攜帶於dna分子內的秘密信息的隱藏方法及其解密方法
2023-10-09 08:43:44 4
專利名稱：攜帶於dna分子內的秘密信息的隱藏方法及其解密方法
技術領域：
本發明揭露一種用以隱藏(conceal)一被攜帶於一DNA分子內的秘密信息(secret information)的方法以及一種用以將一通過該隱藏方法而將被隱藏的秘密信息予以解密(decode)的方法。特別地，該隱藏方法(concealing method)涉及到測序識別序列、正向引物識別序列以及反向引物識別序列的使用，而該解密方法(decoding method)涉及到分別對應於在用以隱藏該秘密信息的方法中所使用到的測序識別序列、正向引物識別序列以及反向引物識別序列的測序引物、正向引物以及反向引物的使用。
背景技術：
為了防止被竊取的目的，值得去傳輸或是隱藏僅可以通過特殊方法或是密碼鑰匙來予以解碼的信息。關於利用DNA來進行傳遞秘密信息的技術已有見於現有技術。例如，US6,312,911揭示的藏密方法涉及利用一選定的密碼錶來將一秘密信息編碼成為一推定的DNA序列，繼而合成出真正的DNA序列並將該DNA序列藏匿於選定的基因組DNA中。此外，該美國專利案所揭示的解碼方法涉及使用與攜帶有該秘密信息的DNA序列的側翼序列(flanking sequences)相關的PCR引物，以通過PCR來擴增出攜帶有該秘密信息的DNA片段，之後將所擴增出的DNA片段測序，以密碼錶來解讀該DNA片段被測序出來的核苷酸序列，如此即可以還原出原始的秘密信息。
但是，上述的藏匿秘密信息與解密的方式是相當簡易的，對於那些熟悉分子生物技術的人士而言，一旦得知可以被用來進行PCR的引物時，便能輕易地得到被隱藏的秘密信息。
因此，本技藝仍存在有一需要來發展能有效地藏匿被攜帶於DNA分子內的秘密信息的方法以及其對應的解密方法，來達到提高傳輸秘密信息時的安全性以及提高使用在商品防偽上的功能等等的目的。
發明內容
於是，在第一個方面，本發明提供一種用以隱藏一被攜帶於一DNA分子內的秘密信息的方法，其為先使秘密信息分散成為分開的部分之後再予以隱藏，而使得該秘密信息被破解的機率被充分地降低。
依據本發明，該用以隱藏一帶有一秘密信息的DNA分子的方法包含下列步驟(a)提供一攜帶有一秘密信息的DNA分子，該DNA分子是由數個核苷酸片段所構成，且每一個所述的核苷酸片段各自帶有該秘密信息的一個部分；(b)將該帶有秘密信息的DNA分子的所述的核苷酸片段予以分開，繼而於各個被分開的核苷酸片段的5』端或3』端處分別連接以一個測序識別序列，由此而形成一個個別的第一接合產物(first ligation product)；(c)對於每一個得自於步驟(b)的第一接合產物，在其5』端處連接以一個正向引物識別序列以及在其3』端處連接以一個反向引物識別序列，由此而形成一個個別的第二接合產物(second ligation product)；以及(d)將得自於步驟(c)的個別的第二接合產物置放於一指定的媒介物中，由此，該秘密信息的每一個部分都被隱藏。
在第二個方面，本發明提供一種用以將一被攜帶於一DNA分子內並通過上述藏密方法而被隱藏的秘密信息予以解密的方法，其包含下列步驟(a)從被懷疑帶有被隱藏的秘密信息的媒介物上分離出DNA物質；(b)通過使用數組各由一個正向引物以及一個反向引物所構成的PCR引物對作為第一解密鑰匙(decoding key)來擴增得自於步驟(a)的DNA物質，其中各組PCR引物對的正向引物的核苷酸序列是相同於在上述藏密方法的步驟(c)中為一個第一接合產物所用的一個正向引物識別序列的核苷酸序列，而各組PCR引物對的反向引物所具有的核苷酸序列是互補於在上述藏密方法的步驟(c)中為同一個第一接合產物所用的一個反向引物識別序列的核苷酸序列，由此而得到個別的PCR產物，其中各個PCR產物各自包含有從上述藏密方法的步驟(c)所得到的一個第二接合產物的核苷酸序列；(c)通過使用數個測序引物作為第二解密鑰匙來進行得自於步驟(b)的個別PCR產物的核苷酸測序，其中各個測序引物所具有的核苷酸序列是各自相同於在上述藏密方法的步驟(b)中為該DNA分子的一個核苷酸片段所用的一個測序識別序列所具者，由此而得到個別的測序產物，其中各個測序產物各自對應於從上述藏密方法的步驟(b)所得到的一個第一接合產物；(d)對於步驟(c)所得到的各個測序產物，將各個測序產物扣除掉所用的對應測序引物的部分以推算出位在該各個測序產物內的對應於在上述藏密方法的步驟(b)所使用的各個核苷酸片段的核苷酸序列；(e)利用一鹼基殘基順序解密機制(decoding mechanismfor the base residue order)來排列由步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列的順序，由此，一帶有秘密信息且通過上述藏密方法而被隱藏於一媒介物內的DNA分子的全長核苷酸序列被推算出；以及(f)依據一指定的核苷酸密碼編譯表來解讀從步驟(d)所推算出的DNA分子的全長核苷酸序列，由此，被隱藏於該DNA分子內的秘密信息被解讀出。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點在參照以下的詳細說明與優選實施例和隨文檢附的附圖後會變為明顯可知。
下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細說明，附圖中圖1示意說明如何利用本發明的藏密方法而將一帶有秘密信息的DNA分子隱藏於數個DNA載體內；圖2示意說明，如何利用本發明的藏密方法而將圖1中所示的該帶有秘密信息的DNA分子的一個核苷酸片段(agct)從其5』端至3端依序地連接以一正向引物識別序列1、一插入序列(…)、一測序識別序列1以及一反向引物識別序列1，繼而再被插入至一個可攜帶DNA片段的載體(以～～～來表示)內；圖3示意說明，如何利用本發明的藏密方法而將圖1中所示的該帶有秘密信息的DNA分子的一個核苷酸片段(agct)從其5』端至3端依序地連接以一正向引物識別序列1、一測序識別序列1、一插入序列(…)以及一反向引物識別序列1，繼而再被插入至一個可攜帶DNA片段的載體(以～～～來表示)內；圖4示意說明如何利用本發明的解密方法，使用3組PCR引物對作為第一解密鑰匙來對3個被懷疑帶有要被解密的核苷酸片段的載體進行擴增反應，而得到3個PCR產物；圖5示意說明如何利用本發明的解密方法，使用3個測序引物作為第二解密鑰匙來測序圖3中所得到的3個PCR產物，而得到3個測序產物；圖6示意說明如何利用本發明的解密方法，使用數個鹼基殘基順序碼作為第三解密鑰匙來與圖4中所得到的3個測序產物進行核苷酸序列的鹼基殘基順序比對，而推算出一具有對應於圖1中所示的該帶有秘密信息的DNA分子的全長核苷酸序列；以及圖7示意說明如何利用本發明的解密方法，使用一個鹼基殘基順序碼作為第三解密鑰匙以及一個鹼基殘基出現頻度碼作為第四解密鑰匙來與圖4中所得到的3個測序產物進行核苷酸序列的鹼基殘基順序比對，而推算出一具有對應於圖1中所示的該帶有秘密信息的DNA分子的全長核苷酸序列。
具體實施例方式
現有技術已有揭示，將被使用於PCR過程當中以便擴增出一所需的PCR產物的引物當作用以將一以DNA形式被隱藏的秘密信息予以解密的解密鑰匙，例如US6,312,911即是。但是，若以間接或直接方式而猜測出要被使用於DNA擴增過程當中的PCR引物時，有心的商品仿冒者或是意圖竊取防偽機密的人士便能容易地以現今已技術發展成熟的PCR技術去進行密碼破解，從所擴增出的DNA去解讀出被隱藏於內的秘密信息。針對此一問題，為了使經加密處理的秘密信息在傳遞或解密的期間當中能受到更安全的保障，申請人於本發明中發展出使用多重加密的技術來使要攜帶有要被隱藏的秘密信息的核苷酸序列能受到不同層面技術的多重保障，進而難以被商業間諜或是仿冒者所破解。
於是，申請人在本發明中提供一種用以隱藏一被攜帶於一DNA分子內的秘密信息的方法，其包含下列步驟(a)提供一攜帶有一秘密信息的DNA分子，該DNA分子是由數個核苷酸片段所構成，且每一個所述的核苷酸片段各自帶有該秘密信息的一個部分；(b)將該帶有秘密信息的DNA分子的所述的核苷酸片段予以分開，繼而於各個被分開的核苷酸片段的5』端或3』端處分別連接以一個測序識別序列，由此而形成一個個別的第一接合產物；(c)對於每一個得自於步驟(b)的第一接合產物，在其5』端處連接以一個正向引物識別序列以及在其3』端處連接以一個反向引物識別序列，由此而形成一個個別的第二接合產物；以及(d)將得自於步驟(c)的個別的第二接合產物置放於一指定的媒介物中，由此，該秘密信息的每一個部分都被隱藏。
在本發明的一個優選實施方案中，該攜帶有秘密信息的DNA分子可通過一包含下列步驟的方法而被獲得(i)依據一指定的核苷酸密碼編譯表將該秘密信息編碼成一核苷酸序列碼條；(ii)將得自於步驟(i)的核苷酸序列碼條分成數個部分，繼而通過人工合成方式來合成出各自對應於該核苷酸序列碼條的其中一個部分的核苷酸片段，由此一由數個核苷酸片段所構成的DNA分子被獲得。
用於合成DNA分子的核苷酸序列的技術是熟習此項技術人士所詳知的。因此，當所欲隱藏的秘密信息被編碼成一核苷酸序列碼條以後，熟習此項技術人士就可依據所要的需求，將該核苷酸序列碼條區分為數個部分，然後通過人工合成方式來合成出各自對應於各個部分的核苷酸片段。
在本發明的另一個優選實施方案中，該攜帶有秘密信息的DNA分子是通過一包含下列步驟的方法而被獲得(i』)依據一指定的核苷酸密碼編譯表將該秘密信息編碼成一核苷酸序列碼條；(ii』)通過人工合成方式來合成出一所具核苷酸序列是對應於步驟(i』)所編碼出的該核苷酸序列碼條的核苷酸序列的DNA分子。
當全長的DNA分子被合成出，熟習此項技術人士可以通過本技藝所詳知且慣用的限制酶處理技術將該全長的DNA分子區分成數個核苷酸片段，來供本發明的藏密方法的後續步驟使用。
由於構成DNA分子的核苷酸殘基主要包含腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)、鳥嘌伶(g)這四種鹼基，熟習此項技術人士可以就這四種鹼基的不同排列順序來事先定義各個鹼基排列順序所代表的意義，以便用於將一段有意義的文字或信息編碼成為一核苷酸序列碼條。在本發明中，被一製造者所預先設計或是預先定義的一個秘密信息可以根據一選定的核苷酸密碼編譯表來編碼出一核苷酸序列碼條。核苷酸密碼編譯表可以由熟習此項技術人士自行設計，或是採用以往的摩斯密碼錶或是US6,312,911中所提到的密碼錶等等。
以下將參照圖1至圖3來說明如何進行本發明的藏密方法，並對當中所提到一些術語作一定義。
在本發明所稱的「測序識別序列」是指一個DNA片段，其所具核苷酸序列相同於一個將被使用於DNA的測序反應中的測序引物所具的序列。
在本發明所稱的「第一接合產物」，是指一個通過將一測序識別序列連接至一帶有秘密信息的一個部分的核苷酸片段的5』端或是3』而形成的產物。
在本發明所稱的「第二接合產物」，是指一個通過將一個正向引物識別序列以及一個反向引物識別序列分別連接至已建構出的第一接合產物的5』端處以及3』端處而形成的產物。
在本發明所稱的「正向引物識別序列」，是指一個DNA片段，其所具核苷酸序列是相同於要通過PCR技術來擴增一目的DNA分子時所用的一個正向引物的核苷酸序列。
在本發明所稱的「反向引物識別序列」，是指一個DNA片段，其所具核苷酸序列是互補於要通過PCR技術來擴增一目的DNA分子時所用的一個反向引物的核苷酸序列。
在本發明所稱的「插入序列(…)」，是指一個不帶有任何意義的核苷酸序列，其是用以混淆帶有秘密信息的核苷酸片段、正向引物識別序列、測序識別序列、反向引物識別序列等的所在位置來增加序列解密的複雜度。
現在參見圖1所示，其示意說明如何利用本發明的藏密方法而將一帶有秘密信息的DNA分子隱藏於數個載體內。現在假設有一製造者想要將「MADE IN BWL」這個秘密信息隱藏於自己所生產的某項產品來防止該產品被仿冒。於是，該製造者可利用一選定的核苷酸密碼編譯表來將「MADE IN BWL」這個秘密信息編碼出一核苷酸序列碼條。為方便說明，現在假設「MADE IN BWL」經選定的核苷酸密碼編譯表所編碼出的核苷酸序列碼條即是「agcttgcgctccgatgca」(SEQ ID No.1)。
於是，熟習此項技術人士即可根據上述核苷酸序列碼條所示來合成出一個真正的全長DNA序列，繼而將該全長DNA序列切成數個核苷酸片段；或者，熟習此項技術人士可將該核苷酸序列碼條區分成為數個部分，然後各別地合成出對應於各個部分的核苷酸片段。
為方便說明，上面所列舉的核苷酸序列碼條含有18個核苷酸殘基，但熟習此項技術人士可以理解到的是，本發明在實際使用上並不受此所限制。事實上，攜帶有該秘密信息的DNA分子可以包含有多個各自帶有4～10000個核苷酸殘基(優選為10～5000個核苷酸殘基，更優選為20～500個核苷酸殘基，又更優選為50～150個核苷酸殘基)的核苷酸片段。
有關DNA序列或核苷酸片段的人工合成方式包括使用DNA合成儀以及重組DNA技術。
就上述所例示的核苷酸序列碼條「agcttgcgctccgatgca」(SEQID No.1)，現在將其區分為三個部分，亦即核苷酸片段1「agct」(SEQ ID No.2)、核苷酸片段2「tgcgct」(SEQ ID No.3)以及核苷酸片段3「ccgatgca」(SEQ ID No.4)，並以DNA合成儀合成出這三個核苷酸片段。這些核苷酸片段接著可參照圖2或圖3所示來繼續進行本發明的藏密方法。
以第2圖為例，首先於核苷酸片段1「agct」(SEQ ID No.2)的5』端處連接上一個測序識別序列，由此而形成一個第一接合產物。或者，也可如第3圖所示，在核苷酸片段1「agct」(SEQ ID No.2)的3』端處連接上一個測序識別序列，由此而形成一個第一接合產物。
依據本發明，可被用於連接至各個核苷酸片段的5』端或3端處的測序識別序列可以是彼此相同或不同的，而且該測序識別序列含有4～100個核苷酸殘基，優選為10～50個核苷酸殘基，更優選為18～30個核苷酸殘基。為方便說明的故，於此皆使用一具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列「atcaatactt ataatttggtt」來作為該測序識別序列。
接著，可在每一個第一接合產物的5』端處連接以一個正向引物識別序列以及在其3』端處連接以一個反向引物識別序列，由此而形成一個個別的第二接合產物。
為方便說明，在此皆使用一具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列「gcgcgctaataactacacattta」來作為該正向引物識別序列，以及一具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列「cccgggctcttatatatttcaattt」來作為該反向引物識別序列。
依據本發明，該正向引物識別序列與該反向引物識別序列可各自含有4～100個核苷酸殘基，優選為10～50個核苷酸殘基，更優選為18～30個核苷酸殘基。
如想增加該秘密信息被破解的困難度，此時可以在該第一接合產物的5』端處(圖2)或者3』端處(圖3)連接上一個插入序列(…)，該插入序列的核苷酸序列不同於該帶有一部分的秘密信息的核苷酸片段所具者。該插入序列可含有4～1000個核苷酸殘基，優選為10～500個核苷酸殘基，更優選為50～200個核苷酸殘基。
然後，如圖2所示，於已接上有該插入序列的該第一接合產物的5』端處連接以一個正向引物識別序列，並於3』端處連接以一個反向引物識別序列。
或者，可如圖3所示，在該第一接合產物的3』端處連接上一個插入序列(…)，然後，於已接上有該插入序列的該第一接合產物的5』端處連接以一個正向引物識別序列，並於3』端處連接以一個反向引物識別序列。
當完成該正向引物識別序列與該反向引物識別序列的連接後，所形成的產物可以通過本技藝所慣用的PCR技術來擴增至所需的數量之後再置放至於一指定的媒介物中，於是該秘密信息的每一個部分即被隱藏。
或者，當完成該正向引物識別序列與該反向引物識別序列的連接以後，所形成的個別產物可以通過本技藝所慣用的PCR技術來擴增至所需的數量，繼而通過本技藝所慣用的基因工程技術將所得到的擴增產物插入至一可攜帶DNA片段的載體(參見圖2與圖3中以～～～表示的部分)內。這些以往的基因工程技術包括限制酶的選用、以限制酶來剪切DNA攜帶載體、粘合端(cohesiveend)的處理等等，是廣為熟習此項技術人士所知曉並被運用於他們的例行操作技術中。
依據本發明，要被用來攜帶所得到的第二接合產物的DNA攜帶載體彼此可以是相同的或是不同的。此外，若該攜帶載體夠大，亦可將所得到的所述的第二接合產物置放於同一載體的不同插入位置處。
圖1顯示要將上述所提到的三個各自帶有該秘密信息的一個部分的核苷酸片段分別置放至載體1、載體2與載體3內。
如想增加該秘密信息被破解的困難度，可令所述的個別的第二接合產物或是攜帶有個別的第二接合產物的載體來與確認不會干擾到秘密信息的日後解密工作的基因組DNA或隨機合成的大量DNA相混合，繼而將形成的混合物置放於一指定的媒介物中。
相較於US6,312,911(該案為了降低秘密信息被破解的機率而使用含有高達3×109個鹼基對的人類基因組DNA來藏匿該秘密信息)，本發明所提供的方法因為可以將秘密信息分散，而能使用鹼基對數目較低或是具有不同長度的寡核苷酸的DNA來藏匿帶有秘密信息的核苷酸分子，同時又能維持這些帶有秘密信息的各個核苷酸分子被隱藏時的高隱密性。
另一方面，因為使用上述「測序識別序列」、「正向引物識別序列」、「反向引物識別序列」以及「插入序列(…)」，本發明更具有以下優點。
要供連接至帶有秘密信息的一個部分的每一個核苷酸片段的測序識別序列各自可以是相同的或是不同的，而正向引物識別序列與反向引物識別序列也是一樣，如此，在無法了解全部的測序識別序列、正向引物識別序列與反向引物識別序列的情況下，將會使得依據發明的藏密方法而被隱藏的秘密信息更難被破解。
另外，該插入序列與DNA攜帶載體的使用可進一步提高依據發明的藏密方法而被隱藏的秘密信息的隱密性。特別地，該插入序列可提供混淆作用，而使得與測序識別序列相連接的秘密信息更不易被識破。
依據本發明，要用來藏匿秘密信息的媒介物可選自於由下列所構成的群組紙、玻璃、塑料、硝基纖維素層、聚碳酸酯層、尼龍層以及織物。而且所述的個別的第二接合產物或是攜帶有個別的第二接合產物的載體可被藏匿於相同或不同的媒介物內。在一優選實施方案中，該秘密信息被藏匿於一塑料薄膜上。
如此所製成的所述的媒介物即可被用來標記一所欲鑑定物品或是任何需要鑑定的物品，以作為防止仿冒或是偽造鑑定的用。或者所述的媒介物即可被用來傳輸秘密信息。
本發明應用的方向眾多，例如可以將攜帶有秘密信息的DNA分子混合以諸如顏料、膠水、塑脂、油墨等特定材料而做為一種DNA隱性防偽油墨。而因為不同商業化產品的需求，本發明的藏密方法也可因應印鈔技術的底紋、螢光印刷、微細字等多元化選擇而被應用於要隱藏秘密信息的在卷標印刷上。
另外，依據本發明而被隱藏起來的秘密信息也具有使用時用量節省，成本低廉且可與許多印刷技術做整合的優點。例如，可被大量使用於一般公司企業的重要或是機密文件；金融產業的存摺或是諸如股票、支票以及鈔票的有價證券；百貨公司或俱樂部的會員卡或折價券、繪畫或雕塑或其它手制物品的藝術品以及諸如其它彩券、郵票、海關貼條、貴賓券、紡織品、纖維以及染料等應用上。
DNA本身是無毒性的，在經過預先設計之後，本身就是一種獨特的DNA標記，所以依據本發明的藏密方法而被隱藏的秘密信息甚至可被放入至可食性材料內或是被應用於醫藥產業上，例如健康食品、製藥產業中所使用的錠劑(例如膠囊、膜衣錠、糖衣錠)、藥片表面印製；或是被隱藏在食品包裝物上，例如鋁箔包的內部包裝、包裝盒或包裝瓶的外部包裝上。
當然，依據本發明的藏密方法而被隱藏的秘密信息也可直接標記於一活體或是有機體，例如重要的植株、疫苗、動物等等具有有高經濟價值的相關生技產物。
另外，本發明也預期到對一所欲鑑定的目的物體內去判斷是否為一仿冒品的應用而提供一種自一待鑑定的目的物體內檢測或是解密一秘密信息的方法，其中該秘密信息是一製造者或是企業者所事先設計，且如本發明的前述說明所示，是以數個核苷酸片段而被預先地隱藏於該目的物之內。於是本發明能通過檢測一目的物中是不是有該秘密信息的存在而被應用於判斷該目的物是否為特定製造者或使用者所擁有或是為遭受偷取的贓物。
而欲查證一待鑑定的目的物體內是否藏匿有一依據本發明藏密方法而被隱藏的秘密信息，本發明亦提供一種用以將一被攜帶於一DNA分子內並通過上述藏密法而被隱藏的秘密信息予以解密的方法，其包含下列步驟(a)從被懷疑帶有被隱藏的秘密信息的媒介物上分離出DNA物質；(b)通過使用數組各由一個正向引物以及一個反向引物所構成的PCR引物對作為第一解密鑰匙來擴增得自於步驟(a)的DNA物質，其中各組PCR引物對的正向引物的核苷酸序列相同於在上述藏密方法的步驟(c)中為一個第一接合產物所用的一個正向引物識別序列的核苷酸序列，而各組PCR引物對的反向引物所具核苷酸序列是互補於在上述藏密方法的步驟(c)中為同一個第一接合產物所用的一個反向引物識別序列的核苷酸序列，由此而得到個別的PCR產物，其中各個PCR產物各自包含有從上述藏密方法的步驟(c)所得到的一個第二接合產物的核苷酸序列；(c)通過使用數個測序引物作為第二解密鑰匙來進行得自於步驟(b)的個別PCR產物的核苷酸測序，其中各個測序引物所具有的核苷酸序列是各自相同於在上述藏密方法的步驟(b)中為該DNA分子的一個核苷酸片段所用的一個測序識別序列所具者，由此而得到個別的測序產物，其中各個測序產物各自對應於從上述藏密方法的步驟(b)所得到的一個第一接合產物；(d)對於步驟(c)所得到的各個測序產物，將各個測序產物扣除掉所用的對應測序引物的部分以推算出位在該各個測序產物內的對應於在上述藏密方法的步驟(b)所使用的各個核苷酸片段的核苷酸序列；(e)利用一鹼基殘基順序解密機制來排列由步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列的順序，由此，一帶有秘密信息且通過上述藏密方法而被隱藏於一媒介物內的DNA分子的全長核苷酸序列被推算出；以及(f)依據一指定的核苷酸密碼編譯表來解讀從步驟(d)所推算出的DNA分子的全長核苷酸序列，由此，被隱藏於該DNA分子內的秘密信息被解讀出。
以下將參照圖4至圖7來說明如何進行本發明的解密方法。
如圖4所示，首先，對懷疑帶有依據上述藏密方法(圖1至圖3)而被隱藏的秘密信息的媒介物進行分離DNA物質的處理，之後再以選定的PCR引物來對所分離出的DNA物質進行PCR反應。
依據本發明，在該PCR反應中所用的PCR引物是經選定來作為第一解密鑰匙，因此，各組PCR引物對當中的個別正向引物與反向引物是依據當初藏密方法當中所用的正向引物識別序列以及反向引物識別序列而被提供。於是，依照前面所用到的正向引物識別序列「gcgcgctaataactacacattta」(SEQ ID No.6)以及反向引物識別序列序列「cccgggctcttatatatttcaattt」(SEQ ID No.7)，在此提供具有核苷酸序列相同於該正向引物識別序列的正向引物以及具有核苷酸序列互補於該反向引物識別序列的反向引物。當然地，該正向引物與該反向引物會因應所用的正向引物識別序列與反向引物識別序列而做出變化。
若所檢測的DNA物質裡面確實帶有依據前述藏密方法而被隱藏的秘密信息，即可由所使用的PCR引物來擴增出圖4所示的PCR產物，而各個PCR產物各自包含有從前述藏密方法的步驟(c)所得到的一個第二接合產物的核苷酸序列。例如，圖4所示，因為前述藏密方法涉及3個核苷酸片段，經過PCR擴增後生成3個PCR產物。
一旦上述的PCR反應有生成PCR產物，即可進行下一步的測序反應，其中使用數個測序引物來作為第二解密鑰匙，而且所用的測序引物是根據前述藏密方法的步驟(b)中為該DNA分子的一個核苷酸片段所用的一個測序識別序列來予以選定。有關測序反應的進行，可以使用傳統的DNA測序儀或派羅序列分析法(pyrosequence analysis)。
於是，如圖5中所示，依照前面所用到的測序識別序列「atcaatacttataatttggtt」(SEQ ID No.5)，在此提供具有核苷酸序列相同於該測序識別序列的測序引物。
可了解到的是，當進行核苷酸測序反應時，所得到的測序產物不僅包括測序識別序列部分與帶有秘密信息的一部份的核苷酸片段，還可能會讀到屬於正向引物識別序列或是反向引物識別序列的部分，而這是可以予以控制的。一來，因為本發明所用的正向引物與反向引物是分別對應於藏密方法中所用的正向引物識別序列或是反向引物識別序列，所以被測序出的序列即可扣除掉屬於這兩個部分的序列。另外，也可以使核苷酸測序反應被控制在進行至讀出「秘密信息」的核苷酸序列後就停止，即不會讀出其它不相干的鹼基殘基。
於是，對於所得到的各個測序產物，將各個測序產物扣除掉所用的對應測序引物的部分，即可推算出位在該各個測序產物內的對應於在前述藏密方法的步驟(b)所使用的各個核苷酸片段的核苷酸序列。
為確認上述所得到的測序產物內的被推算出是帶有秘密信息的核苷酸序列的順序，以推算出被隱藏於媒介物內的DNA分子的全長核苷酸序列，可利用一鹼基殘基順序解密機制來進行序列的排列推算。
在本發明的一優選實施方案中，該鹼基殘基順序解密機制可以包括作為第三解密鑰匙的數個鹼基殘基順序碼(base residuesequence order codes)，其中所述的鹼基殘基順序碼是根據所提供的該DNA分子的數個核苷酸片段的順序來設計，由此，所述的鹼基殘基順序碼的數目比該DNA分子的核苷酸片段的數目少一個，而且每個鹼基殘基順序碼具有一段序列，依照該DNA分子的數個核苷酸片段的順序，是契合於(match with)該DNA分子的數個核苷酸片段當中前一者的3』端部分的鹼基殘基序列連接以該DNA分子的數個核苷酸片段當中後一者的5』端部分的鹼基殘基序列。
圖6例示說明使用兩個鹼基殘基順序碼「cctgc」(SEQ ID No.8)與「gctccg」(SEQ ID No.9)來作為第三解密鑰匙的核苷酸片段排序方式。
在本發明的另一個優選實施方案中，該鹼基殘基順序解密機制可以包括(i)一作為第三解密鑰匙的鹼基殘基順序碼(baseresidue sequence order code)來供給步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列進行比對，其中該鹼基殘基順序碼是根據上述藏密方法的步驟(a)中所提供的DNA分子的鹼基殘基順序來予以設計，但省略掉該DNA分子上被重複的鹼基殘基，由此，從步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列的順序可被至少部分地確定；以及(ii)一作為第四解密鑰匙的鹼基殘基出現頻度碼(base residue occurrence frequency code)來供給步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列進行鹼基殘基出現頻度的比對，其中該鹼基殘基出現頻度碼是根據上述藏密方法的步驟(a)中所提供的DNA分子的鹼基殘基出現頻度來予以設計，由此，在與(i)中的鹼基殘基順序碼合用下，該帶有秘密信息且通過上述藏密方法而被隱藏於媒介物內的DNA分子的全長核苷酸序列被推算出。
圖7例示說明使用上述一個鹼基殘基順序碼「agctgcgctcgatgca」(SEQ ID No.10)來作為第三解密鑰匙以及一個鹼基殘基出現頻度碼「1112111112111111」來作為第四解密鑰匙的核苷酸片段排序方式。
於是，當推算出的DNA分子的全長核苷酸序列之後，即可依據一指定的核苷酸密碼編譯表來解讀出被隱藏於該DNA分子內的秘密信息。
對於上述第二種較佳實施例中所使用的第三解密鑰匙以及第四解密鑰匙，在本發明中可以利用揭示於US6,210,891所示的核苷酸測序技術來得到攜帶有該秘密信息的數個核苷酸片段。
以現今技術而言，熟習此項技術人士有可能會利用隨機引物來去除噪聲，之後進一步使用減數聚合酶鏈反應(subtracting PCR)技術，而由此提高帶有秘密信息的核苷酸序列被找出的機率。再者，自2002年後，許多物種的基因序列被一一測序，而現今計算機分析資料的功能強大，一經基因庫的核苷酸序列比對後，即可能致使人類基因體DNA序列中帶有秘密信息的一特定核苷酸序列的全部序列被破解，而暴露出那些提高帶有秘密信息的核苷酸序列。
而如上述，可使人了解的是，為了進一步降低秘密信息被破解的機率，在本發明中的測序識別序列與正向引物識別序列或反向引物識別序列是事先經過設計，因此，在不知它們的序列時，是無法進行聚合酶鏈反應以及測序反應的。因此，縱使有心人士大費周章地利用隨機引物而自基因組DNA與隨機合成的DNA中獲得許多核苷酸片段，在不知測序引物序列為何的情況下，該有心人士仍然無法了解被藏匿的DNA分子的核苷酸片段才是真正的秘密信息所在。另外，縱使有一個測序引物識別序列所對應的測序引物被找出，因為秘密信息被藏匿於不同的核苷酸片段中，有心解密的人士也僅能解讀出該秘密信息的一個部分，而無法窺知完整的秘密信息。
另外，欲說明的是，依據本發明的藏密方法與解密方法可被應應於企業體的供應鏈管理之中，來對商品的製造、物流與檢測做不同程度的管理。例如，可以由總公司制定一段秘密信息而放入商品中一起被製造，當有需要檢測有問題的商品時，可以將第一解密鑰匙交由一檢測單位來執行，以進行初步檢驗，並通過有無PCR產物的出現，先做初步判斷以快速達到時效管制。進一步地，若需要確認秘密信息的核苷酸序列，僅需再提供第二解密鑰匙便能得到帶有該秘密信息的許多核苷酸片段。接著，可能握有第三解密鑰匙(或者還有第四解密鑰匙)的通貨商，即可比對序列次序有無錯誤。所以便能建立起商品的多重追蹤選擇，來進行供應鏈管理。
於本說明書中被引述的所有專利與文獻以其整體被併入本發明以作為參考資料。若有所衝突時，本發明的說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參照上述特定具體例來作描述，明顯地在不背離本發明的範圍和精神的下，可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明只受如隨文檢附的申請專利範圍所示者的限制。
序列表110博微生物科技公司120攜帶於DNA分子內的秘密信息的隱藏方法及其解密方法130NP-17231-TWN1607170WinWord2000210121118212DNA213人工序列4001agcttgcgct ccgatgca1821022114212DNA213人工序列4002agct 42103
2116212DNA213人工序列4003tgcgct 621042118212DNA213人工序列4001ccgatgca 8210521120212DNA213人工序列220測序引物223用於秘密信息的測序4005atcaatactt ataatttggtt 20
210621123212DNA213人工序列220正向引物223用於秘密信息的擴增4006gcgcgctaat aactacacat tta23210721125212DNA213人工序列220反向引物223用於秘密信息的擴增4007cccgggctct tatatatttc aattt 2521082115212DNA213人工序列220
223用於秘密信息的排序4008cctgc5
21092116212DNA213人工序列220
223用於秘密信息的排序4009gctccg 62101021116212DNA213人工序列220
223用於秘密信息的排序40010agctgcgctc gatgca 1權利要求
1.一種用以隱藏一被攜帶於一DNA分子內的秘密信息的方法，其特徵在於該方法包含下列步驟(a)提供一攜帶有一秘密信息的DNA分子，該DNA分子是由數個核苷酸片段所構成，且每一個所述的核苷酸片段各自帶有該秘密信息的一個部分；(b)將該帶有秘密信息的DNA分子的所述的核苷酸片段予以分開，繼而於各個被分開的核苷酸片段的5』端或3』端處分別連接以一個測序識別序列，由此而形成一個個別的第一接合產物；(c)對於每一個得自於步驟(b)的第一接合產物，在其5』端處連接以一個正向引物識別序列以及在其3』端處連接以一個反向引物識別序列，由此而形成一個個別的第二接合產物；以及(d)將得自於步驟(c)的個別的第二接合產物置放於一指定的媒介物中，由此，該秘密信息的每一個部分都被隱藏。
2.如權利要求1的方法，其特徵在於其中於步驟(a)中所提供的該攜帶有秘密信息的DNA分子是通過一包含下列步驟的方法而被獲得(i)依據一指定的核苷酸密碼編譯表將該秘密信息編碼成一核苷酸序列碼條；(iii)將得自於步驟(i)的核苷酸序列碼條分成數個部分，繼而通過人工合成方式來合成出各自對應於該核苷酸序列碼條的其中一個部分的核苷酸片段，由此，一由數個核苷酸片段所構成的DNA分子被獲得。
3.如權利要求1的方法，其特徵在於其中於步驟(a)中所提供的該攜帶有秘密信息的DNA分子是通過一包含下列步驟的方法而被獲得(i』)依據一指定的核苷酸密碼編譯表將該秘密信息編碼成一核苷酸序列碼條；(ii』)通過人工合成方式來合成出一所具核苷酸序列是對應於步驟(i』)所編碼出的該核苷酸序列碼條的核苷酸序列之DNA分子。
4.如權利要求3的方法，其特徵在於其中於步驟(b)中，該DNA分子通過限制酶處理而被區分成數個核苷酸片段。
5.如權利要求1的方法，其特徵在於其中於步驟(b)中，各個核苷酸片段的5』端處被連接以一個測序識別序列。
6.如權利要求5的方法，其特徵在於其中被連接於各個核苷酸片段的5』端處的測序識別序列是彼此相同或不同的。
7.如權利要求5的方法，其特徵在於其中於步驟(c)中，得自於步驟(b)的第一接合產物於其5』端處先被連接以一個插入序列，繼而被連接以一個正向引物識別序列，該插入序列的核苷酸序列不同於該帶有一部分的秘密信息的核苷酸片段所具者。
8.如權利要求1的方法，其特徵在於其中於步驟(b)中，各個核苷酸片段的3』端處被連接以一個測序識別序列。
9.如權利要求8的方法，其特徵在於其中被連接於各個核苷酸片段的3』處的測序識別序列是彼此相同或不同的。
10.如權利要求9的方法，其特徵在於其中於步驟(c)中，得自於步驟(b)的第一接合產物於其3』端處先被連接以一個插入序列，繼而被連接以一個反向引物識別序列，該插入序列的核苷酸序列不同於該帶有一部分的秘密信息的核苷酸片段所具者。
11.如權利要求1的方法，其特徵在於其中於步驟(d)中，被用來置放個別的第二接合產物的媒介物是選自於由下列所構成的群組紙、玻璃、塑料、硝基纖維素層、聚碳酸酯層、尼龍層以及織物。
12.如權利要求1的方法，其特徵在於其中於步驟(d)中，所述的個別的第二接合產物被置放在相同的媒介物內。
13.如權利要求1的方法，其特徵在於其中於步驟(d)中，得自於步驟(c)的個別的第二接合產物先被插入至一可攜帶DNA片段的載體內，而後被置放於一指定的媒介物中。
14.如權利要求13的方法，其特徵在於其中被用來供個別的第二接合產物插入用的載體是為彼此相同或不同的。
15.如權利要求13的方法，其特徵在於其中於步驟(d)中，被用來置放個別的第二接合產物的媒介物是選自於由下列所構成的群組紙、玻璃、塑料、硝基纖維素層、聚碳酸酯層、尼龍層以及織物。
16.一種用以將一被攜帶於一DNA分子內並通過權利要求1的方法而將被隱藏的秘密信息予以解密的方法，其特徵在於該解密方法包含下列步驟(a)從被懷疑帶有被隱藏的秘密信息的媒介物上分離出DNA物質；(b)通過使用數組各由一個正向引物以及一個反向引物所構成的PCR引物對作為第一解密鑰匙來擴增得自於步驟(a)的DNA物質，其中各組PCR引物對的正向引物的核苷酸序列是相同於在權利要求1的方法的步驟(c)中為一個第一接合產物所用的一個正向引物識別序列的核苷酸序列，而各組PCR引物對的反向引物所具有的核苷酸序列是互補於在權利要求1的方法的步驟(c)中的同一個第一接合產物所用的一個反向引物識別序列的核苷酸序列，由此而得到個別的PCR產物，其中各個PCR產物各自包含有從權利要求1的方法的步驟(c)所得到的一個第二接合產物的核苷酸序列；(c)通過使用數個測序引物作為第二解密鑰匙來進行得自於步驟(b)的個別PCR產物的核苷酸測序，其中各個測序引物所具有的核苷酸序列是各自相同於在申請專利範圍第1項的方法的步驟(b)中為該DNA分子的一個核苷酸片段所用的一個測序識別序列所具者，由此而得到個別的測序產物，其中各個測序產物各自對應於從權利要求1的方法的步驟(b)所得到的一個第一接合產物；(d)對於步驟(c)所得到的各個測序產物，將各個測序產物扣除掉所用的對應測序引物的部分以推算出位在該各個測序產物內的對應在權利要求1的方法的步驟(b)所使用的各個核苷酸片段的核苷酸序列；(e)利用一鹼基殘基順序解密機制來排列由步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列的順序，由此，一帶有秘密信息且通過權利要求1的方法而被隱藏於一媒介物內的DNA分子的全長核苷酸序列被推算出；以及(f)依據一指定的核苷酸密碼編譯表來解讀從步驟(d)所推算出的DNA分子的全長核苷酸序列，由此，被隱藏於該DNA分子內的秘密信息被解讀出。
17.如權利要求16的方法，其特徵在於其中被使用於步驟(e)中的鹼基殘基順序解密機制包括作為第三解密鑰匙的數個鹼基殘基順序碼來供與步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列進行排序比對，其中所述的鹼基殘基順序碼是根據權利要求1的方法的步驟(a)中所提供的該DNA分子的數個核苷酸片段的順序來設計，由此，所述的鹼基殘基順序碼的數目比該DNA分子的核苷酸片段的數目少一個，而且每個鹼基殘基順序碼具有一段序列，是依照該DNA分子的數個核苷酸片段的順序而且契合於該DNA分子的數個核苷酸片段當中前一者的3』端部分的鹼基殘基序列連接以該DNA分子的數個核苷酸片段當中後一者的5』端部分的鹼基殘基序列。
18.如權利要求16的方法，其特徵在於其中被使用於步驟(e)中的鹼基殘基順序解密機制包括(i)一作為第三解密鑰匙之鹼基殘基順序碼來供給步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列進行比對，其中該鹼基殘基順序碼是根據權利要求1的方法的步驟(a)中所提供的DNA分子的鹼基殘基順序被設計，但省略掉該DNA分子上被重複的鹼基殘基，由此，從步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列的順序可被至少部分地確定；以及(ii)一作為第四解密鑰匙的鹼基殘基出現頻度碼來供給步驟(d)所推算出的所述的核苷酸序列進行鹼基殘基出現頻度的比對，其中該鹼基殘基出現頻度碼是根據權利要求1的方法的步驟(a)中所提供的DNA分子的鹼基殘基出現頻度被設計，由此，在與(i)中的鹼基殘基順序碼合用下，該帶有秘密信息且權利要求1的方法而將被隱藏於一媒介物內的DNA分子的全長核苷酸序列推算出。
19.如權利要求16的方法，其特徵在於其中於步驟(a)中，DNA物質是從一或數個選自於下列所構成的群組中的媒介物被分離出紙、玻璃、塑料、硝基纖維素層、聚碳酸酯層、尼龍層、織物，以及其組合。
20.如權利要求16的方法，其特徵在於其中於步驟(b)中，被使用作為第一解密鑰匙的該數組PCR引物對具有彼此相同或不同的正向引物。
21.如權利要求16的方法，其特徵在於其中於步驟(b)中，被使用作為第一解密鑰匙的該數組PCR引物對具有彼此相同或不同的反向引物。
22.如權利要求16的方法，其特徵在於其中於步驟(c)中，被使用作為第二解密鑰匙的該數個測序引物是彼此相同的。
23.如權利要求16的方法，其特徵在於其中於步驟(c)中，被使用作為第二解密鑰匙的該數個測序引物是彼此不同的。
全文摘要
本發明揭示了一種用以隱藏一被攜帶於一DNA分子內的秘密信息(secret information)的方法以及一種用以將一通過該隱藏方法而被隱藏的秘密信息予以解密的方法，其中該隱藏方法涉及到測序識別序列、正向引物識別序列以及反向引物識別序列的使用，而該解密方法涉及到分別對應於在用以隱藏該秘密信息的方法中所使用到的測序識別序列、正向引物識別序列以及反向引物識別序列的測序引物、正向引物以及反向引物的使用。
文檔編號C12Q1/68GK1580277SQ0312751
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月6日 優先權日2003年8月6日
發明者梁明華 申請人:博微生物科技股份有限公司