一種白藜蘆醇‑二十碳五烯酸酯的製備方法與流程

2023-10-11 12:32:04 3

本發明涉及白藜蘆醇衍生物的製備領域，更具體地說，涉及一種白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯的製備方法。

背景技術：

白藜蘆醇(3,5,4』-三羥基二苯乙烯)是一種天然非黃酮類多酚化合物，主要來源於虎杖和葡萄。相關研究表明，白藜蘆醇是一種重要的生物活性物質，具有抗氧化損傷、抗腫瘤、保護心腦血管、抗衰老、免疫調節等廣泛的生理作用和藥理活性，因此受到世界各地科學家們的深入關注，被大量應用於醫藥和保健品等各個行業領域。

儘管白藜蘆醇對人體有許多健康有益作用，但其經口服進入機體後，快速進入肝臟發生Ⅱ相代謝，生物利用度低，這影響了白藜蘆醇本身的活性效應。

技術實現要素：

本發明的目的在於合成一種白藜蘆醇衍生物——白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯，該物質可以減弱白藜蘆醇在機體內的生物轉化和氧化降解速率，進而增強生物利用度；同時，保證合成方法反應條件溫和、製備及純化過程簡單、終產物純度高。

為了達到上述目的，本發明提供了一種白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯的製備方法，包括如下步驟：

S1、向白藜蘆醇中加入甲基叔丁基醚，充分混勻，得到白藜蘆醇溶液；所述甲基叔丁基醚與白藜蘆醇體積摩爾比為1:0.026～0.044(L/mol)；

S2、取二十碳五烯酸(EPA)加入到步驟S1所得的白藜蘆醇溶液中，充分混勻，得到醇酸混合溶液；所述二十碳五烯酸與白藜蘆醇摩爾比為6～12:1；

S3、取脂肪酶EC 3.1.1.3加入到步驟S2所得的醇酸混合溶液中，充氮氣、密封，得到脂肪酶溶液；所述脂肪酶EC 3.1.1.3≥5000U/g，所述脂肪酶EC3.1.1.3與白藜蘆醇質量摩爾比為100～150:1(g/mol)；

優選方式下，所述脂肪酶EC 3.1.1.3為Novozyme 435，來自南極假絲酵母。

S4、將步驟S3所得的脂肪酶溶液置於35～50℃、150～200rpm環境下振蕩反應48～96h後，置於冰水浴中冷卻，終止酶解，得酶反應溶液；

S5、將步驟S4所得的酶反應溶液過濾，除去脂肪酶，再於35～45℃、相對真空度-0.05～-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去甲基叔丁基醚，得到粗產物；

S6、將體積濃度為95％的乙醇加入到步驟S5所得的粗產物中，加入碳酸鈉和水，氮氣保護，40～50℃回流皂化20～30min，得皂化溶液；所述體積濃度為95％的乙醇與粗產物的體積質量比為10～20:1(mL/g)，所述碳酸鈉與粗產物質量比為0.8～1.2:1，所述水與粗產物體積質量比為4～6:1(mL/g)；

S7、將步驟S6所得的皂化溶液用正己烷萃取1～3次，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水後，於35～45℃、相對真空度-0.05～-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去正己烷，得到白藜蘆醇-二十碳五烯酸酯；每次萃取所用正己烷的體積與步驟S5中所用體積濃度為95％的乙醇的體積的比為2～6:1。

本發明的技術創新在於：

1、本發明反應條件溫和，耗時較短，產物酯化率高，製備的白藜蘆醇-EPA酯不需要採用柱層析等方法純化，終產物的純度高。

2、本發明方法合成白藜蘆醇衍生物，在酶的催化下，將白藜蘆醇與二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)反應製備白藜蘆醇酯，可以減弱白藜蘆醇在機體內的生物轉化和氧化降解速率，進而增強生物利用度；同時，白藜蘆醇可以抗氧化損傷等，而EPA也具有減緩冠狀動脈心臟病、高血壓和炎症等功能，通過合成的白藜蘆醇-EPA酯，可同時發揮白藜蘆醇和EPA在健康有益方面的作用。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。

實施例1

S1、取0.1mol白藜蘆醇於可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.026(L/mol)，充分混勻；

S2、取0.6mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在100:1(g/mol)，然後向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置於恆溫水浴振蕩器中進行反應，反應溫度為40℃，振蕩速度為150rpm，反應時間為48h，反應完成後，取出置於冰水浴中冷卻，終止酶解；

S5、將S4所得的溶液經0.22μm有機濾膜過濾，除去脂肪酶，再於溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去甲基叔丁基醚，得到粗產物；

S6、在S5所得粗產物中加入體積濃度為95％乙醇，體積濃度為95％乙醇：粗產物控制在10:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產物控制在0.8:1(g/g)；加入水，水：粗產物控制在4:1(mL/g)，將上述反應混合物在氮氣流保護下回流皂化30min，反應溫度控制在40℃；

S7、將S6所得混合物，轉移至分液漏鬥中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在2:1(mL/mL)，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然後於35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質量為19.2771g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為37.6％。採用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯其的純度為80.3％。

實施例2

S1、取0.1mol白藜蘆醇於可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.044(L/mol)，充分混勻；

S2、取1.2mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在150:1(g/mol)，然後向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置於恆溫水浴振蕩器中進行反應，反應溫度為40℃，振蕩速度為150rpm，反應時間為48h，反應完成後，取出置於冰水浴中冷卻，終止酶解；

S5、將S4所得的溶液經0.22μm有機濾膜過濾，除去脂肪酶，再於溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去甲基叔丁基醚，得到粗產物；

S6、在S5所得粗產物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產物控制在20:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產物控制在1.2:1(g/g)；加入水，水：粗產物控制在6:1(mL/g)，將上述反應混合物在氮氣流保護下回流皂化30min，反應溫度控制在40℃；

S7、將S6所得混合物，轉移至分液漏鬥中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在6:1(mL/mL)。萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然後於溫度35℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質量為20.2000g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為39.4％。採用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為84.7％。

實施例3

S1、取0.1mol白藜蘆醇於可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.03(L/mol)，充分混勻；

S2、取1.0mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在110:1(g/mol)，然後向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置於恆溫水浴振蕩器中進行反應，反應溫度為45℃，振蕩速度為180rpm，反應時間為60h，反應完成後，取出置於冰水浴中冷卻，終止酶解；

S5、將S4所得的溶液經0.22μm有機濾膜過濾，除去脂肪酶，再於溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉蒸發，除去甲基叔丁基醚，得到粗產物；

S6、在S5所得粗產物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產物控制在12:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產物控制在1.0:1(g/g)；加入水，水：粗產物控制在5:1(mL/g)。將上述反應混合物在氮氣流保護下回流皂化25min，反應溫度控制在45℃；

S7、將S6所得混合物，轉移至分液漏鬥中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在3:1(mL/mL)。萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然後於溫度40℃、相對真空度-0.06Mpa條件下旋轉蒸發，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質量為19.5335g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為38.1％。採用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為82.6％。

實施例4

S1、取0.1mol白藜蘆醇於可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.035(L/mol)，充分混勻；

S2、取1.2mol EPA加入S1所得溶液中；

S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在120:1(g/mol)，然後向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置於恆溫水浴振蕩器中進行反應，反應溫度為45℃，振蕩速度為180rpm，反應時間為60h，反應完成後，取出置於冰水浴中冷卻，終止酶解；

S5、將S4所得的溶液經0.22μm有機濾膜過濾，除去脂肪酶，再於溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉蒸發，除去甲基叔丁基醚，得到粗產物；

S6、在S5所得粗產物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產物控制在14:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產物控制在1.1:1(g/g)；加入水，水：粗產物控制在5:1(mL/g)，將上述反應混合物在氮氣流保護下回流皂化30min，反應溫度控制在40℃；

S7、將S6所得混合物，轉移至分液漏鬥中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在4:1(mL/mL)。萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然後於溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉蒸發，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質量為20.5590g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為40.1％。採用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為85.4％。

實施例5

S1、取0.1mol白藜蘆醇於可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.039(L/mol)，充分混勻；

S2、取1.1mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在130:1(g/mol)，然後向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置於恆溫水浴振蕩器中進行反應，反應溫度為50℃，振蕩速度為180rpm，反應時間為72h，反應完成後，取出置於冰水浴中冷卻，終止酶解；

S5、將S4所得的溶液經0.22μm有機濾膜過濾，除去脂肪酶，再於溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉蒸發，除去甲基叔丁基醚，得到粗產物；

S6、在S5所得粗產物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產物控制在16:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉的質量：粗產物控制在1.1:1(g/g)；加入水，水：粗產物控制在5:1(mL/g)，將上述反應混合物在氮氣流保護下回流皂化30min，反應溫度控制在40℃；

S7、將S6所得混合物，轉移至分液漏鬥中，用正己烷萃取3次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在5:1(mL/mL)，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然後於溫度40℃、相對真空度-0.07Mpa條件下旋轉蒸發，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其質量為19.7386g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為38.5％。採用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為82.8％。

實施例6

S1、取0.1mol白藜蘆醇於可密封的玻璃容器中，緩慢加入甲基叔丁基醚，甲基叔丁基醚:白藜蘆醇控制在1:0.03(L/mol)，充分混勻；

S2、取1.0mol EPA加入S1所得溶液中，充分混勻；

S3、取脂肪酶(Novozyme 435，≥5000U/g，EC 3.1.1.3，來自南極假絲酵母)加入S2所得溶液中，酶:白藜蘆醇控制在140:1(g/mol)，然後向玻璃容器充氮氣密封；

S4、將玻璃容器置於恆溫水浴振蕩器中進行反應，反應溫度為45℃，振蕩速度為180rpm，反應時間為96h，反應完成後，取出置於冰水浴中冷卻，終止酶解；

S5、將S4所得的溶液經0.22μm有機濾膜過濾，除去脂肪酶，再於溫度40℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去甲基叔丁基醚，得到粗產物；

S6、在S5所得粗產物中加入95％乙醇，95％乙醇：粗產物控制在18:1(mL/g)；加入碳酸鈉，碳酸鈉：粗產物控制在1.2:1(g/g)；加入水，水：粗產物控制在6:1(mL/g)，將上述反應混合物在氮氣流保護下回流皂化30min，反應溫度控制在40℃；

S7、將S6所得混合物，轉移至分液漏鬥中，用正己烷萃取2次，每次萃取用正己烷:S5中95％乙醇控制在5:1(mL/mL)，萃取所得正己烷層用無水硫酸鈉除水，然後於溫度40℃、相對真空度-0.08Mpa條件下旋轉蒸發，除去正己烷，得到白藜蘆醇-EPA酯，其其質量為21.3792g。通過上述步驟，白藜蘆醇的酯化率為41.7％。採用高效液相-紫外檢測器(HPLC-UV)的檢測，白藜蘆醇-EPA酯的純度為87.8％。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。