一種用於生物靶細胞藥物敏感性試驗細胞的培養方法

2023-10-09 08:32:54 2

專利名稱：一種用於生物靶細胞藥物敏感性試驗細胞的培養方法
技術領域：
本發明屬於一種測定生物細胞反應性方法，具體涉及一種用於生物耙細胞藥物 敏感性i微細胞的培養方法。
背景技術：
由於先天和後天因素，不同患者的細胞對藥物的敏感性存在個體差異性，導致 不同藥物用於不同患者後，其患者反應性不同，包括對耙細胞的增值抑制作用，細 胞毒作用，細胞因子分泌作用等，檢測患者耙細IM不同藥物的敏感性，可以為患 者篩選出有效的治療藥物，可以增加治療療效和減少副作用，防止無效治療和對患 者身體和經濟的損失，實現個體化治療。可是目前市場上尚沒有專門用於生物耙細 胞藥物敏感性i，細胞的培養方法。

發明內容
本發明就是針對不同患者對藥物敏感性不同的特點，樹共一種用於生物耙細胞 藥物敏感性i^^細胞的培養方法，解決盲目治療療效差、副作用大，對患者身體和 經濟易造成不必要的損失的問題。
本發明通過以下技術方案實現
一種用於生物革卿胞藥物敏感性i微細胞的培養方法，由以下步^^M: (1) 外周血淋巴細胞製備，採取患者外周靜脈血3 5毫升，抗凝，用磷艦緩衝液等體積禾凝畢，將禾辦畢後的血液加在含有淋巴細胞分離液離心管內的淋巴細胞分離液表面，
2000轉/分，離心20射中，吸出淋巴細胞於另一離心管，加入5 10mL磷酸鹽緩衝 液混勻，1500轉/分，離心15^H中，棄上清液，.再加入5 10mL磷,緩衝液混勻， 計辦，1000轉/分，離心10倂中，棄上清液，細鵬細胞培養液禾凝畢成1X 10fi/ 毫升細胞懸液，備用，組織細胞製備將新鮮手術組織用常規組織細胞分離方法， 分離為單細胞懸液，用細胞培養液稀釋成1X IOV毫升細胞懸液，備用；(2)含各 種待測藥物i歸基製備將各種待測藥物用細胞培#^配製成2倍臨床常規!頓劑 量峰值濃度的藥液，備用；(3)細胞培養將含各種待測藥物培養液加入96孑L土咅 養板，每孔100微升，每個藥加2孔，設空白對照孔，不含ftf可藥物的細胞培養液， 將製備好的患者細胞懸液加入±3#咅養孔中，每孔100微升，震蕩混勻，置37'C， 5°/￡02環境中保溼±咅養3-7天；(4)細胞t斜己將培養後的細胞收集到^;細胞儀 樣品管中，每一種藥物分別收集到一管中，加入2mL磷麟緩衝液混勻，1000轉/ 分，離心10倂中，棄上清液，細胞沉澱中加入100uL磷酸鹽緩衝液，混勻，再加 入螢光^"i己的各種的單克隆抗體室溫下，18 22°C，避光放置20 30辦中，加入 2mL磷Kk緩衝液混勻，1000轉/分，離心10^H中，棄上清液，加入0.3 0.5毫 升磷麟緩衝液，混勻，待測。流式細胞儀測定按照箭式細胞儀常規操作，檢測 特定耙細胞的百分率，計算各種藥物對耙細胞的增殖或抑制或細胞毒作用，細胞因 子，細胞培養上清液檢測，流式細胞儀測定分泌細胞因子含量，選擇出對患者最 有效的藥物。其中，可檢測的生物耙細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細 胞，抑制性T細胞，NK細胞，Y ST細胞，T調節性細胞，ot PT細胞，腫瘤細胞，腫瘤幹細胞，IL-2， IL-4， IL~6, IL-10， INF- y ， TNF- a的細胞。
本發明與現有技斜目比具有以下有益效果不同患者細胞功能異常可能由不同 的細胞，細M群，亞亞群異常引起，M本發明可以精確為細胞功能異常的患者 選擇出最有效的治療藥物，顯著提高治療療效和M^無效治療，M^、患者身體的傷 害和經濟的損失，為國家和患者節約大量醫療成本。另外可以用於刑古^用藥方 案的效果，體外篩選新的藥物，研究藥物的作用機理，研究和制定新的治療方案， 研克新的藥物等。同時，由於藥物敏感性檢測在治療傳染病，自身免疫性鵬，腫 瘤等有較大的應用範圍，所以臨床應用可以產頓著的經濟^^。
具體實施例方式
一種用於生物革巴細胞藥物敏感性檢測的方法，由以下步^^且成(l)外周血淋 巴細胞製備，採取患者外周靜脈血4毫升，抗凝，用磷麟緩衝液靴積稀釋，將
稀釋後的血勵口在含有淋巴細胞分離液離心管內的淋巴細胞分離液表面，2000轉/ 分，離心20麼H中，吸出淋巴細胞於另一離心管，加入8niL磷麟緩衝液混勻，1500 轉/分，離心15併中，棄上清液，再加入8mL磷鵬緩衝液混勻，計辦，1000轉 /分，離心10倂中，棄上清液，細胞用細胞i咅養液禾凝華成lX10V新細脫懸液， 備用。組織細胞製備將茅賴羊手術組織用常規組織細胞分離方法，分離為單細胞懸 液，用細胞培養液禾糖成1X IOY毫升細胞懸液，備用；(2)含各種待測藥物培養
基製備將各種待測藥物用細胞培養液配製成2傲臨床常規^頓齊U量峰值濃度的藥
液，備用；(3)細胞培泰將含各種待測藥物培養液加入96孑L培鎌，每孔IOO 微升，^h藥加2 L設空白對照孔，不含招可藥物的細胞培養液，將製備好的患者細胞懸液加入上述培銜L中，每孔100微升，震蕩混勻，置37°C， 02環境中
保溼培養5天；(4)細胞新己將培養後的細胞收集到、 細胞儀樣品管中，每
一種藥物分別收集至'J一管中，加入2mL磷酸鹽緩衝液混勻，1000轉/分，離心10分 沐棄上清液，細胞沉澱中加入100 u L磷酸鹽緩衝液，混勻，再加入螢光^i己的各 種的單克隆抗體室溫下，20°C，避^^爐25^H中，加入2mL磷麟緩衝液混勻， 1000轉/分，離心10^H中，棄上清液，加入0.4毫升磷麟緩衝液，混勻，待測。 流式細胞儀測定按照》試細胞儀常規操作，檢測特定耙細胞的百分率，計算各種 藥物對耙細胞的增殖或抑制或細胞毒作用，細胞因子採用細胞培養上清液檢測，流 式細胞儀測定分泌細胞因:？ ，選擇出對患者最有效的藥物。其中，可檢測的生 物耙細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細胞，抑制性T細胞，NK細胞， Y ST細胞，T調節性細胞，a 細胞，腫瘤細胞，腫瘤幹細胞，分泌 IL-2, IL-4， IL-6， IL-IO， INF- Y ， TNF- a的細胞。
權利要求
1、一種用於生物靶細胞藥物敏感性試驗細胞的培養方法，其特徵是由以下步驟組成(1)外周血淋巴細胞製備，採取患者外周靜脈血3～5毫升，抗凝，用磷酸鹽緩衝液等體積稀釋，將稀釋後的血液加在含有淋巴細胞分離液離心管內的淋巴細胞分離液表面，2000轉/分，離心20分鐘，吸出淋巴細胞於另一離心管，加入5～10mL磷酸鹽緩衝液混勻，1500轉/分，離心15分鐘，棄上清液，再加入5～10mL磷酸鹽緩衝液混勻，計數後，1000轉/分，離心10分鐘，棄上清液，細胞用細胞培養液稀釋成1×106/毫升細胞懸液，備用；組織細胞製備將新鮮手術組織用常規組織細胞分離方法，分離為單細胞懸液，用細胞培養液稀釋成1×106/毫升細胞懸液，備用；(2)含各種待測藥物培養基製備將各種待測藥物用細胞培養液配製成2倍臨床常規使用劑量峰值濃度的藥液，備用；(3)細胞培養將含各種待測藥物培養液加入96孔培養板，每孔100微升，每個藥加2孔，設空白對照孔，不含任何藥物的細胞培養液，將製備好的患者細胞懸液加入上述培養孔中，每孔100微升，震蕩混勻，置37℃，5％CO2環境中保溼培養3-7天；(4)細胞標記將培養後的細胞收集到流式細胞儀樣品管中，每一種藥物分別收集到一管中，加入2mL磷酸鹽緩衝液混勻，1000轉/分，離心10分鐘，棄上清液，細胞沉澱中加入100μL磷酸鹽緩衝液，混勻，再加入螢光標記的各種的單克隆抗體室溫下，18～22℃，避光放置20～30分鐘，加入2mL磷酸鹽緩衝液混勻，1000轉/分，離心10分鐘，棄上清液，加入0.3～0.5毫升磷酸鹽緩衝液，混勻，待測；流式細胞儀測定按照流式細胞儀常規操作，檢測特定靶細胞的百分率，計算各種藥物對靶細胞的增殖或抑制或細胞毒作用，細胞因子採用細胞培養上清液檢測，流式細胞儀測定分泌細胞因子含量，選擇出對患者最有效的藥物；其中，可檢測的生物靶細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細胞，抑制性T細胞，NK細胞，γδT細胞，T調節性細胞，αβT細胞，腫瘤細胞，腫瘤幹細胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的細胞。
全文摘要
本發明公開了一種用於生物靶細胞藥物敏感性試驗細胞的培養方法，通過外周血淋巴細胞製備，組織細胞製備，細胞培養，細胞標記等步驟，將培養後的細胞收集到流式細胞儀樣品管中，通過流式細胞儀測定特定靶細胞的百分率，計算出各種藥物對靶細胞的作用，選擇出對患者最有效的藥物。可檢測的生物靶細胞包括總T細胞，總B細胞，輔助性T細胞，抑制性T細胞，NK細胞，γδT細胞，T調節性細胞，αβT細胞，腫瘤細胞，腫瘤幹細胞，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，INF-γ，TNF-α的細胞。通過本發明可以精確為細胞功能異常者選擇出最有效的治療藥物，顯著提高治療療效和減少無效治療，減少患者身體的傷害和經濟的損失，為國家和患者節約大量醫療成本。
文檔編號G01N21/64GK101407789SQ200810079830
公開日2009年4月15日 申請日期2008年11月14日 優先權日2008年11月14日
發明者(請求不公開姓名) 申請人:張 雯