活疫苗，重組減毒活疫苗，滅活疫苗及基因工程組分疫苗等。
輪狀病毒是一種基因組為雙鏈分節段的RNA病毒，屬於呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，呈球形，大小約70nm，有三層病毒衣殼蛋白包裹著11條基因片段組成的基因組。基因組約為18,500 bp，11個基因片段分別編碼6個結構蛋白（VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7），和6個非結構蛋白（NSP1,NSP2, NSP3,NSP4, NSP5/6）[6]。輪狀病毒感染也是中國兒童秋冬季門診和住院的主要病因。據監測資料顯示，門診腹瀉患兒輪狀病毒檢出率為15~35%，住院患兒輪狀病毒檢出率為16~60%。本課題組對一些地區連續5年住院患兒輪狀病毒檢測發現，平均檢出率為40%，相對寒冷地區檢出率為45%，亞熱帶地區的輪狀病毒檢出率也在20~30%。人輪狀病毒的血清型G型及P型隨時間的推移，其造成流行的型別也會有所變化。世界上最常見的輪狀病毒感染型主要是G1、G2、G3和G4型輪狀病毒，P型主要為P[8]型佔大多數，曾經G1為主要流行型，2006年後G3型成為主要流行株，近年檢測發現G9型增多[11]，也許是未來一段時間優勢流行毒株。P[8]型為流行的主要毒株約為74%，其次為P[4]型7.6%，P[9]型0.5%[8]。
目前還沒有輪狀病毒滅活疫苗上市，美國CDC的Baoming Jiang博士團隊[12]用源於人分離到的毒株CDC-9(G1P[8])和CDC-66（G2P[4]）開展了滅活疫苗的實驗室研究。其結果表明，經滅活後的疫苗具備良好的免疫原性，在無菌豬中做了攻擊保護試驗，其結果表明，接種疫苗後的實驗動物獲得有效保護[12-14]。另外，中國醫學科學院醫學生物學研究所自2006年「863」項目自啟動即開始研究輪狀病毒滅活疫苗並對中試到規模化製備的各個環節做了系統的研究。本研究利用具有自主智慧財產權毒株，經純化和製備免疫抗血清，並以此
技術實現要素：
本發明的目的是建立輪狀病毒G1P[8]型抗原定量ELISA方法，為輪狀病毒滅活疫苗提供質控方法。
本發明公開了一種輪狀病毒抗原ELISA定量檢測方法，其特徵在於採用0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩衝液稀釋山羊抗輪狀病毒多克隆抗體至終濃度2.0 ug/ml包被抗原板，100ul/孔，4oC過夜；洗板3次，拍幹，加入含3% BSA的PBST封閉液，200ul/孔，37oC孵育2h；洗板3次，拍幹，加入稀釋的輪狀病毒樣品，100ul/孔，37oC孵育1h；洗板3次，拍幹，加入酶標記兔抗輪狀病毒G1P[8]型多抗，1：2000稀釋，100ul/孔，37oC孵育1h；洗板3次，拍幹，TMB顯色5min, 2 mol/L H2SO4終止反應，讀取A450吸光度值，計算輪狀病毒抗原含量。
在輪狀病毒結構與非結構蛋白中，第六基因片段編碼的VP6為輪狀病毒共有的組蛋白抗原，組抗原特異性抗體可識別不同組（群）輪狀病毒，以往研究認為VP6不誘導機體產生保護性抗體，第4基因片段編碼的VP4和第9基因片段編碼的VP7是輪狀病毒主要的誘導機體產生中和抗體的成分。到目前為止，根據VP6蛋白的抗原性差異可將輪狀病毒分為A~G7個組（群），其中A、B、C三個組輪狀病毒可引起人類感染致病。A組輪狀病毒是嬰幼兒感染和致病的主要病原體，B組輪狀病毒曾在成人中引起爆發式流行，C組輪狀病毒感染致病較為少見。在A組輪狀病毒中依據VP7（糖蛋白，37kDa）和VP4（蛋白水解酶敏感蛋白，86~88kDa）的差異，目前已知的人輪狀病毒被分為19種G型和28種P型。
輪狀病毒滅活疫苗作為一個尚無參照標準的新疫苗，如何確定其有效免疫劑量是疫苗質量控制中的重要研究內容。在這一工作中，我們研究工作從兩個方面探索了該疫苗如何作為有效製品的抗原定量問題和這種定量與其刻意誘導集體產生有效免疫反應的相關關係。對此，我們參照了SFDA《預防用疫苗臨床前研究技術指導原則》（國食藥監注[2005]493號）、《中國藥典》三部（2010版）、《中國藥典》三部（2015版）的相關要求和「A型肝炎滅活疫苗」、「脊髓灰質炎滅活疫苗（Sabin株）」、「腸道病毒71型滅活疫苗」的研究經驗，初步確定了輪狀病毒滅活疫苗原液、成品及病毒抗原含量的檢定方法，並建立了抗原含量檢測參比品。
針對ELISA定量檢測方法，核心部分為抗原檢測內參品，及酶標記抗體。本技術方案均對內參品和酶標記抗體做了鑑定和定量分析，研究了其穩定性、特異性屬性。本研究建立了G1P[8]型輪狀病毒抗原ELISA定量檢測方法，測試並通過了該方法的精密性、穩定性、特異性試驗，其性能良好，能夠為基於G1P[8]型輪狀病毒滅活疫苗提供質控方法。
說明書附圖
圖1兔抗輪狀病毒G1P[8]型多抗Western Blotting驗證；
圖2輪狀病毒G1P[8]型病毒內部參考品透射電鏡顯微形態；
圖3穩定性驗證；
圖4特異性驗證。
具體實施方式
實施例1、
材料：輪狀病毒ZTR-68株（G1P[8]型），輪狀病毒Wa株（G1P[8]型），輪狀病毒SA-11株（G3P[2]型），輪狀病毒Gottfried株（G6P[4]型）；Vero細胞、Sabin IPV I型脊髓灰質炎病毒、EV71型病毒均由中國醫學科學院醫學生物學研究所製備並保存，專利涉及毒種輪狀病毒ZTR-68株保藏自中國微生物菌種保藏管理委員會（保藏號：CGMCC5265）。山羊抗輪狀病毒抗體（AB1129），PROSEP-G抗體純化試劑盒（LSK2ABG20）購自Millipore公司。上述材料要公開來源，寫明保藏單位和標號，或者購買渠道。
具體步驟如下：
步驟1、輪狀病毒G1P[8]病毒內部參考品製備：採用濃縮層析純化製備病毒內部參考品，並對製備的參考品進行HPLC純度和透射電鏡分析；
步驟2、抗輪狀病毒G1P[8]型多抗製備和純化：採用輪狀病毒G1P[8]病毒內部參考品作為免疫原，與1:1弗氏完全佐劑混合，皮下多點注射免疫大白兔和豚鼠，500 ug/只。初免後2、4周採用相同劑量與1:1弗氏非完全佐劑混合，皮下多點注射免疫，2周後分別採血，分離血清，採用PROSEP-G (ProteinG)親和層析純化試劑盒，分離純化抗輪狀病毒G1P[8]多抗；
步驟3、抗體效價、純度、特異性：採用ELISA法鑑定抗體效價，用純化的輪狀病毒抗原包被ELISA板，包被濃度0.2 ug/孔，加入2倍梯度稀釋後的純化抗體，100ul/孔，37oC結合1h；加入HRP標記的山羊抗兔（1:2000稀釋）和HRP標記的兔抗豚鼠（1:2000稀釋）分別檢測兔和豚鼠多抗；TMB顯色5min，檢測波長450nm處讀取A450值，陰性A450讀值減去空白值的2.1倍作為cutoff閾值，大於cutoff值判為陽性反應，陽性反應的最大稀釋度倒數值為抗體ELISA效價。採用SDS-PAGE和Western Blotting方法驗證抗體純度和特異性。病毒內部參考品經10% SDS-PAGE電泳後，轉膜，10%脫脂牛奶封閉室溫1h後，加入兔抗輪狀病毒G1P[8]多抗（1:500稀釋）室溫孵育1h後；加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1:2000稀釋）室溫孵育1h後；洗膜，DAB顯色，記錄；
步驟4、酶標抗體的製備：採用HRP標記試劑盒（購自北京）對兔抗輪狀病毒G1P[8]多抗進行標記，操作按說明書進行；
步驟5、輪狀病毒G1P[8]抗原ELISA定量方法：將山羊抗輪狀病毒多抗和兔抗輪狀病毒HRP標記抗體分別採用1:200開始2倍梯度稀釋棋盤滴定，確定包被抗體和酶標檢測抗體工作濃度，本研究參考《中國藥典》三部（2015板）通則213技術指南 9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則進行驗證；
步驟6、線性範圍及靈敏度：將輪狀病毒G1P[8]病毒內部參考品用含1%BSA的PBST稀釋至200、100、50、25、12.5、6.3、3.1、1.6ng/ml 8個濃度，每個濃度做2個復孔，重複檢測5次，計算線性範圍；
步驟7、準確度：將輪狀病毒G1P[8]病毒內部參考品用含1%BSA的PBST稀釋至高、中、低3個濃度：0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml，每個濃度做2個復孔，重複檢測5次，計算回收率；
精密度：板內精密度使用同一片酶標板，輪狀病毒G1P[8]病毒內部參考品用含1%BSA的PBST稀釋到0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml濃度，採用建立的方法重複5次測試，每個濃度2個復孔。板間精密度採用同一批包被的酶標板，重複5次，檢測輪狀病毒G1P[8]病毒內部參考品用含1%BSA的PBST稀釋到0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml高、中、低3個濃度，每個濃度12個復孔。計算變異係數CV值；
穩定性：包被酶標板置於37oC孵育 0、7天，將抗原內部參考品稀釋至0.1ug/ml、0.05 ug/ml、0.025ug/ml3個濃度，用建立的方法檢測不同濃度抗原樣品，計算酶標板37oC放置7天後穩定性的CV值；
特異性：用建立的方法檢測採用相同純化工藝製備的輪狀病毒ZTR-68株（G1P[8]型），輪狀病毒Wa株（G1P[8]型），輪狀病毒SA-11株（G3P[2]型），輪狀病毒Gottfried株（G6P[4]型），以及Vero細胞培養凍融上清液、Sabin IPV -I型脊髓灰質炎病毒、EV71型病毒。
結論：
狀病毒G1P[8]型病毒內部參考品鑑定，Western Blotting 和透射電鏡分析顯示，輪狀病毒G1P[8]內參抗原與輪狀病毒陽性鑑別血清發生特異性反應，相對分子量38kDa有明顯組抗原VP6蛋白條帶，大小與預期相符，見圖1；輪狀病毒G1P[8]內參抗原有較多完整病毒顆粒，顆粒大小直徑為70~75 nm，完整度較好，見圖2。
純化輪狀病毒G1P[8]型抗體鑑定，輪狀病毒特異性抗體ELISA檢測結果顯示，兔抗輪狀病毒G1P[8]型效價為1：5120，1：2000為適宜的反應稀釋度。
輪狀病毒G1P[8]型抗原ELISA定量檢測方法建立，經過對ELISA檢測條件的優化，建立了輪狀病毒G1P[8]型抗原定量ELISA檢測方法：採用0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩衝液稀釋山羊抗輪狀病毒多克隆抗體至終濃度2.0 ug/ml包被抗原板，100ul/孔，4oC過夜；洗板3次，拍幹，加入含3% BSA的PBST封閉液，200ul/孔，37oC孵育2h；洗板3次，拍幹，加入稀釋的輪狀病毒樣品，100ul/孔，37oC孵育1h；洗板3次，拍幹，加入酶標記兔抗輪狀病毒G1P[8]型多抗，1：2000稀釋，100ul/孔，37oC孵育1h；洗板3次，拍幹，TMB顯色5min, 2 mol/L H2SO4終止反應。讀取A450吸光度值，計算輪狀病毒抗原含量。
ELISA定量檢測方法準確度和精密度驗證，輪狀病毒G1P[8]型內部參考品高、中、低三組劑量濃度樣品回收率分別為94.6~102.0%、90.6~108.3、93.3~111.8，表面該方法準確度良好，見表1。
ELISA定量檢測方法穩定性和特異性驗證，穩定性結果顯示，建立的ELISA系統保存7天後，檢測值間無顯著性差異（P>0.05）（圖3）。特異性結果顯示，建立的ELISA系統與輪狀病毒外抗原均無交叉反應，與不同型別輪狀病毒抗原存在交叉反應，能檢出抗原量（圖4）。