重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的純化方法
2023-10-09 13:17:09
專利名稱：重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的純化方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質純化領域，更具體地，本發明提供了一種重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白的純化方法。
背景技術：
作為一個主要的免疫調節因子，白介素-l(Interleukin-l，IL-1)在機體的免疫及能量代謝調節中起到重要的作用。研究發現，IL-I在自身免疫性疾病如類風溼關節炎(Rheumatoid arthritis, RA)、多發性硬皮病(Systemic sclerosis)、II 型糖尿病(Type2diabetes)、肥胖症(Obesity)的發病過程中起到非常重要的作用，最近的研究表明，IL-I還與某些種類的心血管疾病的發生相關。白介素 I 受體拮抗劑(Interleukin-1 receptor antagonist, IL-1 Ra)是人體內 天然存在的一種蛋白質分子，其在體內可以與IL-I的受體特異性地結合，滅活相應的信號傳導途徑，從而對IL-I引起的機體損傷有保護作用。通過GenBank查詢可以得到人白介素I受體拮抗劑的全基因序列，本專利中IL-IRa的基因序列對應GenBank號為M63099. I。美國食品和藥品管理局(FDA)在2001年11月批准Amgen(安進)公司的重組人IL-IRa(Kineret ，Anakinra)上市，主要用於對常規藥物無效的頑固性類風溼關節炎患者，目前該藥也用於II型糖尿病的治療，並取得了良好的效果。Anakinra為大腸桿菌表達的重組IL-IRa蛋白質，治療期間需每天注射給藥，頻繁的用藥加重了病人的身體、心理和經濟負擔，因此長效的IL-IRa的研究開發具有重要意義。將目的蛋白質與生物體內天然存在的蛋白質進行融合表達，是一種延長藥物生物學半壽期的主要方式之一。目前常用的載體蛋白質有兩種人血清白蛋白(Human serumalbumin，HSA)，通過GenBank查詢可以得到人血清白蛋白的全基因序列，本專利中HSA基因序列對應GenBank號為NM_000477。通過酵母細胞分泌表達獲得融合蛋白，如美國HGS公司研製的長效HSA-幹擾素融合蛋白，目前已經進入臨床使用。其在體內的平均半衰期為157個小時，只需每二周注射一次即可獲得比較滿意的臨床治療效果；另一種載體為免疫球蛋白的Fe片段，通常選擇CHO細胞作為宿主細胞進行表達，如上海中信國健藥業有限公司生產的益賽普注射液為人II型腫瘤壞死因子受體-抗體的融合蛋白，臨床上用於中度及重度活動性類風溼性關節炎患者的治療。目前，陳樞青等已經構建了四種由HSA與ILl-Ra通過不同方式融合的重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白的表達載體，分別為pPIC9-HSA-ILl-Ra質粒、pPIC9-HSA-(G)n-ILl-Ra 質粒、pPIC9-ILl-Ra-HSA 質粒和 pPIC9-ILl-Ra- (G)n-HSA 質粒(專利號ZL200810060568. 7)，本發明將該專利全文引用，這四種表達載體通過電擊轉化插入到畢赤酵母菌株GS115或SMD1168中，表達出的四種融合蛋白分別為HSA-IL_lRa (無連接肽，本文簡稱HI融合蛋白)、HSA-(G)n -IL-IRa (本文簡稱H(G)nI融合蛋白)、IL-IRa-HSA (無連接肽，本文簡稱IH融合蛋白)、IL-I-(G)n -HSA (本文簡稱I (G)nH融合蛋白)；所述(G)n的序列為[GlyGlyGlyGlySer]η，η為1-4的整數。沈其等對HSA-G-IL-IRa的搖瓶發酵液上清在實驗室規模進行純化，先經親和層析，最後用Q Sepharose XL層析得到純化產物(沈其，陳樞青.HSA / ILlra融合蛋白的純化及生物學活性研究.浙江大學學報，2009，Vol 38, No3:260-264)。我們在對融合蛋白進行純化研究時發現，四種融合蛋白自身含有一些水解酶的酶切位點，會被發酵過程中產生的一些水解酶所識別並切斷從而產生一些降解蛋白，這種現象在大規模發酵中比搖瓶發酵更為明顯，其中一些降解蛋白由於性質與融合蛋白極為接近，因此很難除去，給純化工作帶來了很大不便。同時，在酵母細胞的大規模發酵中，由於發酵條件不同，其發酵液上清中的雜質成分較搖瓶發酵液上清複雜得多，除了一些不同於搖瓶發酵的雜蛋白外，還會產生大量色素類物質，正是由於蛋白降解程度和雜質成分相差較大，所以實驗室規模的搖瓶發酵純化方法過於簡單，不能完全夠除去大規模發酵生產時產生的降解蛋白以及其他一些雜質。此外，在實驗室規模搖瓶發酵實驗中，發酵液上清除了目的蛋白和降解蛋白幾乎沒有其他雜質，因此第一步純化採用親和層析即可有效捕獲目的蛋
白。而由於在大規模發酵生產中的雜質成分較複雜，其中一些雜質很容易損壞親和層析填料從而降低其使用壽命。由於親和層析填料成本較高，所以在大規模發酵生產中親和層析並不適合用於第一步純化。
發明內容
本發明提供了一種重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白(簡稱為融合蛋白)的純化方法，在經過了大量改進和條件優化後，得到了較佳的工藝路線。本純化方法能夠有效除去在大規模發酵生產融合蛋白時產生的雜蛋白和降解蛋白，既可以節約成本，又可以得到高純度的目的蛋白。本發明所提供的純化方法包括(I)將能夠表達重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白的基因工程菌株進行發酵表達，獲得含有目的蛋白的發酵液，經預處理製得含目的蛋白的濃縮液，所述目的蛋白為HSA-IL-IRa, HSA- (G) n_IL_lRa、IL-IRa-HSA 或 IL-IRa- (G) n_HSA，其中(G) n 為肽接頭，G的序列為GlyGlyGlyGlySer, η為1-4的整數；(2)將上步所得的濃縮液進行強陰離子交換層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，所用層析介質含有季銨基或季銨乙基配基且所用介質的基質為瓊脂糖或葡聚糖；(3)將上步所得洗脫液進行藍膠親和層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，所用層析介質含有Cibacron Blue配基；(4)將上步所得洗脫液進行弱陰離子交換層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，其中弱陰離子交換層析所用介質含有二乙基氨基乙基配基，所述介質的基質為瓊脂糖、葡聚糖或聚甲基丙烯酸甲酯；所用洗脫目的蛋白的緩衝液含有l(T50mM NaH2PO4 (表示在緩衝液中的終濃度，全文均沿用此表述方式)和2(T35mM NaCl，pH為5. 5飛.5。進一步，所述重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白為IL-IRa-G-HSA融合蛋白(本文簡稱IGH融合蛋白)，G的序列為GlyGlyGlyGlySer。進一步，步驟I發酵中，目的蛋白的表達形式為分泌表達，所用表達載體為pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPIC9 或 pPIC9K :當載體為 pPICZ a A、pPICZ a B 或pPICZ a C時，所用宿主細胞為巴斯德畢赤酵母X33 ；當載體為pPIC9或pPIC9K時，所用宿主細胞為巴斯德畢赤酵母GSl 15或巴斯德畢赤酵母SMDl 168。其中重組酵母使用本領域常規方法構建，如利用我公司專利ZL 200810060568. 7(CN101255197B)中四種融合蛋白表達載體 pPIC9-HSA_ILl-Ra 質粒、pPIC9_HSA_(G)n-ILl-Ra 質粒、pPIC9-ILl-Ra-HSA 質粒和 pPIC9_ILl_Ra-(G)n-HSA 質粒得到四種融合蛋白基因片段，此基因片段也可以通過基因工程方法插入到其他表達載體當中；人血清白蛋白天然存在多態性，本發明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括這些多態型；可根據Invitrogen公司畢赤酵母發酵手冊上提供的BSM基礎鹽培養基和培養方法對融合蛋白進行100L發酵培養，從而得到含有目的蛋白的發酵液。進一步，步驟4所用的弱陰離子交換層析介質選自DEAE Sepharose CL_6B、DEAE Sepharose F. F.、DEAE Sephadex A-50、DEAE-650M、DEAE-650C 和 Macro-Prep DEAE,優選DEAE Sepharose CL-6B。因這些介質均含有二乙基氨基乙基(DEAE)配基，經過此步層析，最終可以有效將融合蛋白的降解蛋白等一些頑固雜質成分除去，得到高純度的融合蛋白。進一步，步驟4中層析前預先將柱平衡，所用平衡緩衝液含有l(T50mM NaH2POjP20mM NaCl, pH 為 5. 5 6. 5，優選平衡緩衝液含有 20mM NaH2PO4 和 20mM NaCl, pH 為 5. 5 或
6.5 ;所用洗脫目的蛋白的緩衝液為含有20mM NaH2PO4和35mM NaCl, pH為5. 5的緩衝液，或為含有20mM NaH2PO4和20mM NaCUpH 6. 5的緩衝液。事實上，本文所有緩衝液中，兩性鹽NaH2PO4均可優選為20mM，當然，緩衝液中NaH2PO4處於l(T50mM範圍內其他濃度條件的，最終亦可達到同樣的純化效果。進一步，步驟2所述的強陰離子交換層析介質為Q Sepharose Fast Flow、QAESephadex A_50或QAE-550C，這幾種強陰離子交換層析填料為常用的粗提純介質，有著高流速高載量的特點，都有著良好的粗純效果，能夠在有效捕獲目的蛋白的同時除去大部分雜質，優選 Q Sepharose Fast Flow。進一步，步驟2中層析前預先將柱平衡，所用平衡緩衝液A1含有l(T50mM Tris和l(T50mM NaCl，pH 為 6. 5 7. 5，優選平衡緩衝液 A1 含有 20mM Tris 和 20mM NaCl，pH 為 7. O;所用洗脫緩衝液B1含有l(T50mM Tris和10(T200mM NaCl，pH為6. 5 7. 5，優選洗脫緩衝液B1含有20mM Tris和160mM NaCl，pH為7. O。上樣前，可將樣品電導調整到6mS/cm，pH調整到7.0。進一步，步驟3所述的親和層析介質選自AF-Blue HC-650M、Blue Sepharose 6Fast Flow CL-6B、Capto Blue、Capto Blue (high sub)和 Affi-GeI Blue,優選 AF-BlueHC-650M。進一步，步驟3中層析前預先將柱平衡，所用平衡緩衝液A2含有l(T50mM的Tris和20 200mM NaCl，pH為6. 5 7. 5，優選平衡緩衝液A2含有20mM Tris和O. IM NaCl，pH為
7.O ;所用洗脫緩衝液B2含有10 50mM Tris和800 1300mM NaCl，pH為6. 5 7. 5，優選洗脫緩衝液B2含有20mM Tris和IOOOmM NaCl, pH為7. O。上樣前，可將樣品電導調整到6mS/cm, pH調整到7. O。進一步，由於藍膠親和層析所用洗脫液的電導較高，所以步驟4弱陰離子交換層析上樣前，預先調低樣品電導，以免上樣過程中樣品流穿無法掛柱。所述調整方法包括稀釋、超濾置換或凝膠脫鹽，優選G25凝膠脫鹽。進一步，所述調整方法包括G25凝膠脫鹽法，所用的脫鹽介質選自S^hadex G25Fine, Sephadex G25 Medium, Sephadex G25 Coarse 或 Sephadex G25 superfine,優選Sephadex G25 Fine ;使用的脫鹽緩衝液含有5 10mM的Tris，pH值為6· 5 7· 5，優選脫鹽緩衝液含有8mM Tris，pH為7. O。上樣前，可將樣品pH調整到7. O。當紫外吸收峰出現時開始收取樣品，當紫外峰降到基線、電導峰出現時停止收集樣品。進一步，所述預處理包括離心、超濾澄清與超濾濃縮，可按下述步驟進行a)離心發酵液，收取上清；b )將發酵液上清用500K超濾膜進行澄清；c)將澄清液用30K超濾膜進行10倍濃縮， 製得含有融合蛋白的樣品濃縮液。用本方法純化的IGH融合蛋白經過SDS-PAGE和SEC-HPLC檢測，純度可達到98%以上，能夠達到藥效學研究的標準；通過另外三種融合方式形成的融合蛋白(即HI、H (G)nI,IH融合蛋白)，與I (G) nH性質接近，用本方法可製備其同樣高純的融合蛋白產品。本發明的優勢在於I)在大規模發酵產物的第一步純化使用了高流速高載量性質的強陰離子交換層析填料，耐用性較好且成本相對親和層析填料較低，在有效捕獲目的蛋白的同時可以去除大部分不同於搖瓶發酵的雜蛋白和色素類物質，因此降低了後續親和填料的損耗，從而節約了成本。2)採用的Blue介質可特異性吸附含rHSA結構的物質，可以有效除去在融合蛋白的大規模發酵中產生的雜蛋白，特別是最後一步層析改用配基為二乙基氨基乙基的介質，該層析填料可以在有效吸附與目的蛋白性質接近的降解蛋白和其他一些頑固雜質的同時，於低電導條件下將目的蛋白選擇性洗脫，從而得到較高純度的目的蛋白，有效解決了在大規模發酵生產中無法得到足夠純度的目的蛋白的難題。
以下電泳圖譜中所涉及的M均表示蛋白Marker 圖I、IGH融合蛋白Q Sepharose Fast Flow層析柱純化前後的SDS-PAGE電泳圖譜。I :融合蛋白Q Sepharose Fast Flow層析柱純化前即實施例I所得蛋白樣品的電泳結果；2 :融合蛋白Q Sepharose Fast Flow層析柱純化後即實施例2所得蛋白樣品的電泳結
果O圖2、實施例2 IGH融合蛋白Q Sepharose Fast Flow層析柱純化後樣品SEC-HPLC檢測圖譜，目的蛋白於9. 2分鐘出峰，蛋白峰面積比例為45%。。圖3、IGH融合蛋白AF-Blue HC-650M層析柱純化前後的SDS-PAGE電泳圖譜。I :融合蛋白AF-Blue HC-650M層析柱純化前即實施例2所得蛋白樣品的電泳結果；2 :融合蛋白AF-Blue HC-650M層析柱純化後即實施例3所得蛋白樣品的電泳結果。圖4、實施例3 IGH融合蛋白AF-Blue HC-650M層析柱純化後樣品SEC-HPLC圖譜，目的蛋白於9. 2分鐘出峰，降解蛋白於9. 6分鐘出峰，目的蛋白峰面積比例為65%。圖5、IGH融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化前後的SDS-PAGE電泳圖譜。I :融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化前即實施例4所得蛋白樣品的電泳結果；2 :融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化後即實施例5所得蛋白樣品的電泳結果O
圖6、實施例5 IGH融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化後樣品SEC-HPLC圖譜，目的蛋白於9. 2分鐘出峰，目的蛋白峰面積比例大於98%。圖7、實施例6 IGH融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化前後的SDS-PAGE電泳圖譜。I :融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化前即實施例4所得蛋白樣品的電泳結果；2 :實施例6單用含20mM NaCl的緩衝液洗脫所得蛋白樣品的電泳結果；3 :實施例6單用含35mM NaCl的緩衝液洗脫所得蛋白樣品的電泳結果。圖8、實施例6單用含35mM NaCl的緩衝液洗脫所得樣品的SEC-HPLC圖譜，目的蛋白於9. 2分鐘出峰，目的蛋白峰面積比例大於88%。圖9、實施例5 IGH融合蛋白最終純化結果SDS-PAGE電泳圖譜。M :蛋白Marker ；Γ6 :實施例5 IGH融合蛋白最終純化所得6份樣品的電泳結果。·圖10、IGH融合蛋白純化過程SDS-PAGE電泳硝酸銀染色圖譜。I :實施例2融合蛋白Q Sepharose Fast Flow層析柱純化後電泳硝酸銀染色結果；2 :實施例3融合蛋白AF-Blue HC-650M層析柱純化後電泳銀染結果；3 :實施例5融合蛋白DEAE SepharoseCL-6B層析柱純化後電泳銀染結果。
具體實施例方式實施例I重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白發酵液的預處理(以IGH融合蛋白為例)一實驗材料500K和30K超濾膜包以及超濾夾具均購自密理博公司。二操作步驟I發酵採用的菌株為pPIC9_IGH/GS115,根據Invitrogen公司畢赤酵母發酵手冊上提供的BSM基礎鹽培養基和培養方法對融合蛋白進行IOOL發酵培養，從而得到含有目的蛋白的發酵液。2將發酵液IOOOOrpm離心，棄菌體，收取上清液備用。3將發酵上清液用等體積的純化水稀釋後用500K超濾膜包進行澄清，入口壓力<20psi,回流壓力〈lOpsi,棄截留液,濾過液備用。4將500K超濾澄清液用30K超濾膜包進行濃縮，入口壓力<20psi，回流壓力〈lOpsi,棄濾過液,截留液備用。實施例2重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白Q Sepharose Fast Flow層析柱純化(以IGH融合蛋白為例)一實驗材料蛋白層析柱購自GE公司；Q Sepharose Fast Flow填料購自GE公司；AKTA蛋白純化系統購自GE公司。二操作步驟I溶液配製平衡緩衝液A1 20mM Tris+20mM NaCl，pH 值為 7· O洗脫緩衝液B1 20mM Tris+160mM NaCl，pH 值為 7· O2 平衡
用緩衝液A1衝洗柱床2個柱體積以上，直到流入層析柱的緩衝液與流出層析柱的緩衝液電導值與PH相同，於此時紫外調零。3 上樣將實施例I製得的、含有重組人長效白介素I受體拮抗劑蛋白樣品的超濾濃縮液，電導調整到6mS/cm，pH調整到7. O後，進行上樣。4 洗脫上樣結束後，繼續用緩衝液A1平衡I個柱體積，然後緩衝液B1液衝洗層析柱以洗脫目的蛋白，收集紫外吸收峰樣品，直至出峰結束，基線回到上樣前的水平。所得純化樣品SDS-PAGE檢測結果參見圖1，HPLC檢測結果參見圖2。實施例3重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白AF-Blue HC-650M層析柱純化(以IGH融合蛋白為例)一實驗材料蛋白層析柱購自GE公司；AF_Blue HC-650M填料購自TOSOH公司；AKTA蛋白純化系統購自GE公司。二操作步驟I溶液配製平衡緩衝液A2 20mM Tris+0. IM NaCl，pH 值為 7· O洗脫緩衝液B2 20mM Tris+1M NaCl，pH 值為 7· O2 平衡用緩衝液A2衝洗柱床2個柱體積以上，直到流入層析柱的緩衝液與流出層析柱的緩衝液電導值與PH相同，於此時紫外調零。3 上樣將實施例2製得的、經過第一步強陰離子交換層析洗脫的蛋白樣品電導調整到6mS/cm, pH調整到7. O後，進行上樣。4 洗脫上樣結束後，繼續用緩衝液A2平衡I個柱體積，然後緩衝液B2洗脫，收集紫外吸收峰樣品，直至出峰結束，基線回到上樣前的水平。純化樣品SDS-PAGE檢測結果參見圖3，HPLC檢測結果參見圖4。實施例4重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白S印hadex G25 Fine層析柱脫鹽(以IGH融合蛋白為例)一實驗材料蛋白層析柱購自GE公司；S^)hadex G25 Fine填料購自GE公司；AKTA蛋白純化系統購自GE公司。二操作步驟I溶液配製脫鹽緩衝液8mM Tris, pH值為7. O2 平衡用脫鹽緩衝液衝洗柱床2個柱體積以上，直到流入層析柱的緩衝液與流出層析柱的緩衝液電導值與PH相同，於此時紫外調零。
3 上樣將實施例3製得的、經過第二步親和層析洗脫的蛋白樣品pH調整到7.0，根據層析介質柱體積確定上樣體積後進行上樣。4樣品收集收集出峰樣品，直至紫外出峰結束，此時電導曲線開始上升，停止收集樣品。當電導曲線下降到基線時，繼續上樣，反覆數次，直至所有樣品脫鹽結束為止。實施例5重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化(以IGH融合蛋白為例)一實驗材料
蛋白層析柱購自GE公司；DEAE Sepharose CL-6B填料購自GE公司；AKTA蛋白純化系統購自GE公司。二操作步驟I溶液配製平衡緩衝液A3 20mM NaH2P04+20mM NaCl，pH 值為 6· 5洗脫緩衝液與平衡緩衝液A3相同2 平衡用A3液衝洗柱床2個柱體積以上，直到流入層析柱的緩衝液與流出層析柱的緩衝液電導值與PH相同，於此時紫外調零。3 上樣將實施例4製得的脫鹽樣品進行上樣。4 洗脫上樣結束後，繼續用緩衝液A3平衡I個柱體積左右會有紫外吸收峰出現，收集出峰樣品，直至紫外出峰結束，基線回到上樣前的水平，此樣品為最終目的蛋白。純化樣品SDS-PAGE檢測結果參見圖5，HPLC檢測結果參見圖6。實施例6重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白DEAE Sepharose CL-6B層析柱純化(以IGH融合蛋白為例)一實驗材料蛋白層析柱購自GE公司；DEAE Sepharose CL-6B填料購自GE公司；AKTA蛋白純化系統購自GE公司。二操作步驟I溶液配製平衡緩衝液A4 20mM NaH2P04+20mM NaCl，pH 值為 5· 5洗脫緩衝液B4 20mM NaH2P04+35mM NaCl，pH 值為 5· 52 平衡用A4液衝洗柱床2個柱體積以上，直到流入層析柱的緩衝液與流出層析柱的緩衝液電導值與PH相同，於此時紫外調零。3 上樣將實施例4製得的脫鹽樣品進行上樣。4 洗脫
上樣結束後，繼續用緩衝液A4平衡I個柱體積左右會有紫外吸收峰出現，收集出峰樣品，直至紫外出峰結束，基線回到上樣前的水平，然後用緩衝液比洗脫，收集紫外吸收峰樣品，直至出峰結束，基線回到上樣前的水平。純化樣品SDS-PAGE檢測結果參見圖7，HPLC檢測結果參見圖8。實施例7重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白的純度檢測(以IGH融合蛋白為例)一實驗材料TSKgel G2000SWXL液相層析柱購自TOSOH公司。二操作步驟I、蛋白電泳檢測上述實施例所得純化樣品經過非還原電泳SDS-PAGE (分離膠濃度為15%)、考馬斯亮蘭染色，對實施例5所得的樣品，除目的蛋白外，無明顯雜蛋白出現，結果參見圖9 JfIGH融合蛋白各步純化樣品經過非還原電泳SDS-PAGE (分離膠濃度為15%)硝酸銀染色發現，最終純化樣品除目的蛋白外無明顯雜蛋白出現，結果參見圖10。2、HPLC 檢測I)溶液配製流動相為50mM NaH2P04+0. 3%NaCl, pH6. 52)實驗方法 上述實施例所得純化樣品液相檢測方法為SEC-HPLC，樣品進樣量為50 μ 1，流速為O. 7ml/min,目的蛋白在9. 2min出峰。對實施例5所得樣品，參見圖6，結果判定目的蛋白峰面積大於98%,即純度大於98%。
權利要求
1.一種重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白的純化方法，該方法包括 (1)將能夠表達重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白的基因工程菌株進行發酵表達，獲得含有目的蛋白的發酵液，經預處理製得含目的蛋白的濃縮液，所述目的蛋白為HSA-IL-IRa, HSA- (G) n_IL_lRa、IL-IRa-HSA 或 IL-IRa- (G) n_HSA，其中(G) n 為肽接頭，G的序列為GlyGlyGlyGlySer, η為1-4的整數； (2)將上步所得的濃縮液進行強陰離子交換層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，所用層析介質含有季銨基或季銨乙基配基且所用介質的基質為瓊脂糖或葡聚糖； (3)將上步所得洗脫液進行藍膠親和層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，所用層析介質含有 Cibacron Blue 配基； (4)將上步所得洗脫液進行弱陰離子交換層析，獲得含目的蛋白的洗脫液，其中弱陰離子交換層析所用介質含有二乙基氨基乙基配基，所述介質的基質為瓊脂糖、葡聚糖或聚甲基丙烯酸甲酯；所用洗脫目的蛋白的緩衝液含有l(T50mM NaH2PO4和2(T35mM NaCl，pH為5.5 6. 5。
2.如權利要求I所述的純化方法，其特徵在於，所述重組人長效白介素I受體拮抗劑融合蛋白為IL-IRa-G-HSA融合蛋白，G的序列為GlyGlyGlyGlySer。
3.如權利要求I所述的純化方法，其特徵在於，步驟I發酵中，目的蛋白的表達形式 為分泌表達，所用表達載體為pPICZ a A、pPICZ α B、pPICZ a C、pPIC9或pPIC9K :當載體為pPICZ a A、pPICZ a B或pPICZ a C時，所用宿主細胞為巴斯德畢赤酵母X33 ；當載體為pPIC9或PPIC9K時，所用宿主細胞為巴斯德畢赤酵母GS115或巴斯德畢赤酵母SMD1168。
4.如權利要求1-3任一項所述的純化方法，其特徵在於，步驟4所用的弱陰離子交換層析介質選自 DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Sepharose F. F.、DEAE Sephadex A-50、DEAE-650M、DEAE-650C 和 Macro-Pr印 DEAE，優選 DEAE Sepharose CL-6B。
5.如權利要求4所述的純化方法，其特徵在於，步驟4中層析前預先將柱平衡，所用平衡緩衝液含有l(T50mM NaH2PO4和20mM NaCl，pH為5. 5 6. 5，優選平衡緩衝液含有20mMNaH2PO4和20mM NaCl，pH為5. 5或6. 5 ;所用洗脫目的蛋白的緩衝液為含有20mM NaH2PO4和35mM NaCUpH為5. 5的緩衝液，或為含有20mM NaH2PO4和20mM NaCUpH 6. 5的緩衝液。
6.如權利要求1-3任一項所述的純化方法，其特徵在於，步驟2所述的強陰離子交換層析介質為 Q Sepharose Fast Flow、QAE Sephadex A-50 或 QAE-550C,優選 Q SepharoseFast Flow。
7.如權利要求6所述的純化方法，其特徵在於，步驟2中層析前預先將柱平衡，所用平衡緩衝液A1含有10 50mM Tris和10 50mM NaCl，pH為6. 5 7. 5，優選平衡緩衝液A1含有20mM Tris和20mM恥(14!1為7.0;所用洗脫緩衝液81含有10 501111 Tris和100 200禮NaCl，pH 為 6. 5 7. 5，優選洗脫緩衝液 B1 含有 20mM Tris 和 160mM NaCl，pH 為 7. O。
8.如權利要求1-3任一項所述的純化方法，其特徵在於，步驟3所述的親和層析介質選自 AF-Blue HC_650M、Blue Sepharose 6 Fast Flow CL_6B、Capto Blue、Capto Blue(highsub)和 Affi-Gel Blue，優選 AF-Blue HC-650M。
9.如權利要求8所述的純化方法，其特徵在於，步驟3中層析前預先將柱平衡，所用平衡緩衝液A2含有l(T50mM的Tris和2(T200mM NaCl，pH為6. 5 7. 5，優選平衡緩衝液^含有20mM Tris和O. IM NaCl，pH為7. O ;所用洗脫緩衝液民含有10 50禮Tris和80(Tl300mMNaCl，pH 為 6. 5 7· 5，優選洗脫緩衝液 B2 含有 20mM Tris 和 IOOOmM NaCl，pH 為 7. O。
10.如權利要求1-3任一項所述的純化方法，其特徵在於，步驟4弱陰離子交換層析上樣前，預先調低樣品電導，所述調整方法包括稀釋、超濾置換或凝膠脫鹽，優選G25凝膠脫鹽。
11.如權利要求10所述的純化方法，其特徵在於，所述調整方法包括G25凝膠脫鹽法，所用的脫鹽介質選自 Sephadex G25 Fine, Sephadex G25 Medium, Sephadex G25 Coarse或Sephadex G25 superfine,優選Sephadex G25 Fine ;使用的脫鹽緩衝液含有5 IOmM的Tris, pH值為6. 5 7. 5，優選脫鹽緩衝液含有8mM Tris，pH為7. O。
12.如權利要求1-3任一項所述的純化方法，其特徵在於，所述預處理包括離心、超濾澄清與超濾濃縮。
全文摘要
本發明提供了一種重組人長效白介素1受體拮抗劑融合蛋白的純化方法，包括發酵表達獲得含有目的蛋白的發酵液、預處理、強陰離子交換層析、藍膠親和層析、弱陰離子交換層析。本發明得到較高純度的目的蛋白，有效解決了在大規模發酵生產中無法得到足夠純度的目的蛋白的難題。
文檔編號C07K1/36GK102952836SQ20121043364
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者徐巖, 李徵, 王海彬, 陳樞青, 沈其, 聶磊, 白驊 申請人:浙江海正藥業股份有限公司