與肽結合的色氨酸和與多肽結合的色氨酸的混合物的製作方法

2023-10-10 02:04:39 2

專利名稱：與肽結合的色氨酸和與多肽結合的色氨酸的混合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含色氨酸的組合物。
背景技術：
腦內的血清素(serotonine)水平已與情緒、機警、警覺、睡眠開始和質量、抗焦慮 作用、抑鬱、感情反應控制、食慾和性行為相關聯。存在許多出版物，其中腦血清素水平的改 變與天然胺基酸L-色氨酸(Trp或W)的可用度相關。因為這種關聯，提高血漿色氨酸水 平的方法受到大量關注。已有報導，每個個體1克/天左右的色氨酸量產生臨床顯著的作 用(Markus et al.，Am. J Clin. Nutr 2005 ;81，1(^6-1033)。提高血菜色氨酸水平的一種 方法涉及消耗富含乳清蛋白(whey protein) α-乳白蛋白(lactalbumin)的蛋白質製劑。 α-乳白蛋白製劑是可容易獲得的，並具有相對高的色氨酸濃度。然而，其中提供α-乳白 蛋白的途徑(見例如DE 4130284和JP 2279700)並未考慮腦色氨酸和血清素水平的主要 決定因子不只是血漿色氨酸濃度，而是所謂的 ρ/LNAA比例(Fernstrom and ffurtman. Science 1971，173，149-152)。該Trp/LNAA比例代表血漿中色氨酸相對於大中性胺基酸 (Large Neutral Amino Acid，LNAA ；即酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的和) 的摩爾比例。這些LNAA與色氨酸競爭攝入大腦，推測是因為使用了相同的跨越血-腦屏障 的轉運機制。因此，提高腦色氨酸濃度的最有效途徑是供應具有高Trp/LNAA比例的製備 物。大量出版物a. ο. WO 02/46210涉及從α -乳白蛋白製備具有提高的Trp/LNAA比例的 肽級分。游離色氨酸(即游離胺基酸)的使用會提供最簡單和最便宜的途徑，用於提供具 有高Trp/LNAA比例的製劑。然而，在許多國家中，存在嚴格管制游離色氨酸供應的立法。遊 離色氨酸在其多種應用形式中的最大允許水平在各個國家不同。為了以更自然的方式供應 額外的膳食色氨酸，更近期的途徑著眼於提供富含色氨酸的蛋白質。如所述的，α-乳白蛋 白及其水解產物已作為提高血漿色氨酸水平的安全選擇獲得普及。然而，α-乳白蛋白作 為色氨酸富集製劑起點的用途伴隨著最大Trp/LNAA比例和成本方面的缺點。α -乳白蛋 白和乳球蛋白形成組成乳清的主要蛋白質。因為在工業規模上完全分離α-乳白蛋白 和乳球蛋白是困難的，所以意味著成本有效的α-乳白蛋白製劑會同樣含有β-乳球 蛋白。儘管α-乳白蛋白具有5. 3%的摩爾色氨酸含量，但是β-乳球蛋白的色氨酸含量僅 為2%。儘管α-乳白蛋白具有0.11的摩爾Trp/LNAA比例，但是β-乳球蛋白具有不多 於0.04的摩爾Trp/LNAA比例。因此，顯然β-乳球蛋白對α -乳白蛋白製劑的任何汙染 會顯著降低最終產物的Trp/LNAA比例。考慮到對能夠調控腦血清素水平的製劑的廣泛興趣，人們需要下述改進的生產方 法，所述生產方法用於生產可在多種食物和營養藥物製品中廣泛應用的、具有高Trp/LNAA 比例的蛋白質和肽製劑。

發明內容
本發明涉及用於生產含色氨酸的組合物的方法，所述方法包括集合、優選地混合-與肽結合的色氨酸組合物和/或游離的色氨酸，所述與肽結合的色氨酸組合物 優選地是水溶性的，並且具有大於0. 1、優選地大於0. 15的Trp/LNAA比例；和-與多肽結合的色氨酸組合物，其優選地是水溶性的，並且具有大於0.15的Trp/ LNAA比例。優選地，所述與肽結合的色氨酸組合物如下獲得水解溶菌酶、優選地水解雞卵溶 菌酶，以製備具有5和45之間DH的水解產物，並任選地例如通過去除含精氨酸或賴氨酸的 肽的部分，對所述水解產物分級、富集或純化。優選地，與多肽結合的色氨酸組合物是完整 的溶菌酶，優選地是雞卵溶菌酶。本發明還涉及包含色氨酸的組合物，其中10%到90%、優選地20%到80%的色氨 酸作為游離色氨酸或與肽結合的色氨酸存在，10%到90%、優選地20%到80%的色氨酸作 為與多肽結合的色氨酸存在。任選地，所述組合物除了與肽結合的色氨酸以外還包含游離 色氨酸。通常存在的色氨酸中少於10%會是游離色氨酸的形式，優選地本發明組合物中存 在的色氨酸中0 %到5 %、更優選地0 %到2 %、最優選地0 %到1 %會是游離色氨酸的形式， 如果同樣存在與肽結合的色氨酸的話。通常在用於攝入的一份劑量中使用0. Ig到20g本 發明的組合物。優選地，多於30mol%、優選地多於40mol%、更優選地多於50mol%、進一步更優 選地多於60mol%、還要更優選地多於70mol%和最優選地多於80mol %的與肽結合的色氨 酸以二肽或三肽的形式存在。另外，優選地多於40mol%、更優選地多於50mol%、進一步更 優選地多於60mol%、還要更優選地多於70mol%和最優選地多於80mol %的與多肽結合的 色氨酸作為完整的蛋白質、優選地作為溶菌酶存在。本發明的另一方面涉及用作營養藥物、優選地用作藥物的本發明的組合物或溶菌 酶，或本發明的組合物作為營養藥物、優選地作為藥物的用途，或本發明的組合物在製備營 養藥物、優選地製備藥物中的用途，優選地其中所述營養藥物、優選地藥物被用於預防或治 療以改善情緒、認知、食慾、機警、警覺、睡眠開始和品質、抗焦慮作用、抑鬱、情感反應控制 或性行為，或者被用作食物、飼料、膳食補充劑製備中的成分。另外，本發明涉及本發明的組合物或溶菌酶在消耗後15和240分鐘之間、優選地 30和240分鐘之間的時間段中提高血漿Trp/LNAA比例的用途。這一提高與攝入本發明的組 合物或溶菌酶之前即刻或不攝入本發明的組合物或溶菌酶時的血漿Trp/LNAA比例相比。有利地，本發明的組合物還包含碳水化合物。發明詳述本發明的含色氨酸的組合物包含兩種可明顯區別的級分，這兩種級分在口攝入後 能得到長時間的高血漿Trp/LNAA比例。一種級分包含與肽結合的色氨酸(因此稱作含色 氨酸的肽，為容易吸收的、低分子量肽形式)，或游離色氨酸。在含色氨酸的肽的情況下，該 級分包含大比例的結合有色氨酸的二肽和三肽。另一種級分包含與多肽結合的色氨酸(因 此稱作含色氨酸的多肽，優選地是完整蛋白質的形式)，其在口攝入後僅非常緩慢地釋放其 與肽結合的色氨酸。因此，本發明描述了這兩種富含色氨酸的級分的新穎組合，與僅使用含 色氨酸的肽級分相比，所述組合在口消耗後迅速在血中引起並在延長的時間中維持高Trp/ LNAA水平。存在於低分子量級分中的與肽結合的色氨酸優選地衍生自雞卵溶菌酶，與多肽結合的色氨酸級分或更大分子量的級分優選地是溶菌酶，例如完整的雞卵溶菌酶或另一與 多肽結合的色氨酸來源，如具有高Trp/LNAA比例的完整蛋白質。優選地，含色氨酸的多肽 是在胃條件下能夠抵抗蛋白水解破壞的蛋白質。有利地，這類與多肽結合的色氨酸例如完 整的蛋白質(如完整溶菌酶)能夠在蛋白酶抗性測試中所述的胃條件(見「材料和方法」) 下抵抗蛋白水解破壞。容易吸收的含色氨酸的肽級分優選地是水溶性的，優選地具有高於15的DH，更 優選地具有高於20的DH，多於0. 10、優選地多於0. 15的Trp/LNAA比例，並優選地包含肽 Aff (作為二肽)或GNW(作為三肽)，更優選地包含AW和GNW。合適的含色氨酸的肽級分的 例子是溶菌酶和α -乳白蛋白的水解產物，溶菌酶水解產物是優選的含色氨酸的肽級分。以更低速度提供色氨酸的與多肽結合的色氨酸級分具有低於10、優選地低於5的 DH。完整的蛋白質具有0的DH。與多肽結合的色氨酸級分優選地是水溶性的。另外，與多 肽結合的色氨酸級分具有大於0. 15的Trp/LNAA比例，並且抵抗在人胃中的普遍條件下的 蛋白水解破壞。後一要求的體外測試闡述於本申請的「材料和方法」章節中。如上文所述，本發明的組合物優選地包含碳水化合物，以刺激例如胰島素生產。本發明涉及包含游離色氨酸或與肽結合的色氨酸級分以及與多肽結合的色氨酸 級分的組合物。與肽結合的色氨酸級分具有至少0. 1、優選地至少0. 15、更優選地0. 15和 1. 8之間的Trp/LNAA摩爾比例，並包含優選地至少一種、優選地至少兩種不同的肽，所述肽 優選地是水溶性的。優選地，所述組合物包含AW(作為二肽)或GNW(作為三肽)，優選地包 含AW和GNW，最優選地包含AW和GNW且其中AW與GNW的摩爾比例在1 2和10 1之 間，優選地在1 2和5 1之間。另外，含色氨酸的肽富含色氨酸，並包含至少一種、優選 地至少兩種不同的二肽或三肽，其中選自二肽或三肽的肽以佔二肽和三肽總量至少5mol % 的量存在，在所述組合物中，多於30mOl%、優選地多於40mOl%、更優選地多於50mOl%、進 一步更優選地多於60mol %、還要更優選地多於70mol %和最優選地多於80mol %的與肽結 合的色氨酸以二肽或三肽的形式存在。與肽結合的色氨酸級分優選地是溶菌酶水解產物或 經純化或分級的溶菌酶水解產物。我們發現，根據本發明的所述水解產物在體內迅速產生 高血漿Trp/LNAA比例。非常令人驚訝的是，發現以足夠高的劑量給予時在血漿中檢測的 Trp/LNAA比例比水解產物的Trp/LNAA比例更高。足夠高的劑量優選地是大於10克、大於 12克或大於14克溶菌酶水解產物的劑量。所述級分的又一優點是含Trp的肽非常小，使得 即便與具有不那麼有利的Trp/LNAA比例的富含蛋白質的製品組合時，水解產物也能夠立 即產生高血漿Trp/LNAA比例。本發明的組合物可還包含游離色氨酸，例如可向組合物中添 加游離色氨酸。優選地，在存在與肽結合的色氨酸的情況下，所述組合物不含有多於 (以乾物質計)的游離色氨酸。優選地，與多肽結合的色氨酸級分具有多於0. 15、優選地在0. 15和0. 5之間的摩 爾Trp/LNAA比例，完整的溶菌酶具有0. 23的Trp/LNAA比例。與多肽結合的色氨酸級分在 消耗時還提供了與肽結合的色氨酸，但是與來自與肽結合的色氨酸級分的與肽結合的色氨 酸相比，由所述與多肽結合的色氨酸級分體內釋放的與肽結合的色氨酸要在更晚時才能被 腸吸收。有利地，在兩種級分同時消耗的情況下，來自與多肽結合的色氨酸級分的與肽結合 的色氨酸的腸吸收在時間上比來自與肽結合的色氨酸級分的與肽結合的色氨酸或游離色 氨酸的腸吸收更晚發生。我們發現，可以通過口攝入抵抗人胃中酶促水解的完整蛋白質，來實現這類延遲的色氨酸釋放。優選地，這類完整的蛋白質具有高Trp/LNAA比例。根據本發明的另一方面，與包含經水解的溶菌酶且不含(完整)溶菌酶的組合物 相比，經水解的溶菌酶和(完整)溶菌酶混合物的組合物的口味得到了改善。本發明的另一方面是溶菌酶或包含游離色氨酸或與肽結合的色氨酸級分和與多 肽結合的色氨酸和任選地碳水化合物的組合的組合物的下述用途用於改善情緒、經前綜 合症(PMS)、認知、食慾、機警、警覺、睡眠開始和品質、抗焦慮作用、抑鬱、情感反應控制或性 行為，或者被用作用於改善情緒、認知、食慾、機警、警覺、睡眠開始和品質、抗焦慮作用、抑 鬱、情感反應控制或性行為的食物、飼料、膳食補充劑製備中的成分。除了游離色氨酸或與 肽結合的色氨酸、與多肽結合的色氨酸和任選的碳水化合物以外，組合物也可以包含被推 薦用於「腦」營養、用於緩解壓力或抑鬱或用於改善機警、情緒、認知或睡眠模式的化合物。本發明公開了下述食物(包括嬰兒配方)、寵物食物、飼料、膳食補劑或營養藥物 組合物，它們包含本發明的組合物或根據本發明的方法生產的組合物或優選地包含與完整 的雞卵溶菌酶組合的肽GNW(作為三肽)、SW(作為二肽)或AW(作為二肽)的根據本發明 的組合物。根據又一個實施方案，公開了本發明的含色氨酸的組合物用於在攝入肽或組合物 後90分鐘內、優選地60分鐘內、更優選地30分鐘內、最優選地15分鐘內提高血漿Trp/ LNAA比例的用途，或用於製備下述營養藥物組合物的用途，所述營養藥物組合物用於在攝 入組合物後90分鐘內、優選地60分鐘內、更優選地30分鐘內、最優選地15分鐘內提高血 漿Trp/LNAA比例。根據又一個實施方案，公開了本發明的含色氨酸的組合物用於將提高的 血漿Trp/LNAA比例維持至攝入組合物後超過90分鐘、優選地120和240分鐘之間、更優選 地超過150分鐘的時間段的用途。根據又一個實施方案，公開了本發明的溶菌酶或含色氨 酸的組合物用於製備下述營養藥物組合物的用途，所述營養藥物組合物用於將提高的血漿 Trp/LNAA比例維持至攝入組合物後超過90分鐘、優選地120和240分鐘之間、更優選地超 過150分鐘的時間段。本發明提供了包含色氨酸的組合物，其中色氨酸作為游離色氨酸、和/或以與肽 結合的形式(非常適用於在非常短的時間間隔後提供血漿Trp/LNAA比例的有效提高)和 作為與多肽結合的色氨酸(用於在與組合物中不存在與多肽結合的色氨酸的情況相比在 延長的時間段中維持高血漿Trp/LNAA比例)存在。這一作用在攝入本發明的組合物後90 到240分鐘時尤其顯著。我們注意到與碳水化合物組合的兩種含色氨酸的級分有助於快速 和延長的！"rp/LNAA提高。根據本發明的一個方面，容易吸收的、與肽結合的色氨酸可在工業過程中通過酶 促(預)水解得自溶菌酶，優選地得自雞卵溶菌酶，即(雞卵)溶菌酶優選地以水解產物的 形式提供。以水解產物形式提供時，含色氨酸的肽的胃腸道吸收被大幅促進。與多肽結合 的色氨酸級分優選地由具有高Trp/LNAA比例的完整蛋白質代表，所述完整蛋白質在人胃 中不降解或僅最低限度地(marginally)降解。優選地，所述完整的蛋白質是雞卵溶菌酶。 被經常用於提高血Trp/LNAA比例的來自牛奶的α -乳白蛋白不具有與多肽結合的色氨酸 的合適來源的資格，因為所述分子具有比溶菌酶更低的Trp/LNAA比例。根據本發明的組合 物的一個特徵是容易吸收的游離色氨酸和/或與肽結合的色氨酸(如溶菌酶水解產物)和 抗蛋白酶的與多肽結合的色氨酸(例如完整蛋白質，優選地溶菌酶)的混合物。任選地，所述組合物可包含碳水化合物或游離的色氨酸。優選地，通過將游離色氨酸和/或與肽結合 的色氨酸(優選地作為水解產物)和與多肽結合的色氨酸(優選地作為完整蛋白質，例如 溶菌酶)以從1 3到1 0.2範圍內的重量比(基於蛋白質乾重測量)混合來生產本發 明的組合物。更優選地，所述組合物以1 1到1 0.4的蛋白質乾重比例包含水解產物 和完整蛋白質。容易吸收的和蛋白酶抗性的蛋白質級分二者的特徵均是高於0. 10、優選地 高於0. 15的分子Trp/LNAA比例。組合物可作為粉末、液體或糊劑提供。這些液體或糊劑 可具有中性或酸性的PH值。優選地，混合物具有低於5、更優選地低於4的pH。還在本申請的另一實施方案中，雞卵溶菌酶被轉化為包含肽組合物的水解產物， 所述肽組合物中多於50%、優選地多於60%、更優選地多於75%的存在的肽具有低於 500Da的分子量。這具有下述條件水解產物中存在的肽的分子量分布如本申請的材料和 方法章節中所述完成。容易吸收的級分的一個重要優點是包含在游離色氨酸或二肽和三肽中的色氨酸 在口服消耗後立即跨越腸壁轉運進入血流中。因此，血漿色氨酸水平提高，幾乎立即伴有對 腦血清素水平的直接影響。本申請實施例6和11中展示的數據顯示，以這類二肽和三肽形 式存在的色氨酸殘基非常快速地導致高Trp/LNAA比例。在這一方面，以這些二肽和三肽形 式存在的色氨酸殘基似乎比游離的色氨酸甚至更有效。根據本工藝獲得至少具有010、優選 地至少0. 15的分子Trp/LNAA比例的水溶性肽級分，只要如本申請的材料和方法章節中所 述進行水解產物的胺基酸分析即可。以二肽和三肽形式提供色氨酸的另一重要優點還在於這些肽的胃腸吸收迅速到 使得它們能夠與含有蛋白質的食物如乳製品(其天然地具有較不優良的Trp/LNAA比例) 組合消耗，並仍然導致在消耗後90分鐘內，優選地60分鐘內，更優選地30分鐘內的周期中 有效提高血漿中的Trp/LNAA比例。因此，本發明提供了本發明組合物和/或溶菌酶用於在攝入肽後90分鐘內、優選 地60分鐘內、最優選地30分鐘內獲得提高的血漿Trp/LNAA比例的用途，或用於製備下述 營養藥物組合物的用途，所述營養藥物組合物用於在攝入肽後90分鐘內、優選地60分鐘 內、最優選地30分鐘內獲得提高的血漿Trp/LNAA比例。本文上下文中提高的Trp/LNAA比 例表示與消耗或攝入本發明的組合物之前的情況相比該比例的提高。「蛋白質」或「多肽」在本文中被定義為包含多於30個胺基酸殘基的鏈。「完整蛋白質」或「完整多肽」在本文中被定義為使用「材料和方法」章節中所述的 SDS-PAGE方法比較時，分子量與天然存在的蛋白質相同的蛋白質。完整蛋白質的「蛋白酶抗性」如「材料和方法」章節中所述測定。「肽」或「寡肽」在本文中被定義為通過肽鍵連接的至少兩個胺基酸的鏈。術語「肽」 和「寡肽」被認為是同義的(如通常所認為的那樣)，且每種術語可根據上下文的需要交換 使用。含肽色氨酸(ρ印tide-containing tryptophan)或含色氨酸的肽組合物或級分 (級分和組合物在本文上下文中可互換使用)表示包含至少一種含色氨酸的肽的組合物。 在本發明的上下文中，含肽色氨酸或含色氨酸的肽組合物可僅包含一種肽，優選地所述組 合物包含多於一種肽。含多肽的色氨酸(polyp印tide-containing tryptophan)或含色氨 酸的多肽組合物或級分(級分和組合物在本文上下文中可互換使用)表示包含至少一種含色氨酸的多肽的組合物。在本發明的上下文中，含多肽的色氨酸或含色氨酸的多肽組合物 可僅包含一種多肽。含色氨酸的肽表示包含至少一個色氨酸胺基酸殘基的肽。含色氨酸的多肽表示包 含至少一個色氨酸胺基酸殘基的多肽。與肽結合的色氨酸表示作為肽中的胺基酸存在的色氨酸。與多肽結合的色氨酸表 示作為多肽中的胺基酸存在的色氨酸。本發明的含色氨酸的組合物包含含肽色氨酸組合物和含多肽的色氨酸組合物，並 因此應包含至少一種含色氨酸的肽和至少一種含色氨酸的多肽。游離色氨酸表示作為游離胺基酸的色氨酸，因此不是肽或多肽的部分。「水溶性」肽是在5. 0的pH下可溶於水的肽。本文中所有(寡)肽和多肽式根據通常的實踐從左到右以氨基端到羧基端的方 向書寫。本文中使用的胺基酸的單字母密碼是本領域通常已知的，並可見於Sambrook，et al. (Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989)中。蛋白質水解產物、水解產物或經水解的蛋白質表示通過蛋白質的酶水解形成的產 物，富集或分級的水解產物是下述蛋白質水解產物級分，其例如富含選定的肽，或其中肽或 多肽已從水解產物中被去除。因此，富集的水解產物優選地是肽的混合物(或肽混合物)。 因此，本發明的肽混合物是至少兩種，優選地至少三種，更優選地至少四種含色氨酸的肽的 混合物。更優選地，混合物包含肽組合物，所述肽組合物中多於50摩爾％、優選地甚至多於 60摩爾％、最優選地多於75摩爾％的存在的肽具有低於500Da的分子量。Trp/LNAA比例 表示色氨酸相對於其它大中性胺基酸(LNAA ；即酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈 氨酸的總和)水平的摩爾比例。除了血漿Trp/LNAA比例外，Trp/LNAA比例僅涉及與肽結合 和/或與多肽結合的胺基酸。對血漿Trp/LNAA而言，Trp/LNAA比例涉及游離胺基酸。因 此，游離的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸不被考慮進Trp/LNAA比 例中。與肽結合的胺基酸是屬於肽部分的胺基酸，並且不是游離的胺基酸。Tyr/LNAA比例表示酪氨酸相對於支鏈胺基酸(BCAA ；即亮氨酸、異亮氨酸和纈氨 酸的總和)水平的摩爾比例。優選地，Tyr/BCAA比例高於0. 1，優選地高於0. 12。優良的睡眠開始和質量被定義為在上床後45分鐘內進入的靜態睡眠。情緒被定義為精神的興奮狀態，並優選地使用情緒狀態類型問卷法(Profile of Mood States questionnaire)測量(見本申請的實施例6)。認知被定義為與例如解決問題、學習、記憶和語言這類領域相關的組合技能。食慾被定義為進食的期望，其通過感覺或飢餓刺激。機警被定義為精神的注意或警惕狀態，優選地使用Mackworth Clock測試和臨界 追蹤任務(Critical Tracking Task)測量(見本申請的實施例9)。抗焦慮(anxiolytic)作用是導致釋放恐懼、不安(apprehension)或擔憂的感覺 的作用。抑鬱被定義為一種精神狀態，特徵是嚴重和持久的喪失越快的感覺。術語性行為在本文中被用作性慾(libido)的同義詞。
在W002/46210中描述了提高乳清蛋白水解產物中色氨酸水平的方法。在使用的 方法中，首先在酸性PH下用一種或多種酸性蛋白酶水解乳清，優選地用胃蛋白酶、凝乳酶 (rennin)、酸性真菌蛋白酶、凝乳酶(chymosin)、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶 或無花果蛋白酶水解乳清。優選的孵育條件在PH 1.5和3. 5之間，並對其進行選擇，以產 生具有疏水性質的肽。水解有意地以下述方式進行，所述方式使得色氨酸殘基被摻入大的 疏水肽中。小的、更溶於水的肽中存在少得多的色氨酸。在隨後的加工步驟中，PH被提高 至4. 0到6. 0，以促進這些大的、含色氨酸的肽沉澱，從而便於從乳清水解產物中選擇性回 收它們。色氨酸僅存在於相對大的肽中，色氨酸進入血的吸收會被延遲，從而限制了製劑 作為食物或飲料成分(特別是與其它蛋白質組合)的應用可能性。值得強調的是，完整的 α-乳白蛋白不符合根據本發明的完整蛋白質級分的標準，因為根據「材料和方法」章節中 所述測試其不是蛋白酶抗性的。本發明公開了簡單的水解工藝，所述工藝用工業可獲得並且特徵是高Trp/LNAA 比例的蛋白質開始。本發明的水解工藝具有以蛋白質色氨酸為基礎多於30%的色氨酸產 率，並產生包含色氨酸的水溶性肽組合物。色氨酸殘基的較大部分包含在二肽和三肽中這 一事實意味著立即攝入血流中。如即將公開的，該特性允許在多種食物或營養藥物製品中 摻入所述水解產物。非常驚人地是本發明還公開了 通過口服消耗，根據本發明的水解產物 能夠產生比實際的水解產物Trp/LNAA比例更高的血漿 ρ/LNAA比例。根據本發明，雞卵溶菌酶被用作便利的起始材料，用於提供具有高Trp/LNAA比例 的本發明的組合物，所述組合物在口攝入後導致迅速並長期提高的血漿Trp/LNAA比例。溶 菌酶以3-4%的濃度存在於卵白中。通過利用其格外高的等電點，使用簡單的陽離子色譜純 化步驟，之後任選地進行結晶步驟，將溶菌酶從卵白中工業分離。得到的產物幾乎是純的， 並且該工業可獲得的產物具有7. 8%的分子色氨酸含量和至少0. 15的分子Trp/LNAA比例。 因此，溶菌酶(即完整蛋白質)具有比純α-乳白蛋白和/或β-乳白蛋白更高的Trp/LNAA 比例。因此，根據本發明的溶菌酶水解產物優選地具有高於0. 15的摩爾Trp/LNAA比例，更 優選地Trp/LNAA比例高於0. 20，進一步更優選地Trp/LNAA比例高於0. 23，還要更優選地 Trp/LNAA比例高於0. 25，最優選地Trp/LNAA比例高於0. 30。通常，摩爾Trp/LNAA比例低 於3. 0。同樣，這類溶菌酶代表了含色氨酸的肽或組合物的優選的起點，並且可以被用作與 多肽結合的色氨酸組合物。溶菌酶(EC3. 2. 1. 17)是能夠水解細菌細胞壁中特異肽聚糖鍵， 導致細胞裂解的酶。因為其殺細菌作用，溶菌酶通過防止感染在宿主防禦(host defence) 中起到重要作用。在生理條件下，溶菌酶分子非常能抵抗蛋白水解攻擊。該罕見的抗性可 在進化基礎上解釋因為入侵的細菌能夠分泌多種蛋白酶，因此對這類蛋白酶易感的溶菌 酶分子會被快速失活。已針對a. ο.反芻動物的胃溶菌酶闡述了其蛋白酶抗性(Dobson et al，J.Biol Chem. 1984，259 (18) 11607-11616)。從結構觀點來看，分子中四個二硫鍵的存在 可被預期增加溶菌酶的蛋白酶抗性。在本申請的實施例1中所示數據的基礎上，雞卵溶菌 酶可被認為如此抵抗蛋白水解攻擊，使得該分子不太可能能夠在人腸道的最接近的部分中 被有效消化。該蛋白酶抗性的結果是，儘管其具有非常吸引人的Trp/LNAA比例，但是完整 的溶菌酶不是迅速提高血漿色氨酸水平的合適來源，僅僅因為色氨酸殘基在胃腸道中存在 的生理條件下不容易被解離。然而，完整的雞卵溶菌酶可在接近中性的PH條件下被酶促水 解(Porter et al.，J. Agric. Food Chem. 1984，32，334-339)。所述文章與我們的下述觀察結果一致完整的雞卵溶菌酶能夠在人腸更遠端部分中釋放與肽結合的色氨酸。結合上述 容易吸收的、「預消化的」溶菌酶水解產物，這開啟了創建下述製劑的出人意料的可能性，所 述製劑在口攝入後導致血漿Trp/LNAA比例的立即猛增，之後是與肽結合的色氨酸的緩慢 並持續的釋放。這些動力學在血漿Trp/LNAA水平中再現，導致對腦中多巴胺以及血清素的 新的並驚人的影響。膳食攝入後，存在於食物中的蛋白質被逐漸水解為更小的片段，然後被轉運穿過 小腸壁並吸收進血中。在胃腸道中，從胃、胰和小腸產生的大量不同的蛋白酶能活性水解膳 食蛋白質。內切蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶將膳食蛋白質切割成更小的寡肽。 這些內切蛋白酶中僅胃蛋白酶在胃的酸性環境中有活性。胰蛋白酶和糜蛋白酶在十二指 腸、空腸和腸更遠部分中普遍的接近中性的環境中變得有活性。這些內切蛋白酶形成的寡 肽隨後被大量其它酶如二肽基和三肽基肽酶進一步水解，產生二肽和三肽，並被氨基肽酶 和羧基肽酶水解產生游離胺基酸。特異轉運游離胺基酸或二肽和三肽的運載體體系負責穿 越腸壁有效轉運進入血流。膳食攝入後，游離胺基酸、二肽和三肽立即被摻入血流中。比三 肽更大的肽需要額外的酶切割使得能夠吸收。我們發現，如果被摻入以例如乳製品為代表的含高蛋白質的食物基質中，根據本 發明的含色氨酸的組合物也是有效的。這是非常驚人的，因為含蛋白質的食物基質表現出 高LNAA負荷，並因此可被期望為降低具有高Trp/LNAA比例製品的作用。對這種預料之外的 現象的一種可能的解釋是通常的食物製品摻入了完整的而不是充分水解的蛋白質。根據 本發明的水解產物的典型大小分布在圖3中展示。根據該圖，大部分摻入色氨酸和酪氨酸 的肽具有低於500Da的分子量。考慮到色氨酸(MW = 186)和酪氨酸(MW = 163)的非常高 的分子量和只存在非常低水平的游離色氨酸，意味著大部分這些肽應該是三肽或二肽。因 為色氨酸在使用的波長下具有比酪氨酸高得多的摩爾吸光係數，所以峰值應涉及主要摻入 色氨酸的肽。因為根據本發明的含色氨酸組合物中存在的含色氨酸的二肽和三肽被吸附得比 例如未經水解的基質蛋白質所代表的大量LNAA快得多，所以我們推測這是即便存在大量 基質蛋白質時仍能獲得高血漿Trp/LNAA比例的原因。一些具體情形要求在延長的時間段具有高血漿Trp/LNAA比例。例如為了改進和 延長睡眠時間或者需要長時間增強的認知表現的情形。另外，對例如已針對月經前期綜合 徵或絕經後期女性的情況而描述的需要情緒改善的情形而言，根據本發明的組合物尤其相 關。然而，與肽結合的色氨酸如溶菌酶水解產物會產生幾乎即時的血漿Trp/LNAA比例的提 高，與多肽結合的色氨酸(如具有高Trp/LNAA比例的胃蛋白酶抗性蛋白質)的緩慢消化會 保證與肽結合的色氨酸在人腸的更末端部分中持續釋放，導致在攝入本發明的組合物之後 120和240分鐘之間時間段內提高的血漿Trp/LNAA比例。有趣的是，我們目前的實驗數據也似乎表明，當以足夠高的劑量給予時，根據本發 明的水解產物能夠在人志願者體內產生比水解產物的Trp/LNAA比例更高的Trp/LNAA比 例。足夠高的劑量優選地是多於10克、多於12克或多於14克溶菌酶水解產物的劑量。盡 管這樣的現象是未知的，並且根據我們最大限度的知識不存在對該作用的被接受的解釋， 但是我們相信，這可能是由溶菌酶分子的極高的精氨酸含量引起的。本文公開了最近提出 的工作假設，以解釋實施例中所示實驗數據。該假設被用於給出本發明人的目前看法，但是本發明不以任何方式關聯或限制於該假設。因此，本發明與該假設的正確性無關。血胰島 素的提高刺激了從血進入外周組織(特別是肌肉)的胺基酸吸收。然而，由於在血中色氨 酸與血漿蛋白質白蛋白結合的事實，色氨酸在很大程度上避開了該途徑。因此，提高的胰島 素水平降低了 LNAA而不是色氨酸的濃度，進而提高了血中的Trp/LNAA比例。因為碳水化 合物的攝食引發胰島素分泌，並刺激外周組織和尤其是肌肉中LNAA的吸收，所以通過碳水 化合物攝取提高血漿 Trp/LNAA 比例(Fernstrom and ffurtman, 1972,Metabolism, Vol. 21, No. 4，337-342)。除了被碳水化合物攝食刺激外，也已知胰島素分泌被具體的胺基酸刺激。 如果灌輸個體胺基酸造成的血漿氨基氮水平非常相似，則胰島素應答可觀地變化。Floyd et al(J Clin Invest 45(9) :1487-502)確立了針對胺基酸的遞減的胰島素應答精氨酸 >賴氨酸>亮氨酸>苯丙氨酸>纈氨酸> 甲硫氨酸。考慮到溶菌酶尤其富含胺基酸精氨酸 的事實，傾向於推測由精氨酸引發的胰島素刺激作用導致高的Trp/LNAA比例。因為已知碳水化合物的胰島素刺激作用，所以根據本發明的碳水化合物優選地被 配製為與碳水化合物組合。結合可快速吸收的與肽結合的色氨酸和可緩慢吸收的與多肽結 合的色氨酸的存在，優選的根據本發明的組合物包含碳水化合物。在本發明的一個實施方案中，溶菌酶，優選地雞卵溶菌酶在工業過程中被酶促 (預)水解，即(雞卵)含色氨酸的肽組合物優選地以水解產物或富集的水解產物形式提 供。以這類(富集的)水解產物形式提供時，極大地便利了含色氨酸的肽的腸吸收。在本 申請的另一實施方案中，雞卵溶菌酶被轉化為包含色氨酸的水解產物或富集的水解產物， 其包含下述肽群體，其中多於50摩爾％、優選地多於60摩爾％、更優選地多於75摩爾％的 存在的肽具有低於500Da的分子量。優選地，這類(富集的)水解產物不含有多於 (以於物質計)的游離色氨酸。存在於水解產物中包含色氨酸的肽的分子量分析如本申請 的材料和方法章節中所述進行，並在圖3中闡述。後一實施方案的一個重要有點是二肽和 三肽中包含的色氨酸在口服消耗後立即被穿過腸壁轉運進入血流中。因此，血漿色氨酸水 平被提高，幾乎同時伴有對腦血清素水平的直接影響。非常驚人的是本申請實施例6中所 示數據顯示，以這些二肽和三肽形式存在的色氨酸殘基的有效性比游離的色氨酸甚至更有 效。該觀察結果強調了本發明提供的優點。WO 2006/009448提供了得自雞卵蛋白質的具有抗高血壓特性的蛋白質水解產物， 以及包含這些水解產物的食物製品和食物補劑。該文件公開了大量水解產物(包括得自雞 卵溶菌酶的水解產物)的製備。所有這些水解產物目的是在人中口服攝食後降低血壓或預 防血壓升高。WO 2006/009448還公開了在鹼性條件下使用枯草桿菌蛋白酶(subtilisin) (EC3. 4. 21. 62 ；商品名稱Alcalase或ftOtex)獲得的溶菌酶水解產物製劑。根據獲得的 高水解程度，這些溶菌酶水解產物含有大比例的具有低於500Da分子量的肽。然而，在WO 2006/009448的上下文中均未涉及下述事實溶菌酶是具有高色氨酸含量的蛋白質來源， 其能夠積極影響腦血清素水平。也沒有提到溶菌酶水解產物包含水溶性肽，所述肽摻入了 大量色氨酸和相對少量的LNAA。WO 2006/009448還未提到溶菌酶或溶菌酶水解產物任一 的高精氨酸和賴氨酸含量。我們根據本申請中所示數據已經發現，溶菌酶分子的高色氨酸 含量與精氨酸和賴氨酸的普遍存在組合，使得溶菌酶成為體內產生高Trp/LNAA比例的完 美的起始材料。另外，WO 2006/009448的上下文未提到本發明中使用的水解產物與其它含 蛋白質的食物共同消耗時所提供的優點。除了膜濾器的使用以外，WO 2006/009448的上下文還沒有提到從具有選定的胺基酸組成的這些水解產物中獲得肽級分的方法，或使用特異 方法提高色氨酸含量或提高Trp/LNAA比例的方法。另外，未記錄提供高度降解的溶菌酶水 解產物與未降解的完整溶菌酶組合的優點。本申請實施例4中所示數據表明，通過在鹼性pH下用枯草桿菌蛋白酶孵育溶菌酶 獲得的溶菌酶水解產物尤其富含Ala-Trp (AW) 二肽。該發現提出化學合成的AW 二肽可能 為本發明溶菌酶水解產物提供合適的備選方案。儘管合成的二肽的使用具有明顯的立法缺 點，但是重要的優點是其成本有效性及其理想的Trp/LNAA比例。理論上可獲得二十種不同 的含色氨酸的二肽，但是我們的研究顯示二肽Ala-Trp (AW)和kr_Trp (SW)代表了通過合 成二肽增強血漿^Trp/LNAA比例的尤其優選的選項。可能使用例如「Peptides =Chemistry and Biology'^by N. Sewald and H. D. Jakubke,Eds. Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002, Chapter 4中所述的常規技術，通過化學合成生產AW和SW 二肽。適用於大規模生產的尤其成本有 效的化學肽合成方法基於用於活化羧基的烷基氯甲酸酯或特戊醯氯化物的使用，與用於 C-端保護的甲基酯和用於N-保護的苄氧羰基(Z)或叔丁基氧羰基的使用組合。用於二肽 Sff的成本有效合成的詳細步驟在實施例5中提供。這樣的化學合成的含色氨酸的二肽和 與多肽結合的色氨酸(如具有高Trp/LNNA比例的胃蛋白酶抗性蛋白質，優選地完整的溶菌 酶)的組合是新穎的。能夠獲得根據本發明的組合物後，我們設想了具有技術和經濟優點的其它新的和 驚人的應用。一種新的應用是在多種嬰兒配方製品中摻入本發明的組合物和/或溶菌酶。牛奶 含有20%的乳清蛋白，人奶則含有40%到60%。因此，牛奶含有比人奶少的α-乳白蛋白， 進而含有比人奶少的色氨酸。正常的、足月的嬰兒通常被餵養基於牛奶的配方，其為不能提 供等價於母乳的胺基酸構成的製品。儘管色氨酸供應不足的結果尚未完全已知，但是具有 高色氨酸的嬰兒配方製品可對嬰兒的認知行為和睡眠開始和質量具有有益的影響。^gman and Zeisel 在 N Engl J Med. 1983 Nov 10 ；309 (19) :1147-1149 中提供了有力的跡象在 健康新生兒中，高血漿色氨酸水平促進了靜態睡眠的快速開始。因此，本發明提供了其中已 提高了色氨酸水平的用於嬰兒配方製品的組合物。根據本發明的另一方面，根據本發明的組合物可以在膳食替代製品中使用。例如， WO 2005/023017描述了高劑量明膠作為膳食替代製品中合適組分的優點。儘管提供了極佳 的感官特性，但是明膠不提供需要的胺基酸平衡，例如其不摻入必需胺基酸色氨酸。因此， 為了達成具有EC Directive 96/8/EC所要求的胺基酸適當平衡的組合物，必須向這類含明 膠的組合物中添加色氨酸。在WO 2005/023017中，優選地以富含色氨酸的蛋白質(例如卵 清粉或全卵粉)的形式添加色氨酸。我們目前已發現，根據本發明的含色氨酸的組合物對 該問題提供了改進的溶液，因為這些水解產物以濃縮得多的形式供應色氨酸。另外，溶菌酶 自身以所需量含有所有必需胺基酸，並同樣是理想地適合膳食替代品的全營養蛋白質。根據本發明的又一方面，根據本發明的組合物和/或溶菌酶被用於在嬰兒、兒童 和成人中改善睡眠開始和質量。睡眠問題在屬於多種年齡組的個體中非常盛行，並與醫學 病症相關。根據本發明的含色氨酸的組合物適用於治療普遍的睡眠問題，但是他們代表了 克服認知、心理、社交(social)和行為紊亂(disturbance)相關問題的一種有用工具。例 子是建立良好的睡眠衛生，克服睡眠開始聯合徵(sle印-onset association)或晝夜節律睡眠障礙(circadian rythym sleep disorder)。所述製品還可適用於改善例如纖維肌痛 患者的睡眠開始和質量和精神狀態。纖維肌痛症候群是一種慢性疼痛症候群，其與嚴重紊 亂的睡眠開始和質量和情緒緊張(emotional stress)相關。我們發現，根據本發明的組合 物和/或溶菌酶的規律攝入一般改善受睡眠問題困擾的個體的睡眠開始和睡眠質量。根據本發明的組合物提供了額外的優點，例如供應(半)必需的胺基酸。溶菌酶 不僅具有高色氨酸水平，而且同樣摻入顯著量的酪氨酸殘基。酪氨酸是神經遞質多巴胺的 前體，並且已知血漿酪氨酸水平影響腦中的多巴胺水平。溶菌酶水解產物不僅比其它已 知的高色氨酸肽含有更少的LNAA，而且比其它已知的高色氨酸肽含有更少的支鏈胺基酸 (BCAA)。這是重要的，因為已知BCAA降低多巴胺前體酪氨酸的血漿可利用度。因此，其高 Trp/LNAA比例與其高Tyr/BCAA比例組合，使溶菌酶成為獨特的分子。因此，根據本發明的 包含溶菌酶水解產物和完整溶菌酶的組合物被非常適當地定位為「腦食物」，也就是說，用 於供應適當的神經遞質水平所需的必需胺基酸。已知多巴胺體系介導報酬(reward)和動 機(motivation)的關鍵作用，及其對集中精神(concentration)、記憶、機警、注意力、解決 問題和精神運動協調的影響。如本申請實施例9中所闡述的，根據本發明的溶菌酶水解產 物的攝入對警覺、機警、集中精神和精神運動協調(psychomotor coordination)具有顯著 的有益影響。該發現證實根據本發明的組合物可被期望為不僅刺激血清素體系，而且刺激 多巴胺體系。若干組個體可受益於該發現。例如，絕經期的女性具有降低的解決問題能力的 普遍不適(complaint)，她們將其與不能集中精神關聯。因此，根據本發明的組合物特 別適用於在該年齡組的女性中對抗這些問題。在年輕和中年女性的範疇內，經期症候群 (premenstrual syndrome)是非常普遍的。該症候群的特徵是多種症狀，但是關於抑鬱和情 緒不穩定的不適經常發生。為了對抗這些不適，經常開出選擇性血清素再吸收抑制劑如氟 西汀的處方，並且在具有更溫和症狀的女性中推薦飲食適應(dietary adaptation)和防止 壓力。基於本申請實施例6和9中所述實驗的結果，根據本發明的組合物代表極佳的治療， 特別是對這類較溫和的病例而言。另外，多巴胺不足伴隨著注意力缺陷多動症(ADHD)，從而 可預期通過根據本發明的組合物減輕該病症的症狀。我們的下述發現是驚人的對壓力後 表現的有益影響在抗壓的受試者中特別突出。可能的解釋可以是具有(過度)活動的血 清素體系的有壓力的人需要來自飲品的色氨酸來補充他們的血清素儲備，因此不能使用該 色氨酸改進他們在任務中的表現。根據這一條推理，沒有過度活動的血清素能體系的抗壓 人群不需要色氨酸來補充他們的色氨酸儲備，並且能夠使用其改善他們的壓力後表現。一 種備選的解釋可能是這些作用事實上歸因於多巴胺能過程的刺激作用。可通過富含酪氨 酸的食物成分增強多巴胺合成，尤其是與低水平的支鏈胺基酸(BCAA)組合時。在本文中公 開這些工作假設(working hypotheses)以解釋實施例中所示實驗數據，並用於給出本發明 人的目前看法(present insight)。但是本發明不以任何方式關聯或限制於這些假設。因 此，本發明與這些假設的正確性無關。如別處所陳述的，溶菌酶不僅具有高色氨酸水平，而 且同樣包括有顯著量的酪氨酸殘基。根據本發明的組合物和/或溶菌酶還能提高食物製品中的半胱氨酸含量。儘管 不是必需的胺基酸，但是在許多食物製品中半胱氨酸濃度是有限的。半胱氨酸的內源合 成需要甲硫氨酸的存在，像半胱氨酸一樣，甲硫氨酸濃度在許多食物製品中是有限的。提高的食物半胱氨酸含量的優點尤其涉及甲硫氨酸對血清高半胱氨酸提升效應的拮抗效應 (antagonistic effect)。該發現在WO 03/055335中已描述。根據本發明的組合物特徵也 是高半胱氨酸水平。事實上，溶菌酶分子含有比色氨酸殘基(6)甚至更多的半胱氨酸殘基 (8)。在該角度中，根據本發明的組合物形成提高某些製品半胱氨酸含量的極佳來源。發現 提高的半胱氨酸含量對於例如嬰兒配方的製品而言是重要的。不僅嬰兒配方基於酪蛋白或 酪蛋白和乳清蛋白的混合物，而且對基於大豆的製品和事實上對於所有富含蛋白質的製品 而言，其中主要的蛋白質來源由含有相對低量色氨酸或半胱氨酸的蛋白質提供。除了來自 牛乳和明膠的蛋白質組分以外，玉米蛋白、酵母蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白和水稻蛋白代表 了這類蛋白質的例子。另外，含有高劑量明膠的上述膳食替代製品含有不足量的半胱氨酸。包含例如含有色氨酸的二肽或三肽、特別是SW(作為二肽)或AW(作為二肽)的 根據本發明的組合物和/或溶菌酶可以以任何合適的形式使用，例如食物或飲料，如用於 特殊營養用途的食物(Foods for Special Nutritional hes)，膳食補劑，營養藥物或甚 至用在飼料或寵物食物中。可在這些製品的正常過程中的任何階段添加含有溶菌酶的組合 物。如果在食物或飲料中使用，則具有相對低蛋白質含量的製品是優選的，從而消耗根據本 發明的製品後在血中維持高的Trp/LNAA比例。相關的食物製品包括例如穀物棒、巧克力和 含有巧克力的飲品、烘焙物品如蛋糕和曲奇，以及液體食物如湯或湯粉末。除了乳製品如乳 和酸乳之外，其它合適的飲料包括非醇和醇飲品以及要被添加進飲用水和液體食物中的液 體製劑。非醇飲品優選地為礦物質水、運動飲品、果汁、檸檬水、茶、、咖啡、無咖啡因的咖啡、 濃縮飲品如一次量酒(shots)、能量飲品(例如含有葡糖醛酸內酯、咖啡因或牛磺酸)和碳 酸飲料(例如汽水(pops)、蘇打水(sodas)和可樂飲品)。與根據本發明的組合物和/或溶菌酶的優選的組合是與被推薦用於「腦營養」的 化合物例如鐵、鋅、鎂、維生素(特別是B2、B6、葉酸和C)、ω-3和DHA脂肪或脂肪酸、葡萄 糖、GABA、膽鹼、磷脂醯絲氨酸、輔酶Q10、肌酸、牛磺酸和5-ΗΤΡ的組合，或與被推薦用於釋 放壓力或抑鬱的化合物如纈草(valerian)、巧克力、聖約翰草(St John' s worth)、5_HTP、 磷脂醯絲氨酸、醇、香蜂葉(lemon balm)、綠茶或綠茶提取物、甘菊或S-腺苷甲硫氨酸的組 合，或與被推薦用於改進機警的化合物如咖啡因、瓜拉那、人參、白果(gingko bilboa)、聖 約翰草和5-HTP的組合，或與被推薦用於情緒改善的化合物如GABA、5-HTP、PEA、巧克力、 綠茶或綠茶提取物、白果、洋蘇草(Salvia)或S-腺苷甲硫氨酸的組合，或與被推薦用於改 善睡眠的化合物例如乳肽、游離色氨酸、阿片肽(opoid peptide)或褪黑素的組合。用於 特殊營養用途的食物包括以下範疇運動食物、瘦身食物、嬰兒配方和臨床食物。術語膳 食補劑在本文中使用時表示由口攝取的製品，其含有旨在補充膳食的化合物或化合物的混 合物。這些製品中的化合物或化合物的混合物可包括維生素、礦物質、草藥(herbs)或 其它植物和胺基酸。膳食補劑也可以是提取物或濃縮物，並可以以例如片劑、膠囊、軟膠囊 (softgel)、軟膠囊(gelcap)、液體或粉末的許多形式存在。本發明的含色氨酸的組合物和/或溶菌酶也可以被用作營養藥物組合物或用於 營養藥物組合物中，或用於營養藥物的製備中。在本文使用時，術語營養藥物表示在營養和 藥物兩種應用領域中的有用性。根據本發明的營養藥物組合物和/或溶菌酶可以是適合施 用給動物體(包括人體)的任何形式，特別是口服施用的任何常規形式，例如固體形式如食 物或飼料(添加劑/補劑)、食物或飼料預混合物、片劑、丸劑、顆粒、錠劑、膠囊和泡騰劑配製物如粉末和片劑，或是液體形式如溶液、乳劑或懸浮液，例如飲料、糊劑和油性懸浮液。摻 入根據本發明的水解產物的受控(延遲)釋放配製物也構成本發明的部分。另外，可向本 發明的營養藥物組合物中添加多維生素和礦物質補劑，以獲得足量的必需營養素，所述必 需營養素在一些膳食中缺失。多維生素和礦物質補劑也適用於疾病預防，和針對由於生活 模式造成的營養丟失和不足提供保護。在本發明的一個優選的方面，組合物和/或溶菌酶可在例如老年人以及年輕人 (例如準備考試的學生)和例如玩計算機或網路遊戲的人中被用作營養藥物或營養補劑， 例如用於情緒改善或用於改善認知功能如學習、記憶、警覺和機警。如前文所述，根據本發 明的組合物和/或溶菌酶尤其與絕經前和絕經後的女性相關。根據本發明的組合物和/或 溶菌酶還尤其與運動人群相關；具有苛刻的訓練計劃的職業運動員以及娛樂運動人群，如 打網球或高爾夫球的人群。這表示本發明涉及根據本發明的水解產物如上文給出的和作 為「條件改善者」的用途，即在患病或正常的健康個體中作為用於以下的手段降低應激性 和疲勞(最終降低過度訓練的風險)，降低或防止或減輕生理和精神疲勞，保護安穩的睡眠 (即作用於對抗失眠和睡眠病症並改善睡眠)和更籠統地提高能量生產，特別是提高腦能 量生產。另外用於通常的認知改善，特別是用於注意力和精神集中、記憶和記憶能力、學習 能力、語言處理、解決問題和智力功能的維持或改善；用於改善短期以及長期記憶；用於提 高精神機警；用於增強精神警覺；用於減少精神疲勞；用於支持認知健康，用於維持平衡的 認知功能。如果需要獲得具有高Trp/LNAA比例的成本有效的製劑，根據本發明的水解產物 任選地包含游離的色氨酸。附例

圖1.消耗實施例6中詳述的製品後，血漿中摩爾Trp/LNAA比例對時間的函數。 REF =酪蛋白水解產物，ALAC =完整的α-乳白蛋白，Trp =游離色氨酸，WEPS =富含色氨 酸的溶菌酶水解產物，SYN =合成的二肽kr-Trp。圖2.消耗實施例6中詳述的製品後，負面情緒(用情緒狀態類型測試(POMS)測 量)對時間的函數。REF=酪蛋白水解產物，ALAC=完整的α-乳白蛋白，Trp =游離色氨 酸，WEPS =富含色氨酸的溶菌酶水解產物，SYN =合成的二肽kr-Trp。圖3.溶菌酶水解產物的水溶性肽級分的大小分布。使用材料和方法章節中詳述 的測定水解產物中存在的肽和蛋白質分子量分布的方法，分析了根據實施例3中所述方法 製備的溶菌酶水解產物。214nm處的吸光度測量記錄了肽鍵的存在。280nm處的吸光度測 量記錄了色氨酸和酪氨酸芳香族側鏈的存在。因為色氨酸在該波長下具有比酪氨酸高得多 的摩爾吸光係數，所以峰值會主要涉及摻入色氨酸的肽。圖4.實施例9中所述實驗的研究設計流程圖。高壓力易感的志願者；低抗壓 的志願者；hydr 富含Trp的溶菌酶水解產物；安慰劑酪蛋白水解產物。圖5.實施例9中所述實驗的典型研究日的流程圖。飲品消耗含有富含Trp的水 解產物或安慰劑的飲品；血採血用於評價血漿胺基酸水平；表現不可控制的壓力之前和 之後的表現測試；壓力算術任務。圖6.攝食實施例9中所述安慰劑(pic)或溶菌酶水解產物(Trp-hydr)後的血漿 Trp/LNAA比例(ymol/l)。黑色符號壓力易感的受試者；空心符號抗壓的受試者。圖7.如實施例9中所述進行的Mackworth Clock測試的結果。消耗安慰劑(pic ；左側圖)或富含Trp的水解產物(Trp-hydr ；右側圖)之後、算術任務之前(壓力前)或之 後(壓力後)的正確反應數量(垂直軸)。黑色符號壓力易感的受試者；空心符號抗壓 的受試者。因為在獨立的日期中給予不同的幹涉(intervention)製品，所以僅在相同的處 理和日期內的壓力前和壓力後條件之間進行相應的比較。圖8.如實施例9中所述進行的臨界追蹤任務(Critical Tracking Task)的結果。 在攝入安慰劑(Plc)或富含Trp的水解產物(Trp-hydr)後表達λ CT(指出受試者達到的 最終複雜性水平)。黑色符號壓力易感的受試者；空心符號抗壓的受試者。圖9.在酸性ρΗ條件下用胃蛋白酶孵育的乳清蛋白和溶菌酶的SDS-PAGE。第1道原樣的溶菌酶；第2道胃蛋白酶消化後的溶菌酶；第3道原樣的乳清蛋 白；第4道胃蛋白酶消化後的乳清蛋白；第5道原樣的胃蛋白酶。圖10.消耗經水解的溶菌酶(Ρ2Β =菱形)、完整溶菌酶(Lys =方形)和完整溶 菌酶與經水解的溶菌酶的混合物(Mix =三角形)產物後血漿Trp/LNAA比例的動力學。所 有三種處理具有相同的Trp含量。值得注意的是，所有三種產物產生完全相同的「曲線下面 積」值，表明溶菌酶水解產物以及完整的溶菌酶分子被完全消化並攝取進血中。材料和方法材料商品名為「Protex 6L」的枯草桿菌蛋白酶得自Genencor (Leiden，荷蘭)，胃蛋 白酶來自Sigma且胰蛋白酶/糜蛋白酶(Porcine PEM)來自Novozymes (Bagsvaerd，丹 麥)。溶菌酶作為Delvozyme L(22%乾物質)或作為乾燥的Delvozyme G顆粒從DSM Food Specialities (Delft，荷蘭)獲得。酪蛋白水解產物(「REF」)基本上如Edens et al (J Agric Food Chem, 53(20)7950-7957,2005)所述獲得。ffl Protex 6L充分水解酪蛋白酸鈉，將ρΗ降低至4. 5 後，用脯氨酸特異的內切蛋白酶達到DH > 20%。超濾後對滲透物熱處理，以失活任何剩餘 的酶活性，並最終將其噴霧乾燥。完整的α-乳白蛋白(「ALAC」)作為「BiOpUre」(>90% 的 α —乳白蛋白)從 Davisco Foods International, Inc. (Le Seuer，MN)獲得；富含色氛 酸的溶菌酶水解產物(「WEPS」)如實施例4中所述獲得；合成的Ser-Trp 二肽(「SYN」) 如實施例5中所述獲得；純L-色氨酸(「TRP」 )作為L-色氨酸-400從Orthica, Almere, 荷蘭獲得。含色氨酸的多肽(尤其是完整蛋白質)的蛋白酶抗性測試為了測試在人胃中的消化性，在Mc Ilvane緩衝液(0. 2M檸檬酸加Na2HPO4)pH 4. O 中，於37°C下用胃蛋白酶(Sigma ；1% w/w胃蛋白酶比完整蛋白質)將完整蛋白質的5% (w/w)溶液孵育2小時。蛋白酶抗性程度被定義為未受胃蛋白酶孵育影響的蛋白質的百分 比。「未受影響」表示蛋白質的分子量並未由於胃蛋白酶孵育而改變；「蛋白質的百分比」表 示消化後的曲線下面積乘以100，除以消化前的曲線下面積；「曲線下面積」是由使用的定 量分析方法(見下文)提供的，具有初始分子量的蛋白質的面積。根據SDS-PAGE，之後根據 下文指明的流程染色，來比較分子量。將凝膠染色後，使用OptiGo成像系統(Isogen Life Science ；www. isoRen-life-science. com)製備數字圖像，之後使用在 ffindows XP 下運行 的 Totallab TL 100，2006 版軟體(Nonlinear Dynamics Ltd ;www. nonlinear, com)對選擇 的蛋白質條帶進行定量分析。如果在胃蛋白酶孵育後仍然存在多於50 %的具有初始分子量的蛋白質，則所述蛋白質根據本文上下文是蛋白酶抗性的。SDS-PAGE通過SDS-PAGE檢查使用的溶菌酶製劑的純度。用於SDS-PAGE和染色的所有材料 均購自^witrogen (Carload，CA，US)。使用SDS緩衝液根據製造商的說明製備樣品，並使 用MES-SDS緩衝體系根據製造商的說明在12% Bis-Tris凝膠上分離。使用Simply Blue Safe Stain(Collodial Coomassie G250)進行染色。水解前，溶菌酶在凝膠上作為具有約 14kDa分子量的單一條帶出現。LC/MS/MS 分析使用HPLC測定通過本發明的工藝生產的酶蛋白質水解產物中含色氨酸的肽(主 要是二肽或三肽)的存在，所述HPLC使用與P4000泵(Thermo Electron, Breda，荷蘭) 偶聯的離子阱質譜儀(Thermo Electron，Breda，荷蘭)。使用 Inertsil 30DS 3,3ym, 150*2. Imm柱(Varian Belgium，Belgium)，與用於洗脫的Milli Q水(Millipore，Bedford, MA, USA)中0. 甲酸(溶液Α)和乙腈中0. 甲酸(溶液B)的梯度組合，分離形成的肽。 所述梯度從100%溶液A開始，保持10分鐘，在25分鐘內線性化提高至20% B，立即進入初 始條件，並保持15分鐘用於穩定。使用的注射體積為50微升，流速為每分鐘200微升，柱 溫度維持在^°C。注射的樣品的蛋白質濃度約為50微克/毫升。以滯留時間、質子化的分 子為基礎，並通過使用對感興趣的肽專用的MS/MS，使用約30%的最適碰撞能量，鑑定感興 趣的肽。通過使用外標法進行含色氨酸的特異肽的定量。使用四肽VVPP(M = 410. 2)調節MS模式中的最優靈敏度和MS/MS模式中的最優 斷裂(fragmentation)，進行5 μ g/ml的恆量輸注，得到MS模式中的質子化分子和MS/MS模 式中約30%的最優碰撞能量，產生B-離子和Y-離子系列。在LC/MS/MS之前，在室溫和13000rpm下將酶蛋白質水解產物離心10分鐘，並用 濾過Millipore水過濾裝置的去礦質水(MilliQ水)1 100稀釋上清液。胺基酸分析如實施例6或實施例11中所述，通過HPLC根據van Eijk et al (J. Chromatogr. 1993 :620 :143-148)分析血菜中的胺基酸譜。根據如Amino Acid Analysis System of Waters 操作員手冊(Milford MA, USA) 中所述的PicoTag方法進行其它胺基酸分析。為此，將終末樣品乾燥並使用異硫氰酸苯酯 直接衍生化。如所述使用HPLC方法定量存在的經衍生化的胺基酸。因為常規酸水解期間 Trp和Cys被破壞，所以使用特殊的方法定量這兩種胺基酸。為了在水解期間防止Cys降 解，首先使用過氧化氫將該胺基酸氧化為磺基丙氨酸，然後定量。色氨酸的分解以經輕微修 飾的Waters步驟為基礎。在該步驟中，在真空下乾燥肽溶液的小份試樣，然後在1小時期間 於150°C下氮中，在含0.2%色胺的4M甲烷磺酸中水解。使用裝備有Alltech Altima C18 柱和螢光檢測的HPLC直接定量反應產物。水解程度使用快速 OPA 測試(Nielsen, P. M. ；Petersen, D. ；Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. Journal of Food Science 2001, 66,642-646)，監測用多種水解混合物孵育期間獲得的水解程度(DH)。克氏定氮(KjeldahlNitrogen)
通過流動注射分析(Flow Injection Analysis)測量總克氏氮。使用Tecator FIASTAR 5000流動注射體系，在590nm處定量從含蛋白質的溶液中釋放的氨，所述體系裝 備有 TKN Method Cassette 5000-040、具有 SOFIA 軟體的 Pentium 4 計算機，和 Tecator 5027自動採樣器。將對應於本發明動態範圍(0. 5-20mg Ν/1)的樣品量與95-97%硫酸和 Kjeltab 一起置於消化管中，並進行200°C下30分鐘隨後360°C下90分鐘的消化程序。注 射進FIASTAR 5000體系中後，測量氮峰，從中可推理出被測量的蛋白質量。水解產物中存在的肽和蛋白質的分子量分布在自動HPLC體系上完成經蛋白酶處理的蛋白質樣品的肽大小分布分析，所述體 系裝備有高壓泵、能夠注射10-100微升樣品的注射設備，和能夠在214nm監測柱流出物的 UV檢測器。用於該分析的住是用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉pH 7. 0緩衝液平衡的Superdex Peptide HR 10/300GL(Amersham)。注射樣品(典型地為50微升)後，在90分鐘內以.5ml/ min的流速用緩衝液從柱中洗脫多種組分。使用細胞色素C(Mw 13 500Da)、抑肽酶(Mw 6510Da)和四甘氨酸(Mw 246Da)的混合物作為分子量標記物校準該體系。以下的實施例進一步闡述本發明。
實施例實施例1雞卵溶菌酶不被胃蛋白酶或胰蛋白酶/糜蛋白酶中的任何切割為了測試其在人胃腸道中的可消化性，將雞卵溶菌酶與胃蛋白酶以及胰蛋白酶和 糜蛋白酶的混合物體外孵育。兩種孵育均在下述PH條件下進行，所述pH條件是胃(胃蛋 白酶)和十二指腸(胰蛋白酶/糜蛋白酶)中普遍的pH。為此，將5% (w/w)溶菌酶溶液 與酶(1% w/w酶比溶菌酶蛋白質)在37°C下孵育2小時。為了防止進行的蛋白質水解造 成的重大PH改變，孵育在Mc Ilvane緩衝液(0. 2M檸檬酸加上Na2HPO4)中進行。在37°C 水解兩小時後獲得的低DH值(見表1)證明了在模擬胃中和十二指腸與空腸中消化條件的 條件下溶菌酶分子不能被降解，因為可預期成功的蛋白水解導致至少10%的DH值。因此， 存在於完整的雞卵溶菌酶分子中的色氨酸殘基在胃腸道中不會被解離，因此意味著存在於 完整雞卵溶菌酶中的色氨酸分子不能在消耗後不久有助於血漿色氨酸水平。表1 通過胃蛋白酶和胰蛋白酶/糜蛋白酶混合物的溶菌酶水解
酶pH起點pH終點DH起點(％)DH終點(％)胃蛋白酶2.82.42.4胃蛋白酶3.63.2<1胃蛋白酶4.64.3=01.0胰蛋白酶/糜蛋白酶4.64.3< 1胰蛋白酶/糜蛋白酶5.95.5< 1胰蛋白酶/糜蛋白酶7.27.01.3 實施例2
在提高的pH值下，雞卵溶菌酶被枯草桿菌蛋白酶有效切割為了測試非生理pH和酶條件下溶菌酶對酶水解的易感性，在鹼性pH條件下將溶 菌酶溶液與微生物枯草桿菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)體外孵育。為此，在pH 7.0、8.0和9.0 下將5% (w/w)溶菌酶溶液與12.5微升押時^ 6L./克存在的溶菌酶蛋白質一起孵育。 孵育在60°C下進行3小時，使用IMNaOH持續調節pH。孵育產生沒有任何顯著沉澱物的輕 微混濁的溶液。用於失活枯草桿菌蛋白酶活性的加熱步驟後，根據材料和方法章節中所述 方案測量多個孵育的DH值。與生理條件下獲得的結果(見實施例1)相反，使用枯草桿菌 蛋白酶的鹼性孵育導致完全的溶菌酶水解。PH 7. 0孵育得到6. 3的DH，pH 8. 0孵育得到 11. 2的DH，pH 9. 0孵育得到16. 4的DH。反應產物隨後的SDS-PAGE分析表明，整個溶菌酶 分子被降解，即枯草桿菌蛋白酶孵育後沒有殘餘大分子量片段。另外，在Crownpak CR+柱 (Daicel)上對水解產物的HPLC分析揭示了含有色氨酸的肽未發生顯著的外消旋化，即便 是在pH 9. O下長時間加熱後也未發生。實施例3使用ftx)tex水解溶菌酶並鑑定形成的肽使用NaOH將含10% (w/w)純溶菌酶的溶液調節至pH 8. 2，並加熱至52°C。通過 添加25微升I^otex/g存在的蛋白質開始水解。在連續的攪拌下和將pH維持於8. 2時，將 水解持續5. 5小時，得到沒有可見沉澱物的幾乎澄清的溶液。在用於失活ftOtex活性的加 熱步驟後，取樣用於DH分析。溶液的DH顯示幾乎為30%。在IOkDa濾器上超濾經熱處理 的溶液，得到完全澄清的液體。該澄清液體被用於LC/MS分析，用於存在的肽和蛋白質的分 子量分布分析，以及用於離子交換色譜。為了得到存在的肽和蛋白質的分子量分布的印象，如材料和方法章節中所述對澄 清的液體進行分子量分析。獲得的結果(見圖幻清楚地表明幾乎所有摻入帶有芳香族側 鏈的胺基酸(即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)的肽具有低於500kDa的分子量。考慮到這些 胺基酸的高分子量，意味著大部分這些小肽是三肽或二肽。根據材料和方法章節中所述步驟進行LC/MS分析。通過選擇這些含有色氨酸 (「W」)的肽，可以檢測肽 AW、GNW、WIR、NAW、WVA、VAW、AWR、SLGNW 和小量 Wff 和 SRffff。孵育 後水解產物中游離色氨酸的水平被確立為代表少於的存在的總(溶菌酶)色氨酸。因為二肽和三肽容易被腸壁中存在的肽運載體吸收，所以毫無疑問在口服攝入本 發明的溶菌酶水解產物後，這類肽中存在的色氨酸殘基會被快速吸收並導致提高的血漿色 氨酸水平。實施例4提高水解產物的色氨酸含量溶菌酶摻入了驚人的大量鹼性精氨酸和賴氨酸殘基。另外，溶菌酶分子摻入了顯 著量的酸性穀氨酸和天冬氨酸殘基。該數據已被用於設計朝向具有高Trp/LNAA比例的水 解產物的創新和優良的純化途徑。然而，該純化途徑的關鍵需求是，在還含有精氨酸或賴氨 酸殘基或穀氨酸或天冬氨酸殘基任一的肽中，僅出現非常少的色氨酸殘基。如實施例3中 所示，本文使用的特異水解途徑僅產生很少的含有精氨酸殘基的含色氨酸的肽，並且不產 生含有賴氨酸、穀氨酸或天冬氨酸殘基的肽。理論預測，在pH 3左右能夠達到含和不含穀氨酸或天冬氨酸殘基的肽之間的最大電荷差異。在PH 5左右能夠達到含和不含精氨酸或賴氨酸殘基的肽之間的最大電荷差
已為了闡述該途徑的選擇能力，根據實施例3中說明的步驟製備溶菌酶水解產物。 然後使用乙酸將水解產物的pH調節至pH 3. 1，並將約0. 5克蛋白質應用在用20mm檸檬酸 鈉 pH 3. 1 平衡的 SP Sepharose FF (GE Healthcare, Diegem, Belgium)柱的 15ml 柱床體積 上。用一倍柱體積的檸檬酸鈉緩衝液洗滌柱，去除摻有穀氨酸或天冬氨酸的大部分肽後，將 洗脫緩衝液變更為20mm檸檬酸鈉緩衝液pH 5. 1。用三倍體積的後一緩衝液洗滌柱時，洗脫 了一系列含有色氨酸的肽。根據LC/MS分析，二肽AW以及三肽GNW、NAff, WVA、VAff大量存 在，並存在小量戊肽SLGNW。多種pH 5.1級分的胺基酸分析顯示，選擇性合併(selective pooling)產生具有1. 75的分子Trp/LNAA比例的溶液和幾乎30%的色氨酸產率。更少選擇 性的合併產生具有0. 4的分子比例的溶液和70%的色氨酸產率。隨後，用三倍體積的20mM 檸檬酸鈉PH 7. 1洗滌柱。根據LC/MS數據，該步驟洗脫了含精氨酸的肽WIR、AffIR並驚人 地洗脫了肽鼎。用IM NaOH、水和IM乙酸最後洗滌柱製備了用於下一輪的柱。實施例5二肽kr-Trp的化學合成根據標準的肽技術合成二肽義！·-!^)。第一步中，通過碳酸酐方法(J.Am.Chem. Soc. 1967，5012)將 Z-Ser-OH 和 iTrp-OMe 偶聯，產生受保護的二肽 Z-Ser-Trp-OMe。為此， 將Trp-OMe. HCl懸浮於四氫呋喃(THF)中，隨後添加N-甲基嗎啉(NMM)。將混合物攪拌1 小時，隨後添加至Z-Ser在四氫呋喃/ 二甲基醯胺(THF/DMF)中的溶液中。添加NMM的第 二等價物，並將混合物冷卻至-15°C。以下述速率添加氯甲酸異丁酯，所述速率使得內部溫 度不超過_15°C。隨後，將混合物攪拌3小時，允許溫度提高至室溫並通過過濾去除沉澱的 NMM. HCl0將濾液在4°C保持過夜，之後過濾額外的沉澱物並將濾液真空濃縮。通過柱色譜 (SiO2，乙酸乙酯/庚烷)純化殘基。將組合的級分濃縮，用水洗滌去除任何剩餘的DMF並 真空濃縮。在第二步中，使用Alcalase 2. 5L DX (Int. J. Peptide Protein Res. 1990,52)完 成Z-kr-Trp-OMe的酶水解，隨後的催化氫解提供了呈灰白色固體的期望的肽。為此，將純 化的 Z-Ser-Trp-OMe 溶於 tBuOH 禾口水中，添力口 Alcalase 2. 5L DX (Novozymes, Bagsvaerd, 丹麥)。攪拌混合物，直至(幾乎)所有的起始材料被消耗。然後將混合物真空濃縮，並將 殘餘物吸收在PH 7的水中。用乙酸乙酯萃取水性混合物以去除任何剩餘的起始材料，隨後 酸化水相。通過用乙酸乙酯萃取分離期望的產物ZIer-Trp-OH ；將萃取物在硫酸鈉上乾燥 並在真空中濃縮。在第三步中，獲得二肽kr-Trp-ΟΗ。為此將濃縮的ZIer-Trp-OH溶於MeOH和水 (1 1)中，添加Pd/C，在正的氫氣壓Gbar)下攪拌混合物。完成反應後，通過過濾去除催 化劑加上大部分產物，並棄去濾液。用milliQ水充分洗滌濾器，真空乾燥濾液，得到呈白色 到灰白色固體的二肽％1~-1^)-0!1。如下達成額外的純化在丙酮-水的混合物中攪拌產物， 並通過過濾分離肽。這得到了適合口服消耗的產物。實施例6健康志願者中不同色氨酸來源對血漿Trp/LNAA比例和情緒的影響本研究的目的是在健康受試者中研究消耗含不同色氨酸的製劑後血漿Trp/LNAA譜和情緒。測試了以下的製劑-完整的α-乳白蛋白(見材料和方法)-經水解的酪蛋白酸鹽(DH> 20% ；見材料和方法)-具有高Trp/LNAA比例的富含Trp的溶菌酶水解產物(見實施例4)-合成的SW二肽(實施例5)-游離的L-色氨酸(見材料和方法)。十八個健康的學生(9個男性和9個女性年齡18-30歲之間)參與了該研究。參 與的排除標準是慢性病和當前病，精神病或醫學病史，使用藥物或藥品，醇消耗(> 2單位 /天)，代謝疾病、激素-疾病或腸疾病和無規則的膳食或偏離標準的進食習慣(通過健康 和生活方式調查問捲來評價)。參與實驗的受試者在體重指數的正常範圍內(以kg計的 BMI/m2在20-25之間)，女性受試者符合避孕。女性在其卵泡期的中晚期(第4_10天)參 與，而使用避孕手段的女性當她們實際使用避孕藥時參與。參與者是非吸菸者，並且在研究 之前和期間不能使用任何醇。所有參與實驗的受試者籤署徵得同意書anformed Consent Form)。該研究根據 52nd WMA General Assembly，Edinburgh，蘇格蘭，2000 年 10 月所採取 的優良臨床試驗規範(Good Clinical I^ractice，GCP)EC原則進行。指導受試者禁食過夜；只允許不含糖的水和茶。在五個進行實驗的清晨階段，受試 者來到實驗室，攝入含有不同Trp或LNAA濃度的飲品後監測血漿Trp/LNAA濃度和情緒。平 衡多種飲品的出現順序，四個實驗日通過一周的周期間隔開。在每個進行實驗的清晨，提供 含有不同色氨酸CTrp)或LNAA濃度的312ml飲品(表幻。所有的飲品含有0. IOg甜味劑 (乙醯舒泛)並用淨水補充達到3iaiil。由不了解(blind to)膳食條件的助研人員管理不 同飲品的施用。表2 使用的飲品的蛋白質/胺基酸組成
權利要求
1.用於生產含色氨酸的組合物的方法，所述方法包括將如下合在一起-與肽結合的色氨酸組合物和/或游離的色氨酸，所述與肽結合的色氨酸組合物優選 地是水溶性的，並且具有大於0. 1、優選地大於0. 15的Trp/LNAA比例；和-與多肽結合的色氨酸組合物，其優選地是水溶性的，並且具有大於0. 15的Trp/LNAA 比例。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述含色氨酸的肽如下獲得水解溶菌酶或α乳 白蛋白、優選地水解溶菌酶、優選地水解雞卵溶菌酶以製備具有5和45之間DH的水解產 物，並任選地對所述水解產物進行分級、富集或純化。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述組合物包含AW(作為二肽)或GNW(作為 三肽)，優選地包含AW和GNW。
4.根據權利要求1到3中任一項所述的方法，其中所述與多肽結合的色氨酸是溶菌酶。
5.包含色氨酸的組合物，其中10%到90%、優選地20%到80%的色氨酸作為與肽結合 的色氨酸和/或游離色氨酸存在，10%到90%、優選地20%到80%的色氨酸作為與多肽結 合的色氨酸存在。
6.根據權利要求5所述的組合物，其中多於30mo1 %、優選地多於40mo 1 %、更優選地 多於50mol%、進一步更優選地多於60mol%、還要更優選地多於70mol %和最優選地多於 SOmol %的所述與肽結合的色氨酸以二肽或三肽的形式存在。
7.根據權利要求5或6的組合物，其中多於30mo1 %、優選地多於40mo 1 %、更優選地 多於50mol%、進一步更優選地多於60mol%、還要更優選地多於70mol %和最優選地多於 SOmol %的所述與多肽結合的色氨酸作為完整的蛋白質存在，所述蛋白質優選地為溶菌酶。
8.根據權利要求5到7中任一項所述的組合物，所述組合物包含至少一種含色氨酸的 肽，所述含色氨酸的肽優選地是水溶性的，或者其中優選地是水溶性的所述與肽結合的色 氨酸級分具有至少0. 10、優選地至少0. 15、更優選地0. 15和1. 8之間的Trp/LNAA比例。
9.根據權利要求5到8中任一項所述的組合物，其包含AW(作為二肽)或GNW(作為三 肽)，優選地包含AW和GNW。
10.根據權利要求5到9中任一項所述的組合物，其包含至少一種、優選地至少兩種不 同的選自二肽或三肽的含色氨酸的肽，其中選自二肽或三肽的所述含色氨酸的肽(各自) 以佔二肽和三肽總量至少5mol %的量存在。
11.根據權利要求5到10中任一項的組合物，其包含溶菌酶水解產物的、優選地雞卵溶 菌酶水解產物的水溶性級分。
12.根據權利要求5到11中任一項所述的組合物，其能夠通過權利要求1或2的方法 獲得。
13.用作營養藥物、優選地用作藥物的根據權利要求5到12中任一項所述的組合物或 溶菌酶，或根據權利要求5到12中任一項所述的組合物作為營養藥物、優選地作為藥物的 用途，或根據權利要求5到12中任一項的組合物或溶菌酶在製備營養藥物、優選地製備藥 物中的用途，優選地其中所述營養藥物、優選地藥物被用於預防或治療以改善情緒、認知、 食慾、機警、警覺、睡眠開始和品質、抗焦慮作用、抑鬱、情感反應控制或性行為，或者被用作 食物、飼料、膳食補充劑製備中的成分。
14.根據權利要求5到12中任一項的組合物或溶菌酶在15和240分鐘之間、優選地30和240分鐘之間的時間段中，與就在攝入根據權利要求5到12中任一項所述的組合物或 溶菌酶之前或不攝入根據權利要求5到12中任一項所述的組合物或溶菌酶時的血漿Trp/ LNAA比例相比提高血漿Trp/LNAA比例的用途。
全文摘要
本發明涉及包含色氨酸的組合物，其中10％到90％、優選地20％到80％的色氨酸作為游離色氨酸或與肽結合的色氨酸存在，10％到90％、優選地20％到80％的色氨酸作為與多肽結合的色氨酸存在。
文檔編號C12P13/22GK102076228SQ200980125142
公開日2011年5月25日 申請日期2009年4月27日 優先權日2008年4月29日
發明者辛德瑞拉·克裡斯蒂娜·格爾哈德, 魯波·伊第恩斯 申請人:帝斯曼智慧財產權資產管理有限公司