核酸檢測的製作方法

2023-10-11 14:19:49 2

專利名稱：核酸檢測的製作方法
技術領域：
本發明涉及核酸的檢測和鑑別，特別涉及多元核酸檢測系統。
背景技術：
核酸(例如病毒的)的多元檢測被特別描述於專利說明書W0/2004/085455中，其描述了將樣品置於多個孔中， 然後平行地使每個樣品都經受檢測過程。已顯示，有可能通過免疫學技術來對引起疾病的試劑進行多元檢測，一個實例是LUMINEX系統，其被描述於專利說明書W0/2002/024959中。另一種技術是將靶分子雜交到陣列上，如專利說明書W0/2008/054830中所描述的。此類方法的劣勢是用於生成結果所花費的時間。此外，它們需要大量樣品以確保能夠成功地檢測通常非常稀釋的分析物。備選的方法是PCR方法，其被描述於美國專利說明書No. 4，683，202中。傳統地，核酸是在PCR之後通過大小分級而被檢測的，這是一個費時的過程，但是當使所產生的擴增物經受某些下遊過程(例如電泳)時，有可能通過其大小而檢測多重分析物。近來，大多數核酸檢測系統依賴於實時PCR，例如美國專利說明書No. 6，814，934中所描述的。實時PCR的明顯劣勢是對於用於進行測試的設備的物理限制-它們受限於檢測最多5種靶分子。這一限制是物理的，是由於其光學系統的設計並且光學設計還導致光學通道之間的串擾。由於來自所需分析物的光被來自存在於反應容器中的其它產物的光投上陰影，這實際上使得很難對所存在的分析物的水平進行定量。因此，目標仍舊是能夠在儘可能短的時間內檢測單一樣品中的所有病原體。當誘發劑可以是病毒和/或細菌組中的任意一種時，未鑑別的感染的爆發很好地呈現了要滿足這種需求的情形。在廣泛的領域中也有此目標，例如人類遺傳學和用於案發現場分析的DNA指紋分析。另一個重要的目標是準確檢測和鑑別短的核酸序列，其在亞75bp、但優選亞60bp擴增子大小的範圍內。這些用傳統的方法(包括上述那些)不能被可靠地分析。置於目前可獲得的化學作用之上的限制是由測試方法本身的特徵所施加的。檢測的遺傳學方法包括使用嵌合染料(例如SYBR)，其允許檢測但是在應用領域具有如下的主要劣勢它們不是核酸序列特異性的。這引起發明了許多要求分子相互作用的檢測系統或探針，其要求存在正確的核酸序列以產生信號。這些的一個實例被描述於專利說明書W097/46707中。此方法的劣勢是，額外的分子在此類技術上設置了設計負擔，因為有可能被檢測到的最小大小的擴增子。此外，由探針提供的分子檢測是更高階的事件，因為必須允許有時間以使信號生成。自探測引物是本領域已知的，然而，那些(例如LUX系統)不是序列特異性的，並且所產生的任何偽產物都將類似地生成信號。其它已知的化學作用，即Scorpions GB2338301 和『Angler』方法(Lee』M.A.et al. (2002) ,Analytica Clinica Acta 457 61 :70 ；ffhitcombe, D. et al. (1999), Nature Biotechnology 17 :804-807),利用的是它們自身在經擴增的序列內探測的引發序列。這些因而要求發生更高階的事件，即與所希望的靶雜交並且不迎合短的擴增物，因為必須有足夠的空間以允許待探測的序列被包含在擴增物內。本發明提出了許多克服這些限制的手段，特別是關於檢測大小在60個鹼基以下的短核酸片段，60個鹼基的大小是現存的化學反應所要求的。嵌合染料方法雖然擴增效率高，但將傾向於似乎對於短的產物具有低的特異性，因為高的背景掩蓋了短的擴增子所產生的相對低的信號。此外，此類短的擴增子就是不具有足夠的可得鹼基用於採用傳統的探針方法，且60個鹼基左右似乎是分界點。此類短的擴增子在其中靶DNA可能被剪斷的測試中是有利的，例如當試圖檢測經宿主免疫系統處理的病原體核酸時就是這種情形。備選地，小的幹擾RNA(SiRNA)研究的焦點在於大小在20至超過30個鹼基範圍中的雙鏈RNA分子，而使用現有的探針技術不可能檢測這些分子。可能的情況是，區分致病型的DNA序列可由核苷酸的短的重複組成，而能夠準確地確定僅僅是重複的數目卻不受來自相同的基因組區域的幹擾可以是有利的。此種方法對於所有測定類型的其它益處是此類短擴增子所固有的增加的反應速度和PCR效率。在本專利說明書中，用語容器是指能夠盛載待處理的物質或樣品的任何設備，並
且因此可包括下列或由下列組成孔、管(開放或閉合的)、玻片(可能是以矽片的形式)或盤。本發明特別涉及孔形式的微量滴定容器。在本專利說明書中，術語熱循環用於指循環地加熱樣品至多個溫度。典型的熱循環過程是聚合酶鏈式反應(PCR)，其中採用三種溫度(較高的變性溫度，中等的延伸溫度和較低的重組溫度)。理想地，在熱循環的過程中，儘可能準確和快速地達到所需的溫度並維持，從而使得所述過程所花費的時間最小化。存在進行實時分析的系統。專利說明書W02004045772描述了一種此類系統。然而，這些系統局限於多元分析方法，例如熔點測定和上文中提及的實時PCR方法。類似地，存在用於大小分離的脫機系統，例如美國專利說明書5552322中所描述的DNA測序儀。因此，本發明的重要目的是提供用於對核酸分析物進行高效多元分析的系統。發明簡述根據本發明的第一個方面，檢測樣品中多種分析物的方法包括 根據所預期的分析物的性質選擇一個或多個引物，用不同的染料標記每一個引物並且將其置於反應容器中； 將待分析的樣品置於所述反應容器中； 使所述樣品經受倍增過程； 根據大小分離經倍增的樣品的組分，此後稱作擴增物； 量化所存在的大小並且確定每種大小的顏色；以及 將所產生的量化和顏色與已知的數據進行比較，以確定所存在的靶擴增物或每種所存在的靶擴增物的性質或其部分的性質。將領會到，本發明的這一方面的倍增過程可在單一的反應容器中實現，儘管樣品中可能存在多種核酸。可通過使擴增物經受電壓從而進行電泳來分離擴增物組分。備選地，可採用離心。典型的分離介質包括瓊脂糖，聚丙烯醯胺和其它本領域中所熟知的。過程可包括將經倍增的樣品從反應容器轉移至光學檢測儀器，後者可能包括毛細管，在其中進行大小的定量和顏色的確定。可使用微流體系統來實現所述轉移。然而，將領會，整個過程可在試劑盒中進行，所述試劑盒在一個實施方式中可以是手持尺寸，在另一個實施方式中可以是小的桌上型尺寸，而在另一個實施方式中可以是實驗室設備比例，並且在每種情形中都可以是自動化的。儘管倍增儀器可能與光學檢測儀器相分離，本發明的特徵是容易地可能提供用於實現上述過程的儀器，其是手工地便攜的並且因而容許現場使用，例如由去探訪爆發了某些疾病的農場的獸醫使用或者其它。來自所涉及的動物或獸群的疾病跡象將就起因病原體的性質提供一些指徵並且可據此選擇引物和染料。設備可以是能夠檢測至少兩種分析物的，雖然在單一的閉合管測定中應當能夠實現檢測超過十種，甚至超過二十種。
根據本發明的第二個方面，提供了用於檢測樣品中的多種分析物的儀器，其包括 反應容器； 使反應容器中的樣品經受倍增過程的工具； 可操作以根據大小分離擴增物組分的分離臺； 用於定量所存在的大小和確定每種大小的顏色的光學檢測工具；以及 用於將所產生的定量和顏色與已知的數據進行比較以確定所存在的靶擴增物或每種所存在的靶擴增物的性質或其部分的性質的工具。優選地，所述反應容器是微量滴定孔，所述樣品倍增工具包括PCR儀，所述分離臺包括用於向擴增物應用電壓的工具，且用於使擴增物經受分離電壓的工具包括電泳儀，所述光學檢測工具包括光譜檢測儀。本發明因此提供了用於同時檢測多種核酸的設備，其通過倍增它們以產生預期核酸的擴增物(例如通過PCR)，然後根據物理大小分離所產生的擴增物。有效地，此手段能夠同時根據大小和顏色鑑別經擴增的靶標。此設備大大增加了一次操作中可檢測的分析物的數目，在此情形中是病原體。此外，可在60分鐘內、有可能甚至在30分鐘內完成操作。根據本發明的特徵，樣品中的寡核苷酸在設備內被螢光標記。這樣，可檢測到很短的寡核苷酸引物序列。合適的染料包括，特別是螢光標記例如螢光素、TET、HEX。這是系統的所謂化學作用部分。這一化學作用部分相對於現有技術的系統所具有的優勢是去除了對於以前產生序列特異性信號所必需的額外分子的需要。這相對於現存的方法帶來了重要的雙重優勢其一，對於序列檢測可以考慮更小的區域；其二，更小的擴增子和缺少更高階的事件使得能夠更快地檢測目的病原體。因此，所述設備可被用於鑑別大小相差Ibp的PCR產物，且使用上文所述的經螢光標記的引物同時鑑別15種或更多種。然後使用上述分離系統來分離產物。然後，當經分離的片段經受分光鏡分析儀的光學審查時，可基於在預期的波長和大小條帶中是否存在光而採用合適的軟體來自動化地為終端用戶解釋結果。因此，本發明是這樣的系統其能夠進行快速的多元實時PCR並且隨後根據大小分離所產生的擴增子，其特性可通過特定編寫的軟體被自動化地分辨。此外，所述系統可被用於區分對於本領域操作者而言顯然的各種靶標的任何短的(亞60bp)擴增物。 在操作中，料想可以如此構建測試從而使給定組的所有靶標都將被相同的染料標記並且進行實時分析以鑑別所述組。然後可通過隨後的大小分離而立即提供組內的亞分型。這是依賴於測定的，並且所述系統然後可區分單一容器中的最少一種至最多一百種分析物(這是十種不同的顏色和十種不同的擴增子大小)。本發明的這一系統組成部分有三個階段，下面將概述其實例。第一階段有利地包含快速和準確的熱循環系統，如在專利說明書WO 2008107683中所概述的。此階段可在30分鐘以內完成。多元檢測系統可具有一個或多個發光源的特徵，包括單一的或多個發光源。這些將優選地是二極體泵浦固態雷射，但可以是下列的任一種LED、氣體泵浦雷射、燈等。在另一個所料想的實施方式中，可使用一系列此類發光源，從而進一步增加所述系統可利用的染料的範圍。本發明有利地利用具有最少6nm(但優選Inm)解析度的光譜檢測儀。這允許區分十二種染料並且如此就允許比現存的技術檢測顯著更多的擴增物，現存的技術目前受限於
五種試劑。待分析的波長將最小為500-700nm，但優選300-1000nm。這樣的系統能夠(介由染料去卷積(deconvolution)軟體)區分峰值突光發射僅相差3nM的染料。去卷積軟體可準確地分離來自所存在的每一種分析物各自的光譜。各個所料想的探針系統可以利用在使用經修飾的鹼基方面的最近進展，例如LNA分子或任何本領域已知的經修飾的鹼基。此類分子的優勢是使用所述探針系統有可能檢測長度如20個鹼基短的擴增物。本發明的其它所預料的實施方式依賴於將兩種分別放置的染料置於正向和反向引物上。僅僅在正確擴增的產物上，這些螢光分子才將在空間上足夠近以發生FRET並因此
產生信號。將所產生的定量和顏色與已知數據進行比較以確定所存在的靶擴增物或每種所存在的靶擴增物的性質或其部分的性質的步驟可使用合適的所述去卷積軟體完成。所述軟體將基於所期待的波長帶內是否存在光而自動化地為終端用戶解釋結果。由於可排布光學系統以允許來自反應室的核酸測定的通量，因此可同時在許多熱循環儀中進行測試，然後將所產生的擴增物轉移至單一的讀數器，因而快速地確定診斷結果。至於可採用的PCR的形式，任何目前被接受的實時PCR檢測化學作用都是可能的。探針系統可採取ResonSense 探針的形式，如專利說明書W0/1999/028500中所描述的。然而，本申請中所描述的化學作用是優選的。
具體實施例方式現在將參考附圖
特別描述本發明，其中圖l(la，lb，lc)描述了本發明的檢測原理；圖2，3和4描述了本發明的化學作用階段的實施方式；圖5顯示了螢光峰之間的相互作用；圖6描述了隨時間分離擴增物組分；以及圖7至10是根據本發明的儀器的示意圖。本發明的第一個實施方式採用在5』端用螢光染料標記的序列特異性引物，所述螢光染料優選較長波長的染料例如CY5。探測系統結合到其預期的靶標上，然後可用於引發所需序列的擴增。在含有嵌合染料的反應混合物中擴增經標記的引物，以SYBR為優選的，雖然其它合適的染料(例如SYTO 9和EVA GREEN)是本領域已知的。理想地，此染料比標記至引物分子5』端的染料在更短的波長處。當用光源(在優選的實施方式中是藍色雷射)照明時，SYBR染料將發螢光並將通過FRET原理將它的光能轉移至CY5，雷射本身不能激發CY5染料。然後檢測CY5信號並用其來測量生物學反應的進展並允許在分子水平檢測潛在的病原體。在圖2-4中概述了此方法。第二個優選的實施方式採取了掃描儀的形式，因此不需要熱循環系統。此類掃描儀可允許增加核酸測定的通量，因為可同時在許多熱循環儀中進行測試，然後轉移至單一的讀數器，以快速地確定診斷結果。此方法將適於僅根據顏色來分離並且如此將在單一的容器中檢測最少一種但容易地直至12種不同的靶標。
第三個實施方式是將尾序列摻入引物自身中。尾分子的存在允許序列特異性探針化學作用，例如將用於此類短擴增子的Taqman，這在沒有進行這種修飾時將是在物理上不可能的。第四個實施方式可以是在擴增產物之中使用螢光染料終止劑。如果引物是以CY5標記的並且以重疊的構造被構建，僅需要一個鹼基延伸，以完成生物學反應並產生螢光信號。如在圖5中可見的，雖然三個單獨的光學「峰」可存在於來自樣品的回歸譜中，每一個「峰」都被混合為譜。這產生了 「峰」之間的「串擾」，其必須被解釋並由去卷積軟體重新分離，其了解染料被激發時如何響應並且單獨地了解峰的形狀以及一個「峰」的存在將如何在相同的「樣品」中提供對染料的繼發性激發。作為示例，染料I被雷射激發，這產生了螢光信號，其與雷射源一起激發染料2，與如果僅用雷射進行激發相比，這產生了來自染料2的不同的光學信號。優選的實施方式還增加了可被區分的分子的數目，這是通過首先實施能夠進行多元檢測的實時PCR反應，然後使用電泳根據大小分離經擴增的分子。圖7和8顯示了一次性反應容器，其包括熱循環室和含有分級物質(例如瓊脂糖，聚丙烯醯胺或適於進行電泳分離的任何其它本領域已知的物質)的其它通道。使容器經受熱循環反應，並由此在正確的分析物的存在下產生預期的PCR產物，因而產生由系統檢測的螢光信號。反應完成後，微流體系統將一部分樣品轉移至共同定位的分離介質，並且通過電泳過程根據大小進行排序。優選的實施方式通過用不同的染料標記每一個變異而能夠分辨單核苷酸多態性(SNPs)。這樣，可通過經過光學檢測儀所花費的時間或通過發射的光的波長來檢測SNP。可調節電泳介質中電極的電壓，使得當「搜尋」樣品時(即沒有檢測到螢光)應用高電壓，然後降低電壓以在預期擴增子將落入的大小範圍內增加檢測和SNP分析的解析度，因而減少檢測的時間卻保持準確性和解析度。圖3顯示了檢測四個單獨的多態性的四種顏色。可見，分別標記為紅色和藍色的SNP將不能通過常規的大小分離技術被準確地分辨。結合至擴增物的染料使得這些共遷移種類的分辨簡單得多。這一因素增加了可被分辨的產物的量，因為所提出的系統可通過大小和發射的光的波長二者來進行分離。然後，使經大小分級的樣品經受上述分光鏡分析儀的光譜評價。此系統允許在單一測定中檢測最少兩種但實際上大大超過二十種試劑。如圖7所示，反應容器(I)具有其中發生PCR的反應部分。通過與熱源/槽6相聯合的帕爾帖效應模塊(4)以及使之經受電壓極性逆轉而實現所需的加熱和冷卻。通過熱傳導性反應容器座(3)將熱能轉移至反應容器。在此反應室之下是含有電泳凝膠的毛細管11。顯示在毛細管上的是一對電觸點(2)，可通過電觸點(5)在其上供以偏壓電壓，以促進經標記的DNA朝向所選擇的電極而橫穿所述凝膠。使雷射激發(7)通過電泳凝膠，從而當經標記的核酸從所述雷射前面經過時產生突光標誌⑶。
此螢光標誌⑶被指引經過衍射光柵(9)，產生穿過檢測儀(10)的光譜。毛細管通過熱源/槽6，所述熱源/槽6被保持在40_60°C數量級的恆定溫度的移除模塊(HRM)處，這允許在更高的電壓下進行電泳，所述更高的電壓高於由於所述更高的電壓所產生的熱而通常將允許的電壓。為了完成這些測定，需要適於擴增和檢測這些短的核酸靶標的化學作用。第一個所料想的本發明的實施方式是以螢光染料在5』端標記的序列特異性引物，所述螢光染料優選較長波長的染料(例如CY5)，但不受限制並且包括所有本領域已知的染料。探測系統將結合至其所預期的靶標並可用於引發所需序列的擴增。在含有嵌合染料的反應混合物中擴增經標記的引物，所述染料的優選實施方式是SYBR，雖然其它合適的染料(例如SYTO 9和EVA GREEN)是本領域已知的。關鍵地，此染料將比標記至引物分子5』端的染料在更短的波長處。當用光源(在優選的實施方式中是藍色雷射)照明時，SYBR染料將發螢光並將通過FRET原理將它的光能轉移至CY5，雷射本身不能激發CY5染料。然後檢測CY5信號並將其用於測量生物學反應的進展和允許在分子水平檢測潛在的病原體。在圖4中概述了此方法。各個所料想的探針系統都可以利用在使用經修飾的鹼基方面的最近進展，例如LNA分子或任何本領域已知的經修飾的鹼基。此類分子的優勢是使用所述探針系統有可能檢測長度如20個鹼基短的擴增物。本發明的其它所預料的實施方式依賴於將兩種分別放置的染料置於正向和反向引物上。僅僅在正確擴增的產物中，這些螢光分子才將在空間上足夠近而發生FRET並因此產生信號，如在圖4b中所示。第三個實施方式是將尾序列摻入引物自身中。尾分子的存在允許序列特異性探針化學作用，例如將用於此類短擴增子的Taqman，這在沒有進行這種修飾時將是在物理上不可能的。這突出顯示於圖4c中，此方法以前被用於提供用於產生髮夾結構的互補序列或用於提供隨後將在自探測擴增子設置(例如釣魚者(angler)化學作用)中使用的結合位點。關於下述是新穎的使用5』序列尾部來在短擴增子中提供用於探針雜交的靶標，其中的候選靶標否則不能被選擇。最後潛在的實施方式是在擴增產物之中使用螢光染料終止劑。引物是以CY5標記的並且以重疊的構造被設計，使得僅需要一個鹼基延伸來完成生物學反應並產生螢光信號，如圖4d中所示。將領會，在上述試劑盒能夠實施本申請中所要求保護和所描述的整個過程的同時，其也能夠實施檢測過程，其中已知存在最多例如四或五種不同的核酸，而完全省略所述過程的化學作用階段。圖8表示本發明的另一個實施方式。在那個實施方式中，如此設置現存的實時PCR，使得可收集完成的擴增物用於隨後的大小分離。向反應容器供應可刺穿的蓋子，並且在完成實時PCR倍增過程之後，隨後根據大小分離現在經螢光標記的產物。此儀器結合了能夠刺穿容器蓋並向毛細管系統遞送擴增物的流體系統，所述毛細管系統被設置為用於應用電泳來根據大小分離經螢光標記的產物。I含有擴增產物的反應容器2流體轉移毛細管道3用於移動流體的真空泵4電泳毛細管5光學檢測儀還將領會，雖然可採用例如各含有一些相同的樣品的96孔陣列，並使整個陣列進行PCR過程，本發明允許使用單個的孔，這可觀地減少了為了成功地分析其組分核酸所需的樣品量以及進行所述方法所需的試劑盒的尺寸。
權利要求
1.用於檢測樣品中的多種分析物的方法，其包括 根據分析物的預期性質選擇ー個或多個引物，用不同的染料標記每一個引物並將其置於反應容器中； 將待分析的樣品置於所述反應容器中； 使所述樣品經受倍增過程； 根據大小分離經倍增的樣品的組分，此後稱作擴增物； 定量所存在的大小並確定甸一種大小的顏色；以及 將所產生的定量和顔色與已知的數據進行比較，以確定所存在的靶擴增物或每種所存在的靶擴增物的性質或其部分的性質。
2.權利要求I的方法，其中所述倍增過程在単一的反應容器中完成。
3.權利要求I或權利要求2的方法，其中所述分離是通過應用電壓完成的。
4.權利要求3的方法，其中分離手段採用電泳。
5.權利要求1-4中任ー項的方法，其中所述引物包含瓊脂糖或聚丙烯醯胺。
6.前述權利要求中任ー項的方法，其包括將經倍增的樣品從反應容器轉移至光學檢測儀器。
7.權利要求6的方法，其中所述轉移是用微流體系統完成的。
8.權利要求6的方法，其中所述光學檢測儀器包括毛細管。
9.前述權利要求中任ー項的方法，其中所述反應容器為微量滴定孔。
10.前述權利要求中任ー項的方法，其中所述倍增過程包括PCR。
11.權利要求10的方法，其中所述PCR過程是如專利說明書W02008107683中所概述的。
12.前述權利要求中任ー項的方法，其中定量所存在的大小和確定姆ー種大小的顏色包括多元光學檢測系統，其具有ー個或多個發光源的特徵。
13.權利要求12的方法，其中所述發光源包括ニ極管泵浦固態雷射。
14.權利要求12或13的方法，其中所述光學系統採用具有最少6nm解析度的光譜檢測儀。
15.權利要求12或13的方法，其中所述光學系統採用具有Inm解析度的光譜檢測儀。
16.權利要求12-15中任一項所述的方法，其中待分析的波長為500-700nm。
17.權利要求12-15中任一項所述的方法，其中待分析的波長為300-1000nm。
18.前述權利要求中任ー項的方法，其中將所產生的定量和顔色與已知的數據進行比較以確定所存在的靶擴增物或每種所存在的靶擴增物的性質或其部分的性質的步驟包括應用去卷積軟體，其是基於在所預期的波長帶內是否存在光。
19.前述權利要求中任ー項的方法，其中標記引物包括用螢光染料標記短的寡核苷酸引物序列。
20.權利要求19的方法，其中所述染料包括一種或多種螢光素、TET、HEX。
21.用於實施前述權利要求中任ー項的方法的儀器，其包括 反應容器； 使反應容器中的樣品經受倍增過程的工具； 可操作以根據大小分離擴增物組分的分離臺； 用於定量所存在的大小和確定每種大小的顔色的光學檢測工具；以及 用於將所產生的定量和顔色與已知的數據進行比較以確定所存在的靶擴增物或每種所存在的靶擴增物的性質或其部分的性質的工具。
22.權利要求21的儀器，其中所述反應容器是微量滴定孔。
23.權利要求21或權利要求22的儀器，其中所述樣品倍増工具包括PCR儀。
24.權利要求21-23中任一項的儀器，其中用於使擴增物經受分離電壓的工具包括電泳儀。
25.權利要求21-24中任一項的儀器，其中所述光學檢測工具包括光譜檢測儀。
26.權利要求21-25中任一項的儀器，其中所述分離臺包括用於向擴增物應用電壓的工具。
27.權利要求21-26中任一項的儀器，其包括便攜的可手持試劑盒。
28.在核酸擴增過程中分離擴增物的方法，其採用電泳。
29.權利要求1-20和27中任ー項的方法，其基本上如上文中所描述的。
30.權利要求21-27中任ー項所述的儀器，其基本上如上文中所描述的。
全文摘要
公開了用於檢測樣品中的多種分析物的方法，其包括選擇一個或多個引物；用不同的染料標記每一個引物並置於反應容器中；加入待分析的樣品；使樣品經受倍增過程，根據大小分離擴增子；定量所存在的大小和確定每一種大小的顏色；將所產生的定量和顏色與已知的數據進行比較以確定擴增子的性質。還公開了用於實施所述方法的儀器。
文檔編號B01L3/00GK102803506SQ201080026518
公開日2012年11月28日 申請日期2010年6月14日 優先權日2009年6月15日
發明者D·埃奇, N·納薩雷特, D·沃德 申請人:Bg研究有限公司