一種人神經生長因子的重組變異體及其製備方法
2023-10-09 17:41:04
專利名稱：一種人神經生長因子的重組變異體及其製備方法
一種人神經生長因子的重組變異體及其製備方法人神經生長因子(hNGF)是人體中一種對神經修復機能有調節作用的生物活性因子，對促進神經系統的生長，損傷神經的再生具有決定性作用。目前hNGF作為藥品國內外均未上市，只有我國批准了鼠源NGF臨床應用，但鼠源NGF因種屬差異及病毒汙染的威脅而終將被重組產品替代。用基因工程生產重組人神經生長因子是唯一的途徑。rhNGF具有重要臨床價值，將填補國際神經修復藥物的空白。我國每年有上百萬神經損傷病人，市場前景可觀。我們發明了一種通過蛋白質工程改造獲得的hNGF重組變異體及其製備方法。天然活性的人神經生長因子末端為 Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Ile-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asn-Ser等。我們通過對其分子結構的深入研究,提出了 hNGF重組變異體的新結構，此重組變異體(rhNGF)的特徵在於重組表達的hNGF肽段從N端第一個胺基酸開始少了 S絲氨酸、S絲氨酸、S絲氨酸、H組氨酸、P脯氨酸、I異亮氨酸、F苯丙氨酸、H組氨酸、R精氨酸、G甘氨酸等10個胺基酸，多了 G甘氨酸、A丙氨酸二個胺基酸，並從E穀氨酸、F苯丙氨酸、S絲氨酸、V纈氨酸及往後胺基酸開始符合hNGF正常序列，從總體分子量上看少 了 8個胺基酸。我們通過上述對hNGF進行的蛋白質工程改造以期獲得藥效更好、更穩定的hNGF重組突變體(rhNGF)，其為具有新結構的生物分子，以利於新藥開發和臨床應用。實例說明I.目的基因的獲得為了獲得人NGF重組變異體的cDNA，我們採用全基因合成的方法獲得rhNGF的cDNA。全基因合成採用分段合成的方法進行。基因序列設計則根據我們的分子設計和參考文獻報導的hNGF的基因序列。我們設計的hNGF基因序列的5』端含有Kpnl酶切位點及編碼羥胺切割位點的序列，3』端含有Xbal酶切位點和終止密碼TGA。合成基因設計序列見圖I。圖I. rhNGF合成基因設計序列
5』AAC GGC GCA GAA TTC TCG GTG
TGT GAC AGT GTC AGC GTG TGG GTT GGGGAT AAG ACC ACC GCC ACA GAC ATC AAGGGC AAG GAG GTG ATG GTG TTG GGA GAGGTG AAC ATT AAC AAC AGT GTA TTC AAACAG TAC TTT TTT GAG ACC AAG TGC CGG
GAC CCA AAT CCC GTT GAC AGC GGG TGCCGG GGC ATT GAC TCA AAG CAC TGG AACTCA TAT TGT ACC ACG ACT CAC ACC TTTGTC AAG GCG CTG ACC ATG GAT GGC AAGCAG GCT GCC TGG CGG TTT ATC CGG ATAGAT ACG GCC TGT GTG TGT GTG CTC AGCAGG AAG GCT GTG AGA TGA TCT AGA2.基因序列測定將人工合成的rhNGF的cDNA，插入載體pThioHis A，用合成的測序引物進行正向測序(測序儀ABI PRISM) ο將測序圖譜用計算機讀序，得到cDNA序列並翻譯成對應胺基酸，結果我們設計的hNGF的cDNA和胺基酸序列一致。表明我們克隆得到的rhNGF的cDNA是正確的。
3.表達質粒的構建將rhNGF的cDNA插入pBV220中直接表達，表達產物形成不溶性的包含體，需要經過變性和復性得到有活性的rhNGF。因rhNGF含三對二硫鍵，復性很困難，導致產率很低。為了獲得rhNGF的高效可溶性表達,我們把rhNGF與大腸桿菌硫氧還蛋白thioredoxin進行融合表達，thioredoxin可以引導其後的蛋白正確摺疊，呈可溶性表達，具天然生物學活性，避免了變性復性的難題。切割方法用的是鹽酸羥胺切割法。鹽酸羥胺可以特異地切割蛋白中的Asn-Gly肽鍵，產生N端為Gly的多肽。我們發現rhNGF多肽中不含羥胺切割位點Asn-Gly，故我們選定輕胺切割位點Asn-Gly為連接點與thioredoxin融合表達rhNGF。表達的融合蛋白用輕胺切割後釋放出rhNGF，其起始胺基酸為Gly，此後的胺基酸序列與rhNGF序列一致。Gly與Met性質相似，放在N端均不影響蛋白的活性，況且hNGF的N端胺基酸對活性不重要，其N端8個胺基酸在人體內首先要被水解掉以實現功能。羥胺是人體內的正常代謝產物，鹽酸羥胺成本低，切割特異性好，切割效率高，適合工業化生產。我們選用質粒pThioHis A作為表達載體(Invitrogen公司產品)，它含有啟動子Ptrc promotor、thioredoxin前導肽及終止子aspA terminator,以及Amp抗性基因。我們將合成的rhNGF cDNA用Kpnl-Xbal雙酶切後的片段插入上述質粒的Kpnl-Xbal之間，構建成表達質粒pTHNGF。宿主菌選用大腸桿菌JM109 (購自Invitrogen公司)。大腸桿菌JM109的基因型為recAlsupE44 endAl hsdR17 gyrA96 relAl thi Δ (lac-proAB)F，[traD36proAB+lacIqlacZ Δ Μ15]。將質粒pTHNGF轉化入大腸桿菌JM109，即構成工程菌pTHNGF/JM109。將其保存於15%甘油中，冷凍於_70°C，即為原始種子庫。4. rhNGF工程菌的檢定4. I細菌形態、培養特徵、生理生化特性
從原始種子庫中取一支甘油保存的pTHNGF/JM109工程菌，接種在LBA培養基中，37°C搖蕩培養16小時，再以10%的比例接種到LBA培養基中(LB+0. lmg/ml Amp)，繼續培養3小時，以此為種子液進行以下各項檢查4. I. I細菌形態用種子液塗布玻片後，革蘭氏染色並鏡檢。工程菌為革蘭氏陰性，菌體為直杆狀，邊緣清晰，兩端鈍圓，大小基本一致，未見其它雜菌汙染。4. I. 2培養特徵用種子液劃線LBA平板，37°C培養20小時，肉眼可見菌落為圓形，邊緣光滑，菌落飽滿，表面溼潤、光滑，呈乳白色，基質未見色素產生。4. 1.3生理生化特性
能利用葡萄糖、乳糖、甘油作為碳源，不能利用果糖、肌醇。吲哚反應為陽性。V. P.反應呈陰性,不水解明膠。4. 2抗生素抗性特徵未轉化的宿主菌BL21在LB培養基上生長，在LBA培養基上不生長(Amp :0. Img/ml) ο轉化後的工程菌pTHNGF/JM109在LB培養基和LBA培養基上都生長良好。表明工程菌pTHNGF/JM109具有氨苄青黴素的抗性。4. 3質粒酶切圖譜分析從上述種子液中提取質粒pTHNGF，進行酶切鑑定。用KpnI-XbaI及KpnI-PstI均可切出370bp的小帶,用EcoRI-PstI可切出約340bp的小帶,酶切鑑定結果均符合質粒設計，說明質粒PTHNGF構建正確。4. 4工程菌的表達與表達產物的獲得將pTHNGF/JM109種子液以I %的比例接種於LBA培養基中，37°C生長至OD6tltl約為O. 5，加入IPTG至ImM作為誘導劑，37°C誘導5小時，收穫菌體，洗滌後取樣裂解，進行SDS-PAGE電泳分析。可見誘導後的菌體在26kD處比空白對照多出一條濃的蛋白帶，與要表達的rhNGF融合蛋白分子量26kD大小相等，經薄層掃描，該條帶佔菌體總蛋白的10-20 %左右。對表達的菌體進行超聲破菌，並高速離心。將沉澱和上清進行SDS-PAGE電泳。可見表達的rhNGF融合蛋白集中在上清中，即以可溶形式表達，具天然活性，不需要經過變性和復性。經過滲透壓釋放的方法，將大腸桿菌細胞內的可溶rhNGF融合蛋白大部分釋放到緩衝液中，羥胺切割後，經Ni螯合層析柱和CM-Sepharose層析柱純化，即得到純化的rhNGFο5.表達產物結構確證資料5. I特異性鑑別實驗純化的rhNGF產品做免疫印跡鑑定，結果與抗hNGF抗體呈陽性反應。表明本產品與抗hNGF抗體發生免疫反應。5. 2N末端胺基酸序列分析對純化的rhNGF進行N端胺基酸序列分析，測序結果表明N端15個胺基酸序列為Gly-Ala-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asp-Ser-Val-Ser-Val-Trp-Val-Gly即N端胺基酸序列與設計符合。6.活性測定採用雞胚背根神經節法測定，具體為以DMEM為母液，在含20%雞血漿和15%雞胚浸液的培養基中，利用伊莎褐雞胚腰椎背根神經節，在終濃度為30ng/ml的NGF的刺激下，培養36h。經檢測，純化的rhNGF其生物學活性與鼠源神經生長因子活性在一個數量級，達105u/mg 以上。通過以上步驟，我們對hNGF進行了蛋白質工程改造，以期獲得藥效更好、生物活 性更穩定的hNGF重組突變體(rhNGF)，以利於人神經生長因子的作用機制研究和臨床應用。
權利要求
1.本發明中的人神經生長因子重組變異體(rhNGF)特徵在於表達的NGF肽段N端少了 SSSHPIFHRG 10個胺基酸，多了 GA 二個胺基酸，分子量上看少了 8個胺基酸，從EFSV開始同於人神經生長因子正常序列。
2.本發明中人神經生長因子重組變異體(rhNGF)第I位胺基酸為甘氨酸。
3.本發明中人神經生長因子重組變異體(rhNGF)第2位胺基酸為丙氨酸。
4.本發明中切割rhNGF融合蛋白的Asn-Gly肽鍵用的是羥胺切割法。鹽酸羥胺可以特異地切割蛋白中的Ash-Gly肽鍵，產生N端為Gly的多肽。
5.本發明採用IPTG作為誘導劑誘導表達，採用超聲破菌和滲透法釋放大部分可溶rhNGF融合蛋白，用Ni螯合層析柱和CM-Sepharose層析柱純化rhNGF。
6.本發明獲得的人神經生長因子重組變異體具有藥用價值，可以開發出各種劑型的藥品。劑型指粉針、水針、噴霧、含片、膠囊、栓劑等藥物劑型。
全文摘要
本發明公開了一種人神經生長因子的重組變異體rhNGF及其製備方法。我們根據分子結構研究設計的人神經生長因子重組變異體(rhNGF)其肽段N端少了SSSHPIFHRG 10個胺基酸，多了GA二個胺基酸，此後從EFSV開始的序列同於人神經生長因子正常序列。採用全基因合成的方法獲得rhNGF的cDNA，構建工程菌進行表達，得到rhNGF融合蛋白，用羥胺切割後進行純化即得到純化的rhNGF，其具有天然生物活性。
文檔編號C12N15/70GK102911265SQ20111022353
公開日2013年2月6日 申請日期2011年8月5日 優先權日2011年8月5日
發明者王革 申請人:王革