一種cd106陽性細胞、其鑑定、製備方法及應用的製作方法
2023-10-09 06:22:34 1
專利名稱：一種cd106陽性細胞、其鑑定、製備方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞的分離和製備，專利涉及一種具有更強免疫抑制能力的 CD106間充質幹細胞的分離製備辦法。
背景技術：
大量的體內、體外研究表明，間充質幹細胞(mesenchymal stemcell, MSC)能夠直接抑制T細胞的增殖、分化及其效應機制，或者通過抑制樹突細胞(dendritic cell，DC)的分化和成熟，間接抑制T細胞的增殖，以及影響效應T細胞亞群的分化。除了 T淋巴細胞和 DC，MSC的靶細胞還包括眾多其他類型的免疫細胞，如NK細胞(natural killer cell, NK)、 B細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等，調節這些細胞免疫生物學活性，如細胞因子的分泌，細胞毒活性等，最終誘導抗炎效應和/或免疫耐受狀態。目前對MSC的免疫調節機制還不完全清楚，但是普遍認為MSC主要通過細胞間接觸和可溶性因子的分泌發揮免疫抑制功能。
多種可溶性因子參與MSC介導的免疫調節效應，它們可能直接來源於MSC，或者通過MSC和靶細胞交互作用旁分泌產生。目前研究較多的可溶性因子是前列腺素E2 (PGE2) 和人吲哚胺2，3-雙加氧酶(ID0)。MSC組成性表達一種對PGE2合成起關鍵作用的酶，即環氧化酶2 (Cyclooxygenase，COX-2)。MSC和外周血單個核細胞(PBMC)共培養可引起PGE2 的分泌上調，炎性細胞因子幹擾素-Y (IFN- y )和腫瘤壞死因子-a (TNF- a )能提高MSC 釋放PGE2的水平。從受體支氣管肺泡灌洗液中分離的同種異源MSC具有合成PGE2的能力， 體內外可以利用化學抑制劑阻斷PGE2的生成來減輕MSC介導的免疫抑制功能，這些結果表明PGE2是參與MSC免疫調節效應的關鍵分子。MSC不組成性表達ID0，但是靶細胞來源的 IFN-Y可誘導MSC表達IDO。IDO是色氨酸降解為犬尿氨酸過程中的限速酶，而色氨酸是 T細胞增殖所必需的胺基酸，其降解產物的堆積對T細胞增殖有抑制作用，這樣，在IFN-Y 存在下，MSC表達ID0，加速色氨酸的代謝，抑制T淋巴細胞的增殖。其他參與MSC免疫調節的可溶性因子包括轉化生長因子-P I (TGF-^ I)、肝細胞生長因子(HGF)、白細胞介素-10 (IL-10)、白細胞介素-6 (IL-6)、可溶性組織相容性白細胞抗原-G5 (HLA-G5)、一氧化氮 (NO)和半乳糖凝集素-9 (Galectin-I)等,它們可能通過誘導調節性T細胞的生成、影響效應靶細胞的增殖、凋亡以及效應因子的分泌等途徑介導MSC的免疫抑制功能。NO則更多參與小鼠MSC介導的免疫抑制效應。
多種因素影響MSC的免疫調節能力，其中最重要的因素可能是細胞因子微環境。 目前研究發現IFN-Y的分泌可能對MSC的免疫功能起重要作用。高濃度的IFN-Y可提高MSC的免疫抑制能力，導致MSC對NK細胞的抑制效應佔優勢。體外炎性因子如TNF- a 和IFN- y也可引起MSC的C0X-2和PGE2表達上調，通過PGE2依賴的方式抑制免疫應答。 炎性因子作用MSC能上調黏附分子VCAM-I和ICAM-I，有助於MSC與T細胞的黏附，從而發揮其T細胞增殖的抑制功能。可以說，MSC所具備的這種免疫抑制特點使之在醫學上有巨大的應用潛力，可以應用於器官移植中排異反應以及各種自身免疫性疾病的治療等多種情況。然而，常規製備的MSC是一個不均一的幹細胞群體，並非所有的MSC都具備均一的較強免疫抑制能力，其到目前為止，尚未有某種成熟的公開技術能夠從MSC細胞群體中特異性地鑑別並獲取較高免疫抑制能力的細胞群體。
關於間充質幹細胞表達⑶106 (又叫VCAM-I)的報導不一。有報導說骨髓間充質幹細胞表達⑶106陽性，而臍帶、脂肪間充質幹細胞⑶106表達多為陰性或弱陽性。有人認為STR0-1 /⑶106/⑶146均可作為有效分選幹細胞的標記。上述報導是基於其分化能力來說的，如在申請號為200880002860. I的專利中提到用⑶44和⑶106雙陽性分選間充質幹細胞用於形成牙，申請號為200480014698. 7的專利提到⑶106陽性分選間充質前體細胞可以分化成血管和牙本質等。Ren等在免疫學雜誌(Journal of Immunology, 2010 ;184:2321-8)發表的文章中指出，炎症因子可以上調ICAM-I和VCAM-I增強免疫抑制效果， 用IFN-Y能刺激間充質幹細胞增加VCAM-I表達，但這同時也會增加HLA-DR的表達。本發明中，我們比較研究了 CD106陽性和陰性的間充質幹細胞的成骨和成脂分化能力，發現沒有明顯的差異，但發現了 CD106陽性的間充質幹細胞具有更強的抑制淋巴細胞分泌IFN-Y 的能力，表達更高的水平的C0X2和HGF。進一步，我們發現CD106陽性的間充質幹細胞不表達HLA-DR。基於這些研究發現，本發明建立一種⑶106陽性間充質幹細胞亞群的鑑定、製備方法，用於鑑別人體內間充質幹細胞的免疫調節水平、製備可以治療移植物抗宿主病和自身免疫性疾病的高免疫抑制活性間充質幹細胞製劑。發明內容
針對現有技術中所存在的缺乏有效鑑定和分選高免疫抑制能力的間充質幹細胞的方法的技術缺陷，本發明提供如下的解決方案。
利用發明人所發現的CD106陽性細胞的生物學特徵，通過免疫學的方法鑑定並分離出CD106陽性的間充質幹細胞，該幹細胞亞群即具備了相對均一的高免疫抑制能力。具體來說是採用流式細胞儀或免疫磁珠進行純化間充質幹細胞中的CD106陽性細胞，並進行擴增操作。
本發明的操作步驟概括如下(I)從組織中分離出的單個核細胞分離出CD106陽性細胞，再進行貼壁培養操作，獲取貼壁的⑶106陽性細胞；(2 )或將從組織中分離出的單個核細胞貼壁培養操作，獲取貼壁的間充質細胞，在獲得足夠的細胞時，再分離出其中CD106陽性細胞；根據上述方法，我們達到了以下效果(I)我們可以得到大量CD106陽性間充質幹細胞；(2)得到了具有更強的抑制淋巴細胞增殖和分泌IFN-Y的活性間充質幹細胞，可以用於自身免疫系統疾病的治療。
目前我們檢測了成人骨髓、成人脂肪、羊膜、胎盤絨毛膜和臍帶來源的細胞，其中成人骨髓、胎盤絨毛膜來源間充質幹細胞表達較高水平的CD106。
我們認為CD106陽性的間充質幹細胞是一種活化型的間充質幹細胞，在骨髓和絨毛膜出現更多的活化型間充質幹細胞是為了更好的抑制免疫反應，維持造血環境穩定和避免胎兒被母體排異。一些炎症因子能刺激CD106陰性間充質幹細胞表達CD106，但我們認為這是一過性的活化，因為實驗發現撤除炎症因子後間充質幹細胞的CD106很快就恢復到陰性。
圖I :胎盤組織中⑶106+細胞比例，橫坐標為⑶106 PE的螢光強度，縱坐標為SSC (側向角);圖2 :CD106+細胞形態，其呈典型的成纖維樣細胞形態；圖3 :⑶106+細胞流式表型；圖4 CD106+細胞成脂和成骨分化；成脂分化用油紅0染色，成骨分化用茜素紅染色； 圖5 :⑶106+細胞和⑶106—細胞C0X2和HGF mRNA表達比較，縱坐標分別為C0X2和HGF mRNA的相對表達量；圖6 :⑶106+細胞和⑶106_細胞PGE2和HGF表達比較，縱坐標分別為PGE2和HGF的濃度，單位為納克/毫升(ng/ml)；圖I :⑶106+細胞抑制PHA刺激的淋巴細胞分泌IFN- y，橫坐標為PBMC用PHA刺激組、 ⑶106陰性間充質幹細胞與PHA刺激的PBMC共培養組、⑶106陽性間充質幹細胞與PHA刺激的PBMC共培養組，縱坐標為各組相對PBMC用PHA刺激組的IFN- y表達量；圖8 :治療組和GVHD組的動物生存曲線。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發明作進一步的詳細描述。
實施例I :胎盤來源細胞的分離和其中CD106陽性細胞的獲取及擴增培養。
I.胎盤的採集，在產婦知情同意的情況採集胎盤。用無菌生理鹽水衝洗胎盤，然後將胎盤裝入專用的無菌採集盒中，並加入採集液。隨後將胎盤4°C運輸到實驗地點，胎盤不超過48小時。
2.胎盤絨毛膜組織間充質幹細胞的分離(1)用機械的方法分離出絨毛膜組織；(2)將組織剪碎至0. 1-1立方釐米，然後用磷酸鹽溶液反覆衝洗組織塊5次以上，使組織塊無明顯的血凝塊及其它雜物；(3)按照與組織體積比1:1的比例加入膠原酶和胰酶的混合物，37°C恆溫消化60分鐘；(4)通過200目濾網獲得單細胞懸液，離心，去掉上清；(5)用 DF12培養基重懸細胞。
3. 0)106陽性細胞的分選按stem cell公司EasySep 正選人PE標記細胞的試劑盒(貨號18551)的方法進行，先用藻紅蛋白(PE)標記的⑶106抗體標記上述細胞，再用標記有磁珠的抗PE抗體與上述細胞孵育，按試劑盒的方法獲得CD106陽性細胞。
4.⑶106陽性間充質幹細胞的獲得，將第3步獲得的細胞用含10%體積比的胎牛血清的DF12培養基重懸，並接種到培養瓶中，每3天換液一次，等細胞融合度達到80-90% 時將細胞用質量比0. 25%胰酶消化後按1:3傳代培養，將細胞擴增到所需的數量後進行凍存或使用。
5.流式細胞儀分析間充質幹細胞中CD106陽性細胞的比例及間充質幹細胞相關標記(⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166)的檢測。將分離後的細胞按每個樣本2X IO5 細胞分管，按專業人士熟知的方法使用抗體標記後，用磷酸鹽緩衝液(PBS)重懸到400 u L 裝入流式管。用BD公司FACSCalibur流式細胞分析儀檢測、分析。
6.成骨、成脂分化以4X IO4細胞/孔接種於6孔板內。培養24小時後細胞貼壁，棄去培養液。
成脂誘導體系(MDM培養基、10% FBS、10-6M地塞米松、0. 5 mM 3-異丁基-I-甲基黃嘌呤、10 yl/ml胰島素、60 UM吲哚美辛、2 u M/ml L-穀氨醯胺)繼續培養。每3天換液I次，共誘導21天。棄掉培養液，PBS洗2次，10%甲醛固定30分鐘。PBS再洗3次。 加入0.2%油紅0染液，37°C染色30分鐘。吸出染液回收，PBS洗3次。顯微鏡下觀察並照相。
成骨誘導體系(MDM培養基、10% FBS、10-7M地塞米松、0. 2 mM 2-磷酸抗壞血酸、 10 mM ￠-磷酸甘油、2 u M/ml L-穀氨醯胺和100 U/ml青黴素/鏈黴素)繼續培養。每3 天換液I次，共誘導14-21天。培養21天，棄培養液，PBS洗2次。甲醇丙酮(I: I)室溫固定10分鐘，PBS洗3次。加入0.5%茜素紅，37°C染色30分鐘，棄染液，PBS洗3次。顯微鏡下觀察並照相。
結果我們分離的胎盤組織原代細胞中有0. 36%的⑶106陽性細胞(見圖1)，分離的CD106陽性細胞經過貼壁培養，獲得間充質幹細胞，具有成纖維細胞形態(見圖2);通過流式檢測⑶106陽性細胞比例為94%，⑶29、⑶44、⑶73、⑶90、⑶105、⑶166的陽性率均在 99%以上(見圖3)。誘導分化鑑定所獲得CD106陽性細胞具有向成骨、成脂的分化能力(見圖4)。
實施例2 CD106陽性間充質幹細胞的分選。
將擴增後的間充質幹細胞，通過使用專業人士都熟知的磁珠分選方法，從胎盤來源細胞分理出⑶106陽性細胞。
結果通過磁珠分選後，獲得的⑶106陽性細胞純度為97. 91%。
實施例3 :⑶106陽性間充質幹細胞表達更高的C0X2/PGE2、HGF。
將CD106陽性間充質幹細胞與CD106陰性間充質幹細胞分別擴增到所需數量， 吸取培養上清留用，再用專業人士所熟知的方法提取上述兩種細胞的mRNA，並逆轉錄成 cDNA，用定量聚合酶鏈反應(rt-PCR)比較兩種細胞C0X2和HGF的mRNA表達量。
將上步留用的培養上清用專業人數熟知的酶聯免疫吸附法(ELISA)分別檢測其中 PGE2和HGF的含量。
結果⑶106+間充質幹細胞比⑶106-間充質幹細胞表達更高水平的C0X2和HGF mRNA (見圖5)，⑶106+間充質幹細胞比⑶106_間充質幹細胞表達更高水平的PGE2和HGF (見圖6)。
實施例4 :⑶106陽性間充質幹細胞抑制PHA刺激的淋巴細胞分泌IFN- y。
I.分別收集正常培養的CD106+MSC和CD106—MSC，鈷60照射後計數。用含10%FBS 的RPMI 1640培養液懸浮後種植於平底96孔細胞培養板，按IO4個/孔分組，每組設3個復孔，於37°C、5%C02，飽和溼度培養箱內用普通培養基培養24h。
2.無菌條件下取健康成人靜脈血5ml，肝素抗凝，Ficoll分離PBMC並計數，將細胞重懸於含10%FBS的RPMI 1640培養液中，計數並將濃度調節為2X 106/mL。
3.將PBMC接種於前述96孔細胞培養板，與MSC進行共培養。每孔中IO5個細胞， 同時加入10ug/mlPHA。
4.用RPMI 1640培養液將每孔體積調整為200ul，37°C、5%C02，飽和溼度培養箱內用普通培養基培養72h後收集各個組的上清，用ELISA檢測每組培養上清的IFN- y濃度。
結果⑶106+和⑶106—間充質幹細胞均能明顯抑制PHA刺激的淋巴細胞分泌 IFN-Y，而⑶106+間充質幹細胞的抑制效果明顯好於⑶106—間充質幹細胞(p < 0. 01)(見圖7)。
實施例5 CD106陽性間充質幹細胞治療小鼠移植物抗宿主病(GVHD)。
I. BAL B/c小鼠急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型的建立I.I造模前BAL B/c小鼠用60Co y射線照射清髓小鼠以60Co y射線致死量全身輻照(照射劑量為lO.OGy)。運輸時全部小鼠裝在無菌包裝盒中，照射前於超淨間內將小鼠轉移到專用的小鼠鉛盒中，保證小鼠不被汙染。
I. 2 C57BL/6供體小鼠骨髓細胞(BMC)的製備(每隻動物約可取4-6 X IO7BMC): 小鼠斷髓處死，置於75%酒精中浸泡5分鐘，無菌條件下取小鼠股骨、脛腓骨，反覆衝洗骨髓，過濾，製成單細胞懸液；室溫IOOOrpm離心5分鐘，用無菌的PBS洗2次；以臺盼藍染色法進行活細胞計數，細胞活性率在99%以上；調節細胞濃度為I X 108/ml，室溫放置備用。
1.3 C57BL/6供體小鼠脾臟細胞(SC)的製備(每隻動物約可取5-20X 107SC):小鼠斷髓處死，置於75%酒精中浸泡5分鐘，無菌條件下取脾臟，置200目不鏽鋼濾網中研磨， RPMI1640衝洗，製成單細胞懸液；室溫IOOOrpm離心5分鐘，洗2次；以臺盼藍染色法進行活細胞計數，細胞活性率在99%以上；調節細胞濃度為I X 108/ml，室溫放置備用。
1.4建立aGVHD模型製備好的BMC和SC懸液，以I : I混合，即BMC取0. Iml，SC 取0. 1ml，尾靜脈輸注給經過照射的BAL B/c受體小鼠，輸注細胞量為2.0X107個/只小鼠， 總體積0. 2ml。
2. MSC 用於治療 aGVHD傳代培養的CD1061SC和CD10611SC，消化、計數；用含有33單位/ml低分子肝素鈣的生理鹽水調整細胞濃度為I. OX 107/ml，共I. 5ml ;按照0. Iml/只動物的劑量，給予小鼠尾靜脈輸注；給藥時間為造模後第3天和第6給兩個治療組輸注MSC。對照GVHD組則注射同體積含有33單位/ml低分子肝素鈣的生理鹽水。
3.療效的評價採用生存率為評價指標每天觀察並記錄各組動物的存活狀況，用於動物生存曲線的繪製以評價模型與治療效果。
結果小鼠aGVHD模型用⑶106+細胞和⑶106_細胞治療後的生存曲線(見圖8)。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種幹細胞亞群的鑑定方法，其特徵是，利用技術手段鑑定表面標誌物CD106為陽性的細胞。
2.如權利要求I所述的鑑定方法，其特徵是，所述鑑定表面標誌物CD106的技術手段是免疫學方法。
3.如權利要求2所述的鑑定方法，其特徵是，所述免疫學方法是流式細胞技術。
4.如權利要求1-3所述的鑑定方法，其特徵是所述CD106陽性細胞為間充質幹細胞。
5.如權利要求4所述的鑑定方法，其特徵是所述間充質幹細胞為人間充質幹細胞。
6.如權利要求5所述的鑑定方法，其特徵是所述人間充質幹細胞的來源包括人胎盤組織及骨髓組織。
7.如權利要求6所述的鑑定方法，其特徵是所述人間充質幹細胞的來源為人胎盤組織。
8.如權利要求1-3、5-7所述的鑑定方法，用於鑑定分離相對於天然狀態下的間充質幹細胞具備更強免疫抑制能力的間充質幹細胞亞群。
9.一種CD106陽性細胞的製備方法，其特徵是採用技術手段將利用權利要求1-3、5-7 所述鑑定方法鑑定的CD106陽性細胞亞群由天然組織中分離。
10.如權利要求4所述的分離方法，其特徵是所述技術手段為免疫學方法。
11.如權利要求5所述的分離方法，其特徵是所述免疫學方法包括流式細胞儀分選、免疫磁珠分離。
12.—種CD106陽性細胞，其特徵是由權利要求9所述的製備方法製備的。
13.如權利要求12所述的⑶106陽性細胞，其特徵是表達細胞表面標記還包括⑶29、 CD44、CD73、CD90、CD105、CD166。
14.根據權利要求12所述的CD106陽性細胞，其特徵是所述CD106陽性細胞為間充質幹細胞，具有成骨、成脂分化能力。
15.根據權利要求12所述的CD106陽性細胞，其特徵是所述CD106陽性間充質幹細胞與CD106陰性間充質幹細胞相比，表達更高的前列腺素E2 (PGE2)和HGF，具有更強的免疫抑制作用和促血管新生功能。
16.根據權利要求12-15所述的CD106陽性細胞，其在人體骨髓細胞中的數量可以反映體內免疫調控水平的高低。
17.根據權利要求12-15所述的CD106陽性細胞，可以用於製備治療GVHD和自身免疫系統疾病的藥物。
18.一種分離人間充質幹細胞亞群的方法，包括以下步驟從組織原代分離出的單個核細胞分離出CD106陽性細胞，再進行貼壁培養操作，獲取貼壁的⑶106陽性細胞；或將從組織原代分離出的單個核細胞貼壁培養操作，獲取貼壁的間充質細胞，在獲得足夠的細胞時，再分離出其中CD106陽性細胞。
全文摘要
本發明公布了一種CD106陽性間充質幹細胞的鑑定、製備方法及其應用。通過免疫學的手段從骨髓或胎盤等組織分離出的單個核細胞鑑定並分離出CD106陽性細胞，再進行貼壁培養操作，獲取貼壁的CD106陽性細胞；或將骨髓或胎盤等組織分離出的單個核細胞貼壁培養操作，獲取貼壁的間充質細胞，在獲得足夠的細胞時，再分離出其中CD106陽性的間充質幹細胞。這些CD106陽性為間充質幹細胞，貼壁生長，表達間充質幹細胞相關免疫表型，具有成骨、成脂等分化能力。與CD106陰性間充質幹細胞相比具有更強的免疫抑制能力，可以更好的抑制淋巴細胞增殖和分泌IFN-γ，可以用於GVHD和自身免疫系統疾病的治療。
文檔編號G01N33/53GK102539736SQ20111042254
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月16日 優先權日2011年12月16日
發明者韓忠朝 申請人:北京漢氏聯合生物技術有限公司