奶牛早期妊娠的螢光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法

2023-10-11 21:18:49 1

奶牛早期妊娠的螢光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於螢光定量PCR技術的奶牛早期妊娠檢測試劑盒及檢測方法，通過聯合檢測奶牛外周血中兩個幹擾素刺激基因ISG15和RSAD2的表達量來進行妊娠診斷，可以在青年母牛人工授精後18d排查空懷牛和妊娠牛，使妊娠診斷的時間提前；可實現在青年母牛第一次配種後3周以內排查空懷牛，對其進行再次人工授精，從而縮短產犢至下一次妊娠的間隔，進而提高奶牛的繁殖率。本發明的試劑盒及其檢測方法，操作簡單，出結果快，檢測結果準確，靈敏度高，有望成為今後奶牛業中早期妊娠診斷的主流技術。
【專利說明】奶牛早期妊娠的螢光定量PCR檢測試劑盒及檢測方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學和核酸檢測【技術領域】，具體的說，本發明涉及一種基於熒 光定量PCR技術的奶牛早期妊娠檢測試劑盒及檢測方法。

【背景技術】
[0002] 妊娠診斷是奶牛生產管理中的重要環節，對奶牛實施早期妊娠診斷可以儘早發現 空懷牛並對其進行發情處理和再次人工授精，可縮短產犢間隔、減少空懷導致的經濟損失。 根據國內外專家估計，空懷導致每頭乳牛每日約減奶8-15千克；最低少生產牛犢0. 003頭， 每頭每日飼料、能源、人力等方面的消耗約20-30元。因此，探索科學、準確、簡便、快捷的奶 牛早期妊娠診斷新技術顯得尤為重要。
[0003] 在生產中常見最常用的妊娠診斷方法是直腸觸診，技術比較成熟的繁殖員在配 種後45-50d可做出準確診斷，經驗豐富的繁殖員最早可以在人工授精後35d判斷是否妊 娠；通過測定牛奶或者血液中的孕酮含量也可以判斷奶牛是否受孕，該方法在人工授精 後21-24d進行檢測；目前已經開始初步使用但是尚未廣泛推廣的牛妊娠相關蛋白（PAG) ELISA試劑盒能在妊娠後28d做出較為可靠的判斷。由此可見，這些方法均只能在奶牛 人工授精三周後做出準確診斷。最新的研究報導證實利用PAGELISA試劑盒於人工授精 後28d排查出來的空懷牛，與同樣條件下在妊娠46d時利用直腸檢查的方法排查出來的 空懷牛相比，對其實施同期發情並再次配種後的妊娠率和空懷天數並沒有提高（Sinedino LD，LimaFS,BisinottoRS，etal.Effectofearlyorlateresynchronization basedondifferentmethodsofpregnancydiagnosisonreproductiveperformance ofdairycows[J].Journalofdairyscience，2014, 97 (8): 4932-41) ?研究指出，如果 人工授精後一個情期內（三周）能排查出空懷牛，即可對其進行快速的同期發情處理，在 第21-23d進行復配，減少空懷天數，提高奶牛的繁殖效率（LucyMC，McDougallS，Nation DP.Theuseofhormonaltreatmentstoimprovethereproductiveperformanceof lactatingdairycowsinfeedlotorpasture-basedmanagementsystems[J].Animal reproductionScience, 2004, 82-83:495-512)。因此，從某種程度上來講，能否於奶牛人工 授精後一個情期內判斷奶牛妊娠或者空懷，是縮短奶牛產犢間隔和提高繁殖率的關鍵。
[0004] 綜上，需要能夠實現快速、有效且準確檢測奶牛早期妊娠的產品，以儘早發現空懷 牛並對其進行發情處理和再次人工授精，縮短產犢間隔、減少空懷導致的經濟損失。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於提供一種特異性好、靈敏度高、準確地檢測奶牛早期妊娠的熒 光定量RT-PCR的方法，以較早時間判斷出青年牛人工授精後是否妊娠。
[0006] 牛早期胚胎發育的過程中，在授精後14-18d即母體妊娠識別階段，孕體合成並分 泌的幹擾素-t(IFN-t)可作用於血液中白細胞，引起一系列幹擾素刺激基因上調表達， 因此，通過定量PCR技術檢測白細胞中這些幹擾素刺激基因的表達水平可以進行妊娠診 斷。本發明通過螢光定量PCR技術檢測奶牛人工授精後18d外周血白細胞中幹擾素刺激基 因的表達水平來進行妊娠診斷，實現在奶牛人工授精後一個情期內判別妊娠牛和空懷牛。 為空懷牛的復配節約時間，從根本上提高奶牛的繁殖效率。
[0007] 該螢光定量RT-PCR檢測方法包括如下步驟（步驟示意如圖1):
[0008] (1)血液標本的收集
[0009]採集青年牛（14-16月齡的奶牛）發情後人工授精前0d和人工授精後18d的外周 血1. 5-2ml，抗凝，低溫冷藏。
[0010] ⑵標本RNA的提取
[0011] 血液總RNA提取試劑盒提取標本中總RNA(標本採集後2h內完成），之後利用 NanoDrop2000超微量分光光度計分析RNA樣本濃度與純度（0D26CI/28CI = 1. 9-2. 1)，同時採 用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，通過質檢的樣本分裝後，於-80°C保存備用。
[0012] (3)逆轉錄反應
[0013] 逆轉錄採用試劑盒進行，每個反應RNA用量為500ng，根據RNA的濃度計算得出每 次反應所需的體積，按照試劑盒說明書進行。
[0014] (4)螢光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因在青年牛外周血中的相對表達量
[0015] 1)目的基因和內參基因引物的設計與合成
[0016] 牛ISG15基因和內參基因P-Actin引物參考文獻報導（GiffordCA，Racicot K,ClarkDS,etal.RegulationofInterferon-StimulatedGenesinPeripheralBlood LeukocytesinPregnantandBred,NonpregnantDairyCows[J].Journalofdairy science, 2007, 90:274-280)，其中，所述的牛ISG15 基因的引物對是：SEQIDNO:1 和SEQ IDNO:2, 0 -Actin的引物對是：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4,具體的引物信息如下：
[0017]ISG15-F:5 ; -GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3 ;
[0018]ISG15-R:5 ; -ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3 ;
[0019] @-Actin-F:5 ' -CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3 '
[0020] P-Actin-R:5 ' -GGATGTCGACGTCACACTTC-3 '
[0021] 牛RSAD2基因引物對序列根據NCBI中提供的牛RSAD2基因序列（NM_001045941)， 利用軟體Primer5.0設計。所用引物序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，具體的引 物對序列為：
[0022] RSAD2-F:5 ' -GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3 '
[0023]RSAD2-R:5 ' -CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3 '
[0024] 2)螢光定量PCR反應體系
[0025] 牛ISG15和RSAD2基因螢光定量PCR擴增體系均為：2xSYBR?Green10iil， 上下遊引物各 〇? 5ill(10iimol/L)，cDNA模板 0? 3iil，ddH20 8. 7iil，體系共 20ill。
[0026] 3)螢光定量PCR反應條件
[0027] 15615基因反應條件：951：預變性6〇8,951：變性158,621：退火158 ;721：延伸 30s，共40個循環
[0028] 1?402基因反應條件：951：預變性6〇8,951：變性158,581：退火158 ;721：延伸 30s，共40個循環
[0029]0-Actin基因反應條件：95°C預變性 60s，95°C變性 15s，60-62°C退火 15s;72°C 延伸30s，共40個循環
[0030] (5)統計分析
[0031] 1)ISG15和RSAD2基因表達量的分析
[0032] 採用相對定量的方法檢測目的基因的表達量：計算出檢測標本中目的基因Ct均 值與內參基因Ct均值的差值（ACt)，以2_AAet表示樣品中目的基因mRNA相對表達量，其 中AACt=ACt-(人工授精後0d檢測樣本目的基因的Ct均值-該樣品內參基因的Ct 均值）。將奶牛人工授精後〇d各基因的相對表達量較正為1，人工授精後18d的表達量為 〇d時表達量的倍數。
[0033] 2)利用牛ISG15和RSAD2基因的表達量進行青年牛早期妊娠診斷
[0034] 人工授精後18d奶牛外周血中ISG15的表達量為XI，RSAD2的表達量為X2,將XI 和X2帶入公式P=l/[l+e_(_653+2__+°_866X2)]中，如果P值大於0? 680時，即為妊娠。
[0035] 本發明的另一目的在於提供牛外周血中幹擾素刺激基因表達水平的實時螢光定 量RT-PCR檢測試劑盒，它含有牛幹擾素刺激基因RSAD2和ISG15以及內參基因P-Actin 特異性引物對，其中：
[0036] (a)牛ISG15基因和內參基因@ -Actin弓丨物對信息如下：
[0037]ISG15-F:5 ' -GGTATCCGAGCTGAAGCAGTT-3 '
[0038]ISG15-R:5 ' -ACCTCCCTGCTGTCAAGGT-3 '
[0039] @-Actin-F:5 ' -CTGGACTTCGAGCAGGAGAT-3 '
[0040]P-Actin-R:5 ' -GGATGTCGACGTCACACTTC-3 '
[0041 ] (b)牛RSAD2基因引物對序列為：
[0042]RSAD2-F:5 ' -GCTGAAAGAAGCAGGTATGGA-3 '
[0043]RSAD2-R:5 ' -CGTACTTCTGGAACCACCTCT-3 '
[0044] 所述試劑盒的統一濃度和1人份測試用量統一標準為：
[0045]

【權利要求】
1. 一種基於螢光定量PCR技術的奶牛早期妊娠檢測試劑盒，包含牛ISG15基因和內參 基因 P-Actin特異性引物對，其中，所述的牛ISG15基因的引物對是：SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，@-Actin的引物對是：SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4,其特徵在於還包含牛RSAD2 基因特異性引物對，所用引物序列如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示。
2. 如權利要求1所述試劑盒，其特徵在於所述試劑盒的統一濃度和1人份測試用量統 一標準為： ISG15-F lOumol/L 0. 5 u L ISG15-R lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-F lOumol/L 0. 5 u L RSAD2-R lOumol/L 0. 5 u L ^-Actin-F lOumol/L 0. 5 u L 3-Actin-R IOu mol/L 0.5 u L。
3. -種基於螢光定量PCR技術的奶牛早期妊娠檢測方法，包括如下步驟： (1) 血液標本的收集 採集奶牛發情後人工授精前Od和人工授精後18d的外周血I. 5-2ml，抗凝，低溫冷藏； (2) 標本RNA的提取 標本採集後2h內用血液總RNA提取試劑盒完成標本中總RNA提取，之後利用NanoDrop 2000超微量分光光度計分析RNA樣本濃度與純度，0D26(I/28(I = 1. 9-2. 1，同時採用1. 2%瓊脂 糖凝膠電泳檢測RNA完整性，通過質檢的樣本分裝後，於-80°C保存備用； (3) 逆轉錄反應 逆轉錄採用試劑盒進行，每個反應RNA用量為500ng，根據RNA的濃度計算得出每次反 應所需的體積，按照試劑盒說明書進行； (4) 螢光定量PCR檢測ISG15和RSAD2基因在奶牛外周血中的相對表達量 1) 目的基因和內參基因引物的設計與合成 牛ISG15基因的引物對信息如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的序列；內參基因 3-Actin的引物對信息如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的序列；牛RSAD2基因引物對 序列如 SEQ ID NO :5 和 SEQ ID NO :6 ; 2) 螢光定量PCR反應體系 牛15615、1?402基因和內參基因3 4(^111螢光定量？〇?擴增體系均為：2><8丫]311? Green 10 iil，上下遊引物各 0.5 ill (IOii mol/L)，cDNA 模板 0.3 iil，CldH2O 8.7 iil，體系共 20u I ； 3) 螢光定量PCR反應條件 ISG15基因反應條件：95°C預變性60s，95°C變性15s，62°C退火15s ;72°C延伸30s，共 40個循環； RSAD2基因反應條件：95°C預變性60s，95°C變性15s，58°C退火15s ;72°C延伸30s，共 40個循環； 3-八(^丨11基因反應條件：951：預變性6〇8,951：變性158,6〇-621：退火158;721：延伸 30s，共40個循環； (5)統計分析 1. ISG15和RSAD2基因表達量的分析 採用相對定量的方法檢測目的基因的表達量：計算出檢測標本中目的基因與內參基因 的閾值差（A Ct)，以2_AAct表示樣品中目的基因 mRNA相對表達量，將奶牛人工授精後Od 各基因的相對表達量較正為1，人工授精後18d的表達量為Od時表達量的倍數； 2) 利用牛ISG15和RSAD2基因的表達量進行奶牛早期妊娠診斷 人工授精後18d奶牛外周血中ISG15的表達量為X1，RSAD2的表達量為X2,將Xl和X2 帶入公式P = l/[l+e_(_6 53+2__+°_866X2)]中，如果P值大於0.680時，即為妊娠。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328202SQ201410657206
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月18日 優先權日:2014年11月18日
【發明者】程蕾, 向敏, 王定發, 劉曉華, 胡修忠, 夏瑜, 凌明湖 申請人:武漢市畜牧獸醫科學研究所