一種VEGF轉染膠原蛋白組織修復材料的製備方法與流程
2023-10-09 05:45:59 1
本發明屬於複合生物材料製備領域，具體涉及一種vegf轉染膠原蛋白組織修復材料的製備方法。
背景技術：
生物材料發展至今已經經歷了三個主要階段。自20世紀80年代以來，以醫療、保健及增進生活質量等為目的的生物醫用材料取得了快速的發展，已經有超過50種植入器械被應用於臨床，一般來源於技術成熟的工程材料，並且具有生物相容性和缺損組織替代功能，例如已廣泛應用於臨床的心人工血管、人工關節和人工腎等。上述生物醫用材料，具有一個普遍的共性:生物惰性。即生物醫用材料發展所遵循的原則是儘量將受體對植入器械的異物反應降到最低。從上世紀80年代到90年代，生物醫用材料領域的重點逐漸由生物惰性轉向生物活性和可控降解性，開發了第二代生物醫用材料及產品。
20世紀90年代後期，第三代生物材料是伴隨著組織工程學的建立、發展而迅速發展起來的。以組織工程生物材料支架為代表，其綜合了工程科學和生命科學原理，為種子細胞提供了適合其生長、基質合成及發揮其他功能的生物學空間，克服了以往單一的細胞移植中細胞不易成活、基質合成能力低下等缺點，為組織工程化組織的構建提供了細胞載體和結構支架。這類生物醫用材料將生物活性材料與可降解材料這兩個獨立的概念結合起來，在可降解材料上進行分子修飾，引起細胞整合素的相互作用，誘導細胞增殖、分化，以及細胞外基質的合成與組裝。但目前所應用於組織工程的生物材料的性能還有待進一步提高，不能滿足現代醫藥的需求。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種vegf轉染膠原蛋白組織修復材料的製備方法，進一步提高了組織修復材料的細胞粘附性及生物活性。
本發明採用以下技術方案：
一種vegf轉染膠原蛋白組織修復材料的製備方法，包括以下步驟：
步驟一：將1mllb液體培養基和20μl、10％v/v葡萄糖置於離心管中，將1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到離心管中，置於30℃，120-260rpm/min，震蕩培養過夜，得vegf懸液；
步驟二：將350mg明膠溶解於60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解製得明膠溶液；
步驟三：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二醯亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恆溫水槽中40℃攪拌48小時後，將溶液置於透析袋中，放入盛有超純水的燒杯中，並置於電熱恆溫水槽於40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟四：取出透析袋中殘留的溶液，置於-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置於凍幹機上乾燥48h，得粘附性明膠；
步驟五：將粘附性明膠製成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調節水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟六：將3mg/ml的膠原蛋白溶液與10×pbs以4:1的體積比在4℃下充分混勻，用0.1mnaoh調節ph至8,向溶液中加入nah2po4及nacl,並使膠原蛋白溶液的終濃度為2mg/ml，nah2po4的終濃度為10mm，nacl的終濃度為100mm，然後將溶液轉置35℃水浴反應24h；
步驟七：反應結束後，離心除去上清液，並將沉澱溶於蒸餾水中，透析除鹽，即得纖維化的膠原蛋白溶液；
步驟八：稱取棉短絨，將其溶解在氫氧化鋰/尿素水溶液中，配製成質量濃度4％的纖維素溶液，所述的氫氧化鋰/尿素水溶液採用氫氧化鋰8.76g、尿素12g及水79.24g配製而成，並加入膠原蛋白溶液充分攪拌均勻、過濾、靜置24h，於20kv條件下靜電紡絲得膠原蛋白纖維膜；
步驟九：將多巴胺修飾溶液均勻噴塗於膠原蛋白纖維膜表面，並於37℃乾燥箱乾燥12h後，用磷酸鹽緩衝液(pbs)漂洗3次；
步驟十：將膠原蛋白纖維膜浸泡於vegf懸液中48h得vegf轉染膠原蛋白組織修復材料。
步驟一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化學研究所伊藤ナノ醫工學研究室提供。
優選的，步驟三中所述的透析袋殘留分子量為10000da。
優選的，所述的步驟三中超純水用量為漫過透析袋。
優選的，步驟九中噴塗的厚度為5-30nm。
本發明的有益效果在於：
1)多巴胺是神經激素中的一種化合物，含有豐富的乙氨基和兒茶酚活性官能團，幾乎能粘附在任何機體的表面，尤其對於有機表面效果更佳。多巴胺修飾後的明膠的黏附性較高，且在材料表面上形成了聚合的多巴胺-明膠層。多巴胺的修飾，不僅提高了固定的明膠的含量，同時促進了細胞的粘附，加強了材料表面的細胞相容性。
2)明膠分子結構上含有大量的羥基及少量的羧基和氨基，具有極強的親水性。因此，明膠分子中的羧基可以與多巴胺的氨基發生縮合反應。明膠具有其他合成材料無法比擬的生物相容性、可降解性以及生物活性。
3)vegf又稱血管通透性生長因子是目前發現的作用最強的促血管生成細胞生長因子，明膠可以和生長因子相互作用而結合在一起，可以有效提高組織修復材料上生長因子的數量。
4)纖維素作為一種生物材料，具有良好的生物適應性和生物活性，能作用於創面修復的多個環節，促進創面的快速癒合。以纖維素為原料製成的傷口敷料柔軟透明、舒適；有良好的通透性，能為創面提供溼潤、微酸的修復環境；能調節創面氧張力，促進毛細血管形成，從而加速傷口的癒合。
5)膠原蛋白本身就是細胞外基質的主要成分，膠原蛋白能與細胞或周圍基質相互作用，表現出良好的協調性；膠原蛋白分子內和分子間的共價交聯賦予了膠原蛋白較高強度的機械性能；膠原蛋白可以和血小板粘合，凝聚形成血栓而阻止血流，從而起到止血的效果；膠原蛋白的網絡骨架結構對細胞起錨定、支持作用，能促進細胞的生長、增殖和遷移。
具體實施方式
以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例1
一種vegf轉染膠原蛋白組織修復材料的製備方法，包括以下步驟：
步驟一：將1mllb液體培養基和20μl、10％v/v葡萄糖置於離心管中，將1mgpmal-v2/mbp-vegf加入到離心管中，置於30℃，120-260rpm/min，震蕩培養過夜，得vegf懸液；
步驟二：將350mg明膠溶解於60ml水中，水浴加熱到50℃攪拌至完全溶解製得明膠溶液；
步驟三：將明膠溶液與150mgn-羥基丁二醯亞胺、191mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺及103mg多巴胺混合，在電熱恆溫水槽中40℃攪拌48小時後，將溶液置於透析袋中，透析袋殘留分子量為10000da，將透析袋放入盛有超純水的燒杯中，超純水用量為漫過透析袋的位置，並將燒杯置於電熱恆溫水槽於40℃條件下攪拌2-3day，且每隔8h換一次超純水；
步驟四：取出透析袋中殘留的溶液，置於-20℃冷凍箱中冷凍8h，再置於凍幹機上乾燥48h，得粘附性明膠；
步驟五：將粘附性明膠製成3mg/ml的水溶液，用hcl和naoh調節水溶液ph值至7，即得多巴胺修飾溶液；
步驟六：將3mg/ml的膠原蛋白溶液與10×pbs以4:1的體積比在4℃下充分混勻，用0.1mnaoh調節ph至8,向溶液中加入nah2po4及nacl,並使膠原蛋白溶液的終濃度為2mg/ml，nah2po4的終濃度為10mm，nacl的終濃度為100mm，然後將溶液轉置35℃水浴反應24h；
步驟七：反應結束後，離心除去上清液，並將沉澱溶於蒸餾水中，透析除鹽，即得纖維化的膠原蛋白溶液；
步驟八：稱取棉短絨，將其溶解在氫氧化鋰/尿素水溶液中，配製成質量濃度4％的纖維素溶液，所述的氫氧化鋰/尿素水溶液採用氫氧化鋰8.76g、尿素12g及水79.24g配製而成，並加入膠原蛋白溶液充分攪拌均勻、過濾、靜置24h，於20kv條件下靜電紡絲得膠原蛋白纖維膜；
步驟九：將多巴胺修飾溶液均勻噴塗於膠原蛋白纖維膜表面，噴塗的厚度為5-30nm，並於37℃乾燥箱乾燥12h後，用磷酸鹽緩衝液(pbs)漂洗3次；
步驟十：將膠原蛋白纖維膜浸泡於vegf懸液中48h得vegf轉染膠原蛋白組織修復材料。
步驟一中所述的pmal-v2/mbp-vegf由理化學研究所伊藤ナノ醫工學研究室提供。
細胞粘附實驗：取培養的huvec細胞，消化，細胞計數，以5×103cell/ml密度接種在實施例1製得的組織修復材料及空白對照組膠原蛋白材料上，每孔1ml，接種0.5h、1h、2h後，用無菌的pbs溶液漂洗，鏡下觀察並照相計數，結果見下表1。可以看出經過多巴胺修飾後的膠原蛋白組織修復材料所粘附的細胞數量明顯多於沒有經過修飾的空白對照組的細胞數量。
表1
細胞增殖實驗：取培養的huvec細胞，消化，細胞計數，以5×103cell/ml密度接種在實施例1製得的組織修復材料及空白對照組膠原蛋白材料上，每孔1ml，隔兩天換液，接種5day後，細胞計數試劑盒wst-8檢測材料表面的細胞活性，結果見表2，可以得出經過多巴胺修飾後的膠原蛋白組織修復材料的細胞活性略高於空白實驗組的細胞活性。
表2