用於治療或預防尼古丁成癮的半抗原－載體偶聯物的製作方法

2023-10-10 01:16:24 4

專利名稱：用於治療或預防尼古丁成癮的半抗原－載體偶聯物的製作方法
技術領域：
本發明涉及治療和預防尼古丁成癮。具體說，本發明涉及新穎的半抗原-載體偶聯物，它能誘導產生抗體。這些抗體能特異性結合尼古丁。另外，本發明涉及通過給予藥學上可接受的半抗原-載體偶聯物製劑，預防或治療尼古丁成癮。本發明還考慮用對該半抗原-載體偶聯物應答反應產生的抗體來預防和治療尼古丁成癮。
背景技術：
在美國和世界範圍吸菸、吸雪茄和菸斗是普遍存在的問題。發煙的菸草和無煙的菸草都富含尼古丁，尼古丁是一種已知的成癮物質。尼古丁是從菸草植物所衍生的生物鹼，引起吸菸者的精神和成癮作用。尼古丁是由以下兩個環通過一單鍵連接而形成的芳族六元環(吡啶)和脂族五元環(吡咯烷)。吡咯烷是N-甲基化的，通過它的-2碳連接於吡啶的-3碳。所以，-2碳是手性碳，且假設可環繞連接兩個環的單鍵自由旋轉。已確定-2碳的絕對構型為S型。所以，尼古丁的天然構型是(S)-(-)-尼古丁。
由於不難得到香菸、雪茄、菸斗、和無煙菸草所以尼古丁得到廣泛使用。按照美國衛生和個人服務部的報導，吸菸是導致美國可預防死亡的唯一首要原因。同樣可見McGinnis等人，J.Am.Med.Assoc.270，2207-2211(1993)。還已報導，暴露於二次吸菸會產生嚴重的有害的健康影響，包括哮喘加劇。
雖然眾所周知尼古丁的天然上癮性，但吸菸依舊流行。吸一支煙10-15分鐘內血液中尼古丁的最高水平將到達約25-50毫微克/ml。對人而言，吸一支煙將導致動脈尼古丁的含量比靜脈尼古丁的含量高10倍，因為尼古丁迅速地由肺傳遞到心臟(見Henningfield(1993)，藥物酒精的依賴，3323-29)。這將導致高動脈濃度的尼古丁被迅速送遞到腦。一旦尼古丁穿過血-腦屏障，有證據表明尼古丁能結合膽鹼能受體，而這通常是由神經傳遞介質乙醯膽鹼完成的，乙醯膽鹼參與呼吸、心率的維持、記憶、警覺和肌肉運動。當尼古丁結合這些受體後，通過引發其他神經傳遞介質(如多巴胺)的釋放，將影響腦的正常功能。多巴胺見於腦中參與情緒、促動和快感的區域。神經傳遞介質的釋放，尤其是多巴胺，造成吸菸者對尼古丁成癮或其他攝取尼古丁。
由於吸菸對健康有明顯的不良作用，吸菸者常常試圖戒菸。但尼古丁的天然成癮性和香菸的易得，增加繼續對尼古丁的依賴和嘗試戒菸人的高失敗率。戒菸的症狀令人不快，吸菸可減輕。
已開發了許多治療尼古丁成癮的方法，但大部分都無效。兩種最流行的治療方法仍然是尼古丁透皮貼片和將尼古丁摻入咀嚼口香糖中。這些治療方法(稱為「尼古丁代替療法」)替代了使用者原先從吸菸中接受的尼古丁的量，起到讓使用者戒斷尼古丁的作用。但這種類型的治療存在一些缺點。具體地說，依舊有低濃度的尼古丁滲入血流，從而增加對吸菸的渴望。諸如口腔刺激、頜部潰瘍、噁心等問題一直與使用尼古丁咀嚼口香糖相關。諸如皮膚刺激、幹擾睡眠和神經過敏等問題一直與使用尼古丁透皮貼片相關。
所以，需要另外的方法來治療尼古丁成癮。文獻已認識到這種需要，且已有許多嘗試來提供治療尼古丁成癮的方法。其中一種方法涉及給予對尼古丁應答而產生的抗體。然而已知低分子量物質(稱為半抗原)不能觸發宿主動物的免疫應答。尼古丁也不例外，作為小分子它沒有免疫原性。為了引發對半抗原的抗體，通常將半抗原共價結合於一載體蛋白質，這種複合物會引發識別半抗原的抗體產生。
例如4』-羧酸可替寧，當共價結合於匙孔血藍蛋白(KLH)時，可用於產生抗尼古丁代謝物可替寧的抗體。這些抗體可用於測定生理性液體中可替寧的存在。見Bjerke等人，J.Immunol.Methods，96239-246(1987)。
Castro等人(Eur.J.Biochem.，104，331-340，(1980))製備了其他尼古丁抗體。Castro等人製備了通過尼古丁6-位外的接頭偶聯載體蛋白質的尼古丁半抗原(偶聯於牛血清白蛋白(BSA))。Castro等人製備了其他尼古丁BSA偶聯物，將它們注射入哺乳動物產生了抗體。在其他出版物中，Castro等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.67，583-589(1975)公開了兩種尼古丁白蛋白偶聯物N-琥珀醯-6-氨基-(±)-尼古丁-BSA和6-(σ-氨基癸醯胺)-(±)-尼古丁-BSA。在該1975出版物中，Castro等人還使用尼古丁載體偶聯物(6-(σ-氨基癸醯胺)-(±)-尼古丁-BSA)的抗體來測定血液和尿中尼古丁的水平，見Res.Commun Chem.Path.Pharm.51，393-404(1986)。
Swain等人(WO98/14216)公開了尼古丁載體偶聯物，其中半抗原偶聯於尼古丁的1、2、4、5、6、或1』位。Hieda等人顯示了用連接於匙孔血藍蛋白的6-(羧甲基脲基)-(±)-尼古丁免疫接種動物，能產生尼古丁特異性抗體。J.Pharm.andExper.Thera.283，1076-1081(1997)。Langone等人製備了半抗原衍生物，O-琥珀醯基-3』-羥甲基-尼古丁，見Biochemistry，12，5025-5030，在放射免疫試驗中使用了此半抗原載體偶聯物的抗體。見「酶學方法」，84，628-635(1982)。Langone產生的偶聯物易水解。另外，Abad等人，Anal.Chem.，65，3227-3231(1993)描述了在ELISA試驗中將半琥珀酸3』-(羥甲基)尼古丁偶聯於牛血清白蛋白，產生針對尼古丁的抗體，以能夠測量香菸的煙凝結物中的尼古丁含量。
所以本領域先前未說明一種穩定的保存尼古丁半抗原手性特性的尼古丁-載體偶聯物，該偶聯物以保留尼古丁表位特性的方式將半抗原連接於載體。另外，本領域尚未說明或提議用這種偶聯物預防和治療尼古丁成癮的方法。Seeman，Heterocycles，22，165-193(1984)公開了尼古丁的構型分析和化學反應性研究的結果。

發明內容
為了回答對更有效地治療尼古丁成癮的方法的需求，本發明的目的是提供穩定的新穎尼古丁-載體偶聯物，其含有天然(s)-(-)形式的尼古丁，並用尼古丁-載體連接保留尼古丁表位的特性和尼古丁分子兩個環的相對取向。認為尼古丁的兩個環和它們的相對取向是在溶液中被尼古丁抗體識別的基礎。這種偶聯物能刺激抗體(能特異性結合尼古丁)的產生。用本發明的偶聯物，發明者提高了哺乳動物血清中尼古丁的水平，降低了腦中尼古丁的水平。另外，用本發明的偶聯物，發明者還預防了尼古丁引起的血壓變化和運動影響。
本發明的另一目的是通過給予尼古丁成癮患者本發明的偶聯物，在患者體中產生抗尼古丁的抗體，來治療尼古丁成癮。從而當患者吸菸(或咀嚼菸草)時，這些產品中的尼古丁將與血流中的抗尼古丁抗體結合，從而防止尼古丁穿過血-腦屏障，而消除尼古丁引起的腦化學成分的變化(尼古丁成癮的原因)。從這點來看，尼古丁-載體偶聯物引發抗體的產生是非常重要的，該抗體能識別天然尼古丁分子。如上所述，本發明的新穎尼古丁-載體偶聯物保留了天然尼古丁的手性和表位。
關於尼古丁偶聯物和對這種偶聯物應答反應中產生的抗體如何抑制被哺乳動物吸收的尼古丁的作用，本發明並不受任何具體理論的限制。另外，除了防止尼古丁透過血腦屏障，通過簡單的立體封阻，抗體還可防止尼古丁與周圍神經系統的其他受體結合。
通過提供下式(I)半抗原-載體偶聯物實現這些目的 式中m是1-2500，n是0-12，y為1-12，X選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；Y選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S，且-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接於3』、4』或5』位。在半抗原-載體偶聯物的一優選實施例中，m是11-17，n是1，y為2，X是NH-CO，Y是CO-NH，載體蛋白質是外蛋白質(exoprotein)A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分結合於3』位。在半抗原-載體偶聯物的另一優選實施例中，m是11-17，n是1，y是2，X為NH-CO，Y是CO-NH，載體蛋白質是外蛋白質A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接於4』位。在半抗原-載體偶聯物的另一優選實施例中，m為11-17，n為1，y是2，X是NH-CO、Y是CO-NH，載體蛋白質是外蛋白質A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接於5』位。在另一優選的實例中，m選自1-20和1-200。
上述目的可通過提供式(III)的半抗原-載體偶聯物實現 式中n為0-12，j為1-1000，k是1-20，E是含胺基酸的基質(matrix)。在一優選實例中，基質是聚-L-穀氨酸。
這些目的還可通過提供對式(I)半抗原-載體偶聯物應答反應時產生的抗體來實現。在其他實施例中，抗體是功能片段。在一優選實例中，抗體是單克隆抗體。在本發明的另一優選實例中，抗體是多克隆的。
這些目的還可通過提供對式(III)半抗原-載體偶聯物應答反應時產生的抗體來實現。在另一實施例中，抗體是功能片段。在一優選實例中，抗體是單克隆抗體。在本發明的另一優選實例中，抗體是多克隆的。
這些目的可通過提供治療或預防尼古丁成癮的方法而實現，包括對需要這種治療的患者給予治療有效劑量的式(I)或(III)的半抗原-載體偶聯物。或者，這些目的可通過提供治療或預防尼古丁成癮的方法而實現，包括對需要這種治療的患者給予治療有效劑量的對式(I)或(III)半抗原-載體偶聯物應答反應中產生的抗體。
另外，通過提供含有式(I)或式(III)的半抗原載體偶聯物的疫苗組合物可實現這些目的。這種疫苗還可含有其他治療尼古丁成癮的治療性化合物。
這些目的還可通過提供產生抗體的方法而實現，包括用式(I)或(III)的半抗原-載體偶聯物免疫接種宿主哺乳動物。在一優選實施例中，產生的抗體是單克隆抗體。在另一實施例中，抗體是多克隆的。
另外，這些目的的實現還通過提供一種測定樣品中是否存在尼古丁的試劑盒，所述的試劑盒包括對式(I)或式(III)半抗原-載體偶聯物應答反應中產生的抗體。
這些目的和其他方面通過本發明下面的詳細描述和權利要求書的描述，對本領域技術人員而言是顯而易見的可實現的。


圖1的圖表顯示了用3』AMNic-Suc-rEPA偶聯疫苗主動免疫，在單劑量注射尼古丁後，對大鼠尼古丁血清水平的影響。顯示了注射尼古丁後3和10分鐘，尼古丁血清水平。
圖2顯示了用抗3』-AMNic-Suc-rEPA抗體被動免疫對大鼠血流和腦尼古丁水平的影響。用12.5、25和50mg抗體處理大鼠。
圖3顯示了用抗3』-AMNic-Suc-rEPA抗體被動免疫對大鼠血流和腦尼古丁水平的影響。在給予抗體後30分鐘和1天以及注射尼古丁後3分鐘測定尼古丁水平。
圖4顯示了用抗3』-AMNic-Suc-rEPA抗體被動免疫對接受多個劑量尼古丁大鼠的血清尼古丁水平的影響。
圖5顯示了用抗3』-AMNic-Suc-rEPA抗體被動免疫對接受多個劑量尼古丁大鼠的腦尼古丁水平的影響。
圖6顯示了用抗3』-AMNic-Suc-rEPA抗體被動免疫對大鼠中尼古丁引起的運動的影響。
圖7顯示了用抗3』-AMNic-Suc-rEPA抗體被動免疫，對尼古丁引起的收縮期血壓增加的影響。該圖顯示隨著抗體量的增加，將提高抗體減少尼古丁增加血壓的效果。
具體實施例方式
本發明提供用於治療尼古丁成癮的尼古丁半抗原-載體偶聯物。該尼古丁半抗原-載體偶聯物為式(I) 式中m是1-2,500；n是0-12；y為1-12；X選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；Y選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；載體蛋白質是適當的免疫原性蛋白質或多肽。優選的載體蛋白質可含有T-細胞表位，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接於尼古丁分子的3』、4』或5』位。
在式(I)中，m較佳地為1-200。在另一優選實施例中，m是1-20。在一優選實施例中，m是11-17。在另一優選實施例中，X選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH和CO-NH-NH-CO。
如果m大於1，則方框中的部分以m次附著於載體蛋白質中的不同附著點。例如，若m＝2，則式(I)將是
因為對尼古丁本身的應答反應中不能產生抗體，本發明已開發了自尼古丁3』、4』或5』位衍生的尼古丁半抗原。將該分子結合於載體蛋白質，得到半抗原載體偶聯物，當把它注射入適合的宿主哺乳動物時，能產生抗尼古丁分子的抗體。就此而言，當給予哺乳動物時，為了含有半抗原載體偶聯物的藥物組合物能引發抗體的產生，載體蛋白質必需是免疫原性的。較佳地，它含有T-細胞表位。所以，當載體蛋白質偶聯於尼古丁半抗原，隨後給予哺乳動物時，哺乳動物在對尼古丁半抗原的應答反應中產生或「引發(raise)」了抗體。
半抗原和衍生化本發明所用的術語「半抗原」指一類低分子量化合物，它們本身不能引發免疫應答，但一旦附著於載體分子就能引發免疫應答。在一優選實例中，半抗原通過接頭附著於載體。本發明的半抗原是尼古丁衍生物。此尼古丁半抗原含有反應性官能基團，載體可直接或通過接頭或通過基質或通過接頭和基質連接於此官能團。較佳地，此尼古丁半抗原通過醯胺鍵或二硫鍵連接於載體蛋白質。醯胺鍵和二硫鍵具有理想的穩定性。因為本發明的半抗原-載體偶聯物要作為疫苗使用，所以重要的是該偶聯物必需是穩定的，以延長疫苗的保質期。
在本發明的一優選實施例中，以下式(II)表示尼古丁半抗原 式中n是0-12，Z是NH2、COOH、CHO或SH，且-(CH2)m-Z連接於3』、4』或5』位。Z部分能直接或通過接頭連接於載體。一旦將其引入患者或動物的體內，載體-半抗原偶聯物可誘導抗體的產生。
在一優選實例中，尼古丁半抗原為下式(3』-氨甲基尼古丁) 1.直接偶聯物為了產生「直接偶聯物」，用或不用接頭直接將單個尼古丁半抗原附著於載體。例如，可將單個尼古丁半抗原連接於載體上的各個可用的胺基。用同型功能交聯劑或異型雙功能交聯劑，直接將半抗原偶聯於載體蛋白質的通用方法的描述見，如G.T.Hermanson，「生物偶聯技術」，Academic Press(1996)，和Dick和Beurret，「偶聯疫苗」，Contribu.Microbiol.Immunol.，Karger，Basal(1989)第10卷，48-114。使用雙功能交聯劑的直接偶聯，半抗原與蛋白質的摩爾比受到蛋白質上具有的特異性偶聯化學結構的官能團數量的限制。例如，含有n個賴氨酸的載體蛋白質，理論上講，有n+1個伯胺(包括末端氨基)可用於與接頭的羧基反應。因此，採用這種直接偶聯方法產生的產物限於形成n+1個醯胺鍵，即最多可附著n+1個半抗原。
本領域技術人員可認識到，取決於將尼古丁半抗原偶聯於載體蛋白質所用的試劑的濃度和載體蛋白質的性質，半抗原與載體的比例可變化。同樣，在確定的尼古丁-載體偶聯物製備中，各個偶聯物的半抗原/載體的比例也可變。例如，理論上外蛋白質A具有15個可偶聯於半抗原的胺。但發明者測定到當將3』氨甲基-琥珀醯基-尼古丁偶聯於此蛋白質時，在每次製備偶聯物時，範圍為11-17個尼古丁半抗原結合於每個外蛋白質A載體。這個範圍是用氣相過濾層析試驗測定的，且測到260nmUV吸光度增加。17個尼古丁結合於一些載體，因為尼古丁半抗原能與載體上的非胺基部分結合。半抗原可結合的非胺基基團例子包括(但不限制於)-SH和-OH。但這些副反應的發生率是低的。
2.基質偶聯物為了迴避使用直接偶聯法對可結合於載體的半抗原數量的限制，可使用胺基酸「基質」。術語「基質」指胺基酸、肽、二肽或多肽，包括寡聚多肽和聚多肽。基質也可以是線性或分支多肽。可用於形成基質的胺基酸例子包括(但不限制於)天冬氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和L-穀氨酸。可將這些胺基酸製成聚合物，如聚-L-穀氨酸。當使用胺基酸(如半胱氨酸)時，硫羥基被保護，從而使半抗原能結合於胺基酸的羧基。本領域技術人員熟悉保護基團的類型和使保護基團結合於胺基酸官能團的方法。為討論起見，見Green，「有機化學物中的保護基團」，John Wiley Sons，New York，1991。
適合的基質含有合適的官能團，載有兩個或多個半抗原。因此，在本發明的另一優選實施例中，將尼古丁-取代的基質偶聯於載體蛋白質，以增加半抗原-載體偶聯物中半抗原與載體的摩爾比。基質起雙重作用，首先作為大量半抗原的支持物，其次作為交聯接頭。偶聯於載體蛋白質的尼古丁取代的基質可以式(III)表示 式中n是0-12，j是1-1000，k是1-20，E是可結合半抗原的含胺基酸的基質，載體蛋白質是任何合適的含有T-細胞表位的蛋白質或多肽。含胺基酸的基質E可以是胺基酸、肽、二肽或多肽，包括寡聚或多聚多肽。基質可含有一種或多種胺基酸，包括(但不限制於)天冬氨酸、賴氨酸、半胱氨酸和聚-L-穀氨酸。在一優選實施例中，j是1-200，在另一優選實施例中，j是1-4。
基質-載體偶聯物能形成多聚體「網格」。這種網格以下圖表示。術語「網格」用於指共價連接的複合物，它含有多個基質、半抗原、接頭和載體蛋白質，它們都是共價連接在一起的。因為尼古丁-取代的基質含有多個可與載體偶聯的尼古丁部分，可形成含有多個載體和多個尼古丁取代的基質的網格。如下簡單地表示了這種網格的一部分
尼古半抗原接頭 基質 載體蛋白質本領域技術人員將認識到本發明的網格含有式(III)的半抗原載體偶聯物。
不論蛋白質上可偶聯的官能團的數量多少，用基質進行偶聯的方法具有靈活性可控制半抗原與蛋白質的摩爾比。當使用特定的載體蛋白質時和當需要得到最佳比例以實現較高免疫原性的偶聯物時，這特別有用。雖然當使用的一種基質不一定必需使用時，可使用這種接頭。為了使用本實施例的接頭，使尼古丁取代的基質與一活性接頭化合物反應。例如，ADH、己二酸二醯肼可用作基質偶聯物的接頭。
載體蛋白質一旦製備了尼古丁半抗原，即可將其偶聯於載體蛋白質，從而可用於引發抗尼古丁載體偶聯物的抗體。用於本發明尼古丁載體偶聯物的載體蛋白質在式(I)和(III)中以 表示，包括任何合適的免疫原性蛋白質或多肽。「免疫原性」分子是能引發免疫應答的分子。較佳地，載體蛋白質含有T-細胞表位。同樣，「載體蛋白質」包括MAPs或多-抗原性肽(分支肽)。由於有多個支鏈胺基酸殘基，使用MAP可將半抗原的密度和化合價最大化。可用於形成MAP的胺基酸例子包括(但不限制於)賴氨酸。
本發明的載體蛋白質包括含有至少一個T細胞表位(能刺激對象的T細胞)的分子，從而誘導B細胞產生抗整個半抗原-載體偶聯物分子的抗體。本發明描述中所用的術語「表位」包括抗原上任何負責該抗原與抗體分子反應的決定簇。表位決定簇通常由分子(如胺基酸)的化學表面活性基團或糖側鏈構成，且具有特異性三維結構特徵以及特異性帶電特徵。為了具有免疫原性，認為蛋白質或多肽必需能刺激T-細胞。然而無T-細胞表位的載體蛋白質也可能具有免疫原性。
通過選擇已知能刺激強免疫應答的載體蛋白質，可用本發明的半抗原-載體偶聯物來治療多種類型的患者。載體蛋白質必須有足夠的外源性以引發對疫苗的強免疫應答。通常所用的載體蛋白質宜為大分子，能賦予共價連接的半抗原以免疫原性。特別優選的載體蛋白質是天生就有高度免疫原性的蛋白質。所以，具有高度免疫原性且能使對半抗原的抗體產量最大化的載體蛋白質是很理想的。
在用動物作試驗來開發偶聯疫苗時，牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血藍蛋白(KLH)常常被用作載體。但這些蛋白質可能不適合用於人。已被用於製備治療性偶聯疫苗的蛋白質包括(但不限制於)病原菌的許多毒素及其類毒素。其他候選物是與細菌毒素的抗原性類似的蛋白質，即指交叉反應物質(CRMs)。
在製備尼古丁偶聯物藥物組合物時，重組銅綠假單胞菌蛋白質A(rEPA)可作為載體蛋白質，因為對這種蛋白質的結構和生物活性有很好的了解。另外，國家衛生研究院和本發明的發明者已在金黃色葡萄球菌莢膜多糖偶聯疫苗中將這種重組蛋白質成功地且安全地用於人。Fattom等人，感染免疫，611023-1032(1993)。已鑑定出這種蛋白質是一種合適的蛋白質載體，因為由於553位胺基酸的缺失，已消除了這種天然外毒素的固有酶促活性。因此，rEPA具有與天然外毒素A(ETA)相同的免疫特徵，但不具有天然ETA的肝毒性。在本申請中，「外蛋白質A」指修飾過的、非-肝毒性ETA。這種外蛋白質A的一個實例含有553位的胺基酸缺失。
將半抗原偶聯於載體蛋白質有大量的官能團可採用以便於載體與小分子(如半抗原)連接或偶聯。這些官能團包括羧酸、酸酐、混合酸酐、醯基滷、疊氮醯基、烷基滷、N-馬來醯亞胺、亞氨酸脂、異氰酸脂、胺、硫醇和異硫氰酸脂，以及本領域技術人員已知的其他物質。這些基團能與蛋白質分子的反應基團形成共價鍵。取決於所用的官能團，反應基團可以是載體蛋白質上或修飾的載體蛋白質分子上賴氨酸殘基或硫羥基的ε氨基，當與這種ε氨基反應時將形成醯胺、胺、硫醚、脒脲或硫脲鍵。本領域技術人員知道還可使用其他合適的活性基團和偶聯方法。如見Wong，「蛋白質偶聯和交聯化學」，CRC Press，Inc，(1991)。也可見Hermanson，「生物偶聯方法」，Academic Press1996，以及Dick和Beurret，「偶聯疫苗」，Contribu.Microbiol.Immunol.，Karge，Basal(1989)第10卷，48-114。
對將半抗原偶聯於載體蛋白質而言，與環狀或分支接頭相比線性接頭分子是優選的。一種優選的接頭是琥珀醯基接頭。但接頭除線性分子外也可以是環狀結構。接頭的另一實例是ADH。
所以，本發明尼古丁半抗原-載體偶聯物的製備，是通過將一種或多種半抗原與載體蛋白質反應，產生能刺激T細胞的半抗原載體偶聯物，從而使T細胞增殖並釋放介質，在對免疫原性半抗原-載體偶聯物的應答反應中，這些介質活化特異性B細胞刺激抗體產生。在對半抗原載體偶聯物應答反應中產生的一些抗體對半抗原-載體偶聯物中的半抗原部分是特異性的。本發明期待將各種合適的半抗原與載體蛋白質組合一起用於治療尼古丁成癮。
單克隆和多克隆抗體產生單克隆抗體的方法是本領域熟知的。可將含有尼古丁半抗原-載體偶聯物的組合物注射入小鼠，然後取出血清樣品驗證是否產生抗體，取出脾臟以得到B-淋巴細胞，將B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤，克隆這種雜交瘤，選出產生抗半抗原-載體偶聯物抗體的陽性集落，培養這些產生抗原抗體的集落，從雜交瘤培養物中分離抗體，得到單克隆抗體。
可用各種已知的方法從雜交瘤培養物分離和純化單克隆抗體。這些分離方法包括用蛋白質A-瓊脂糖作親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。如見Coligan第2.7.1-2.7.12和第2.9.1-2.9.3。也可見Baines等人，分子生物學方法中的「免疫球蛋白G(IgG)的純化」，第10卷，第79-104頁(The HumanaPress，Inc，1992)。
製備多克隆抗體的方法也是本領域熟知的。按本領域已知的標準方法製備多克隆抗體。為製備多克隆抗體，用免疫原性物質注射動物，收集富含抗體的血清，血清中含有抗體混合物，這些抗體針對注射的免疫原的多個表位。用於產生抗體的適合的宿主哺乳動物包括(但不限制於)人、大鼠、小鼠、兔和山羊。
對本發明而言，也可用功能性抗體片段。產生這種片段的方法包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜酶)消化和/或用化學還原法切斷二硫鍵。另外，本發明的抗體片段還可用自動肽合成儀(如可從Applied Biosystems，Multiple PeptideSystems和其他公司購得的合成儀)，或可用本領域熟知的方法手工合成。見Geysen等人，免疫學方法雜誌102259(1978)。可用常規方法對本發明的單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列進行直接測定。
本發明的片段可以是Fv片段。抗體的Fv片段是由抗體重鏈的可變區(Vh)和抗體輕鏈的可變區(V1)構成的。蛋白酶切割抗體能產生雙鏈Fv片段，其中Vh和Vl結構域依舊非共價結合且保留了結合抗原的能力。Fv片段還包括重組單鏈抗體分子，其中輕鏈和重鏈的可變區通過一肽接頭相連。見Skerra等人，科學，240，1038-41(1988)。本發明的抗體片段還包括Fab、Fab』、F(ab)2、和F(ab』)2，它們都不含有完整抗體的Fc片段。
治療方法由於當尼古丁通過血-腦屏障後，尼古丁就有許多明顯作用，所以本發明的治療方法在於防止尼古丁穿過血-腦屏障。具體地說，給予患者尼古丁半抗原-載體偶聯物，能在患者的血流中產生抗尼古丁抗體。另外，可將在待治療的患者體外(如在合適的宿主哺乳動物中)產生的抗尼古丁抗體給予患者。如果患者吸菸，在他血流中的尼古丁將被循環性抗尼古丁抗體結合，從而防止尼古丁到達腦。所以，該抗體能防止尼古丁在腦部引起的精神和心理作用。由於吸菸者將經歷這些作用的減輕或消除，他/她將失去吸菸的願望。如果患者使用無煙菸草，用本發明的尼古丁半抗原-載體偶聯物免疫接種後，預計會得到同樣的治療效果。另外，通過影響尼古丁刺激周圍神經系統的能力，本發明的偶聯物和抗體可發揮其作用。
如上所述，本發明的新穎尼古丁-載體偶聯物保留了尼古丁分子的天然手性和結構。具體說，這些偶聯物的尼古丁部分具有(S)-(-)構型。所以，在對這種偶聯物應答反應中產生的抗體對天然形式的尼古丁是特異性的，且在特異性結合吸菸吸入的或從無煙菸草吸收的尼古丁和抑制這種攝取的尼古丁的作用上是最有效的。另外，本發明的偶聯物是化學穩定的，這種穩定性對生產長保質期的疫苗是關鍵性的。
本發明的組合物可與用於治療成癮的化合物或其他治療劑聯合使用。這包括給予化合物(但不限制於)抗抑鬱藥，如Zyban和Prozac等化合物。
1.給予尼古丁半抗原-載體偶聯物本發明的偶聯物適用於治療和預防尼古丁成癮。對於治療尼古丁成癮而言，將本發明的尼古丁-載體偶聯物給予患尼古丁成癮的患者。對於預防尼古丁成癮而言，用本發明的偶聯物來治療有發展成尼古丁成癮危險的患者(如青少年)。直接將該偶聯物給予患者稱為「主動免疫」。
本發明的疫苗組合物含有至少一種尼古丁半抗原-載體偶聯物，其量足以引發對它的免疫應答。這種尼古丁半抗原-載體偶聯物能在體內保存一定的濃度，足以主動抵抗隨後攝取的尼古丁。
用本發明尼古丁半抗原載體偶聯物的初次疫苗接種產生高滴度的尼古丁特異性抗體。技術人員不難確定給予需要治療尼古丁成癮患者的偶聯物的治療有效劑量。合適的劑量範圍為1-1000μg/劑。通常患者需要一周到幾周來產生抗上述抗原的抗體。可用本領域技術人員熟知的方法，如ELISA、放射免疫試驗和Western印跡分析，來監測患者血流中抗體的產生情況。也可通過評估尼古丁的各種生理作用，如血壓，來監視治療效果。
如下詳述，可將本發明的尼古丁半抗原-載體偶聯物加工成易於給予患者的組合物。給藥的優選方式包括(但不限制於)鼻內、氣管內、口腔、皮膚、透黏膜皮下注射和靜脈注射。技術人員將懂得首次注射後還可給予一次或多次「加強劑量的」偶聯物。這種加強劑量將增加抗本發明尼古丁半抗原-載體偶聯物的抗體的產量。
本發明的疫苗組合物可含有至少一種佐劑。選擇的用於本發明的佐劑應不會抑制載體蛋白質的作用。用於本發明的佐劑是那些人生理上可接受的佐劑，包括(但不限制於)明礬、QS-21、皂苷和MPLA(單磷脂A)。
本發明的疫苗組合物任選地含有一種或多種藥學上可接受的賦形劑。適用於本發明的賦形劑包括無菌水，鹽溶液，如鹽水，磷酸鈉、氯化鈉，醇，阿拉伯樹膠，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明膠，甘露醇、碳水化合物、硬脂酸鎂、粘性石蠟、脂肪酸脂、羥甲基纖維素和緩衝液。當然本領域技術人員已知的其他賦形劑也可用於本發明。
為了給予需要治療或防止尼古丁成癮的患者，可將本發明的半抗原-載體偶聯物摻入藥物組合物中。當含有半抗原-載體偶聯物的該組合物用於注射時，較佳地將半抗原-載體偶聯物溶解在鹽水溶液(具有藥物學上可接受的pH)中。但也可使用可注射的半抗原-載體偶聯物懸浮液。除常用的藥物學可接受的賦形劑外，該組合物可含有任選成分以確保純度、提高生物可利用性和/或增加滲透性。
另外，此疫苗組合物可任選地含有至少一種輔助劑，如分散劑、包裹劑、微球、脂質體、微膠囊、酯類、表面活性劑、潤滑劑、防腐劑和穩定劑。當然，任何本領域技術人員已知的其他輔助劑也可用於本發明。同樣任何能與本發明疫苗組合物起協同作用的試劑也是有用的。
本發明的藥物組合物是無菌的，且足夠穩定能耐受保存、分配和使用。另外，此組合物還可含有其他成分以保護組合物不受微生物的感染、抑制微生物的生長。較佳地，將此組合物製成凍乾粉末形式，在給藥前用藥學上可接受的稀釋劑重建。製備無菌注射用溶液的方法是本領域技術人員熟知的，包括(但不限制於)真空乾燥、冷凍乾燥和旋轉乾燥。這些方法產生了一種帶有摻入預混合物中的賦形劑的活性成分粉末。
2.給予對尼古丁-載體偶聯物應答反應中產生的抗體被動免疫包括給予或使抗體接觸對本發明的尼古丁半抗原載體偶聯物應答反應中產生的多克隆抗體或單克隆抗體。可在動物或人中產生這些抗體。給予對本發明尼古丁偶聯物應答反應中產生的抗體來預防尼古丁成癮。例如，可將這種抗體給予有發展成尼古丁成癮危險的患者，如青少年。這種抗體也適用於治療尼古丁成癮的患者。如上所述，該抗體將結合血流中的尼古丁，並防止尼古丁穿過血腦屏障。給予本發明半抗原-載體偶聯物所產生的抗體的分子量範圍約為150kDa-1,000kDa。
本領域技術人員不難確定給予患者(需要治療尼古丁成癮的)本發明治療性抗體的治療有效劑量。合適的劑量範圍為1-1000μg/劑。
本發明治療用組合物含有至少一種對本發明尼古丁-載體偶聯物應答反應中產生的抗體。本發明的這種組合物可任選地含有一種或多種藥學上接受的賦形劑。適用於本發明的賦形劑包括無菌水，鹽溶液，如鹽水，磷酸鈉、氯化鈉，醇，阿拉伯樹膠，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明膠，甘露醇、碳水化合物、硬脂酸鎂、粘性石蠟、脂肪酸脂、羥甲基纖維素和緩衝液。當然本領域技術人員已知的其他賦形劑也可用於本發明。
為了給予需要治療或防止尼古丁成癮的患者，可將本發明的抗體摻入藥物組合物中。當含有抗體的該組合物含有用於注射時，較佳地將抗體溶解在鹽水溶液(具有藥物學可接受的pH)中。但也可使用可注射的抗體懸浮液。除常用的藥物學可接受的賦形劑外，此組合物可含有任選成分以確保純度、提高生物可利用性和/或增加滲透性。
含有本發明抗體的藥物組合物是無菌的，且足夠穩定能耐受保存、分配和使用。另外，此組合物還可含有其他成分以保護組合物不受微生物的感染、抑制微生物的生長。製備無菌注射用溶液的方法是本領域技術人員已知的，包括(但不限制於)真空乾燥、冷凍乾燥和旋轉乾燥。用這些方法產生了一種帶有摻入預混合物中的賦形劑的活性成分粉末。
含有本發明抗體的試劑盒也可將本發明的抗體用於製備試劑盒，此試劑盒可用來探測或定量測定樣品中的尼古丁水平。本發明的試劑盒在一合適的容器中含有本發明的尼古丁特異性抗體。對放射免疫試驗而言，這種試劑盒還可含有標記的尼古丁。通過使標記的尼古丁與抗體結合，然後與測試樣品中的抗體競爭標記的尼古丁，來測定樣品中的尼古丁。ELISA試劑盒也含有本發明的抗體。ELISA包括抑制抗體與已知量的尼古丁結合，與懷疑含有尼古丁的樣品的抑制相比較。比較樣品與已知濃度尼古丁的標準抑制曲線，可確定樣品中的未知尼古丁。另一種類型的ELISA，將懷疑含有尼古丁的樣品在微量滴定板上培養，該微量滴定板上包被有能結合尼古丁的物質。加入本發明的抗體，並在板上加入酶連接的抗-抗體抗體。加入底物將定量測定與板結合的尼古丁的量。
以下實施例僅進一步說明本發明的製備和使用方法。本發明的範圍不受以下實施例的限制。
實施例1-合成衍生的尼古丁半抗原(在3』位被取代)合成半抗原的起始物是可商品購得的反式-4』-羧基-(-)-可替寧。按Cushman和Castagnoli，Jr.(1972)有機化學雜誌，37(8)1268-1271描述的修飾方法，酸的甲基酯化後再還原脂，提供醇(反式-3』-羥甲基-(-)-尼古丁)。然後磺酸化該醇，用疊氮基替代磺酸鹽，最終將其還原成胺。
將4g反式-4』-羧基-(-)-可替寧溶解在用無水甲醇配製的50ml 2N硫酸中，室溫攪拌過夜。將得到的懸液用Whatman No.1濾紙過濾，然後慢慢加到100ml碳酸氫鈉飽和溶液中。蒸發掉溶劑後，用二氯甲烷提取酯，得到4.2g淡紅色油。在幹氬氣下，將用幹四氫呋喃(100ml)配製的3.9g該酯的溶液逐滴加到幹四氫呋喃(70ml)配製的4當量氫化鋁鋰懸液中。室溫攪拌此懸液2小時。在冰浴中冷卻時，仔細、可控地添加水來破壞過量的氫化物。過濾得到白色沉澱，將此濾物在硫酸鈉上乾燥，減壓下濃縮，得到2.7g黃色油狀醇。
將此醇(1.9g)溶解在20ml二氯甲烷中。然後逐步向此溶液中加入三乙胺(0.75ml)和對-甲苯磺醯氯(1g)。室溫攪拌此桔紅色溶液。在硅藻土柱床上過濾此沉澱的三乙胺鹽酸鹽，減壓下濃縮過濾物得到棕色油。在矽石快速層析柱上純化此磺酸鹽，用二氯甲烷配製的5％甲醇洗脫，得到2.1g黃色油。
80℃用50ml二甲基甲醯胺配製的疊氮化鈉(0.8g)置換此磺酸鹽(1.8g)1小時。高真空蒸發掉二甲基甲醯胺後，將殘留物溶解在二氯甲烷中，用水和鹽水洗滌，硫酸鈉乾燥。溶劑蒸發後，得到呈棕色油狀的疊氮鹽(1.1g)。
將用幹四氫呋喃(20ml)配製的該疊氮鹽加到用幹四氫呋喃(50ml)配製的氫化鋁鋰懸液中，易產生所需的胺，用薄層層析監測。純化胺的質子和碳核磁共振廣譜對應於預期的結構。
實施例2-合成衍生的尼古丁半抗原(在4』位被取代)烯醇鹽烷化可替寧，然後還原此烷基化的產物，能實現在尼古丁的4』位引入官能化的臂。可用各種烷化劑，如合適地被保護的3-溴-丙胺。例如，可用3-溴-N-苄脂基(carbobenzyloxy)-丙胺或N-(3-溴丙基)-鄰苯二醯胺。烷化和還原後偶聯於載體蛋白質之前，除去胺的保護基團。環狀內醯胺(含有吡咯烷酮(pyrrolidinone)環)的烯醇鹽烷化已有文獻報導(一般綜述可見G.Helmchen等人(1995)Houben-Weyl-方法中有機化學物質的立體選擇性合成，E21a卷，762-881，Thieme，Stuttgart，Germany，反應的立體考慮則可見A.J.Meyers等人(1997)J.Am.Chem.Soc.，119，4564-4566)。還有一些可替寧自身烯醇鹽烷化的例子(N.-H.Lin等人(1994)J.Med.Chem.，37，3542-3553)。以酮(或醛)和2-烷氧基-3-鏈烯胺(alkenamine)為起始物，用串聯陽離子氮雜-Cope重排-Mannich環化反應，製備了感興趣的4』-乙醯基-尼古丁(1∶1混合的兩種差向異構體)(L.E.Overman(1983)J.Am.Chem.Soc.，105，6622-6629)。可延伸此反應產生4』-醛-尼古丁，適用於偶聯。
將3-溴-丙胺氫溴化物(4.2g)懸浮在50ml二氯甲烷中，加入三乙胺(約7ml)直至得到清澈的溶液。將溶液冷卻至0℃，逐滴加入氯甲酸苄基酯(2.5ml)。讓反應在室溫中攪拌下進行16小時。過濾掉沉澱的鹽，用冷水、冷的1N HCl和冷水洗滌清澈的有機層，硫酸鈉乾燥，減壓下蒸發得到黃色油(2.93g粗產物)。
分別與無水甲苯共蒸發可替寧(62mg)和3-溴-N-苄脂基-丙胺(100mg)。將可替寧溶解在5ml新鮮蒸餾的無水四氫呋喃中，加入60μl N，N，N』，N』-四亞甲基二胺(TMEDA)，將溶液浸入乙醇-乾冰浴中冷卻至-78℃。將可替寧溶液逐滴加到預冷至-78℃的四氫呋喃配製的二異丙胺鋰中(LDA，200μl用庚烷-四氫呋喃配製的2M溶液)。-78℃攪拌此桔紅色溶液15分鐘，然後在冰浴(2-6℃)中升溫。再次將反應物冷卻至-78℃，並逐滴加入溶解在無水四氫呋喃的3-溴-N-苄脂基-丙胺，為時15分鐘。將反應混合物升溫至-10℃，然後用甲醇萃取。在矽膠柱上快速層析純化反應產物。用硼烷隨後用氟化銫(用熱乙醇配製的)完成這種可替寧衍生物醯胺的還原。在酸性條件中除去苄脂基後得到最終的胺。
實施例3-合成衍生的尼古丁半抗原(在5』位被取代)通過使適當保護的烷基鋰化合物與尼古丁反應，隨後與氰基硼氫化鈉反應，可實現將功能臂引入尼古丁的5』位，反應過程與Shibagaki等人(1986)Heterocycles，24，423-428和N.-H.Lin等人(1994)見上所述的類似。
實施例4-將衍生的尼古丁半抗原偶聯於載體蛋白質通過琥珀酸臂將重組外蛋白質A(rEPA)連接於衍生的尼古丁半抗原上。用琥珀酐不難將rEPA的15賴氨酸琥珀醯化。然後，在常規的偶聯反應中製備了5-10mg/ml溶解在0.05M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩衝液(含有0.15M NaCl，pH6.0)的琥珀醯化重組外蛋白質A(Suc-rEPA)。將溶解在最少量蒸餾水中的等量3』-氨基甲基-(-)尼古丁(3』AMNic)半抗原加到該蛋白質溶液中。在加入前用0.1N HCl將半抗原溶液的pH調至6.0。最後，將等量的鹽酸1-乙基-3-(3-二乙基氨基)丙基碳化二亞胺(EDC)加到該半抗原蛋白質混合物中，室溫攪拌下反應30分鐘。將得到的尼古丁偶聯物在Sephadex G-25柱上純化，用pH7.4的磷酸鹽緩衝鹽水洗脫。偶聯物的回收率為80-90％範圍。
實施例5-尼古丁負載基質的偶聯本實施例描述了半抗原-載體偶聯物的合成，此偶聯物含有3』-氨甲基-(-)-尼古丁作為衍生的半抗原，重組外蛋白質A(rEPA)作為載體蛋白質，己二酸二醯肼(ADH)作為接頭，聚-L-穀氨酸作為半抗原的「基質」或多聚支持物。
在本實施例中所用的聚-L-穀氨酸的平均分子量為39,900，多分散性為1.15，聚合度為264。計算半抗原和聚合物的反應量，使靶向取代的程度約為80％。即當達到80％取代時，此穀氨酸聚合物平均每分子總共264個重複單元中約208個半抗原單元被偶聯。
此負載尼古丁的聚-L-穀氨酸的化學式如下 如圖所示，聚穀氨酸聚合物含有約52個穀氨醯胺殘基。但此數是可變的，取決於所選聚胺基酸殘基的批次和來源。同樣上圖顯示每個重複單元有4個尼古丁半抗原。這個數目是可變的，取決於基質與尼古丁半抗原偶聯時所用反應物的比例。
與衍生的尼古丁偶聯後，未反應的羧基(約20％)與ADH衍生。當此基質偶聯於載體時(如實施例6所述)，負載尼古丁基質與蛋白質的摩爾比為1∶1。因此在偶聯中，理論上偶聯反應完成時，尼古丁半抗原與蛋白質的摩爾比應為200∶1。
用產物的NMR分析估計了聚穀氨酸上尼古丁取代基的實際比例。相對於尼古丁吡啶環的四個氫，穀氨酸α-氫峰的強度提供了摻入的尼古丁的比例。估計出的平均比例為143∶1(尼古丁/載體蛋白質)。
實施例6-用負載尼古丁的基質製備尼古丁偶聯疫苗A.將尼古丁半抗原加載到基質上將10mg聚-L-穀氨酸鹽(Sigma，Ca#P-4761)溶解在2ml 0.05M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩衝液(含有0.15M NaCl，pH 6.0)中。將10mg 3』-氨基甲基-(-)-尼古丁溶解在最少量蒸餾水中，用0.1N HCl將溶液的pH調節到pH 6.0。邊攪拌，邊將尼古丁半抗原溶液逐滴加入此多肽溶液中，隨後調節到pH 6.0。分三批，將20mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)固體加到半抗原-多肽混合物中，為時20分鐘。反應在室溫進行1小時。三次換水來透析此反應產物(尼古丁-取代的基質)並冷凍。得到12mg呈白色蓬鬆物質的尼古丁取代的聚穀氨酸。
B.將接頭結合於尼古丁取代的基質將10mg尼古丁取代的聚穀氨酸溶解在2ml MES緩衝液(pH 6.0)中。邊攪拌邊將8mg己二酸二醯肼(ADH)加到溶液中，然後再加入10mg EDC。讓反應在室溫進行1小時。最後將得到的溶液用pH 6.0 MES緩衝液透析換液3次。
C.偶聯於載體蛋白質將10mg重組外蛋白質A(rEPA)溶解在2ml 0.05M MES緩衝液(pH 5.6，含有0.15M NaCl)中。將估計含有7.5mg此衍生物質的ADH-結合的尼古丁-取代的聚穀氨酸溶液加到此蛋白質溶液中。室溫邊攪拌邊將固體EDC分三批加到此混合物中，為時20分鐘。讓反應在室溫下進行過夜。在Sephadex G-25柱上最後純化得到的偶聯物，用pH 7.4的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗脫。此產品是偶聯物的純化製品，其中偶聯物僅含有(S)-(-)形式的尼古丁。
實施例7-實施例4尼古丁載體偶聯物的特性分析在Superose 12大小排阻層析柱上分析了實施例4的純化的偶聯疫苗，並用pH 7.4的PBS洗脫。摻入尼古丁後，測定260nm UV吸收增加(相對於280nm的吸收)，計算出半抗原與蛋白質的摩爾比為11∶17。這個範圍是通過計算六批分開製備的半抗原-載體偶聯物(1批17.2，2批16.2，3批13.2，4批12.0，5批11.0，6批17.2)中半抗原/載體蛋白質的比例確定的。用MALDI-TOF質譜進一步分析確定此比例得到了與UV吸光度差異基本相同的數據。此偶聯疫苗的蛋白濃度用BCA試劑測定。對實施例4的尼古丁-載體偶聯物進行了穩定性研究。研究所用的疫苗裝在1ml玻璃瓶中，濃度為0.5mg/ml，測定了在以下三種不同溫度時玻璃瓶中疫苗的穩定性-70℃，2-8℃和室溫。
實施例8-實施例4的尼古丁載體偶聯物的穩定性如在-70℃、2-8℃和室溫下六個月偶聯物穩定性所觀察的那樣，基於半抗原-接頭-載體之間形成醯胺鍵的偶聯方法比形成酯鍵看來更有利。穩定性研究包括用如下程序對偶聯疫苗進行監測和分析1.目測觀察是否形成任何顆粒(混濁度、沉澱)2.核查pH是否有明顯的變化3.大小排阻層析結合260和280nm的UV吸光度測定，以確定尼古丁摻入比例是否改變4.反相層析，核查載體蛋白質是否降解5.用銀染色作SDS PAGE，檢查偶聯的蛋白質是否被蛋白酶切割。
如在-70℃和2-8℃6個月偶聯物的穩定性測試中所觀察到的那樣基於在半抗原和接頭之間以及接頭和載體蛋白質之間形成醯胺鍵的偶聯方法看來是有利的。
實施例9-實施例4和6的載體偶聯物的免疫原性證據用兩種尼古丁半抗原-載體偶聯物來免疫接種小鼠、大鼠和家兔。
A.動物測試多克隆抗體用標準方法免疫接種動物。對小鼠，皮下注射疫苗3次，間隔為2周，在第一次和第二次注射後1周進行採血測試，第三次注射後1周放血。在實施例10中描述了用ELISA試驗對這些血清樣品進行評價。用3』AMNic-pGlu結合的微量滴定板進行ELISA試驗。
用此疫苗腹腔內免疫接種大鼠3次。間隔兩周進行注射，且在第一次和第二次注射後一周測試血液。第三次注射後一周給大鼠放血。在第一次注射時用Freund完全佐劑，隨後的注射用Freund不完全佐劑。用ELISA試驗評價血清樣品。
用100μg疫苗肌內免疫接種家兔3次，間隔3周。第一次注射劑中含有Freund佐劑，以後的注射劑中含有Freund不完全佐劑。第二次和第三次注射後一周測試家兔血液，以確保產生的血液有足夠的滴度。如果獲得合適的滴度(用ELISA測定)，將家兔置於每周產血方案(20-40ml血清/兔)。全程監測抗體的滴度，如果需要恢復抗體水平可加強接種動物。
表1-5顯示了這些免疫原性研究的結果。表1和2顯示了小鼠中免疫原性研究的結果。表1中，所用的偶聯物是3』氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀醯基-rEPA(實施例4)。表2中，所用的偶聯物是3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚穀氨酸-ADH-rEPA(實施例6)。這些表顯示產生了高滴度的特異性結合尼古丁的抗體。另外，還顯示這些偶聯物誘導增強應答的能力。
表3和4顯示了大鼠中免疫原性研究的結果。表3中，所用的偶聯物是3』氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀醯基-rEPA(實施例4)。表4中，所用的偶聯物是3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚穀氨酸-ADH-rEPA(實施例6)。
這些表顯示產生了高滴度的特異性結合尼古丁的抗體。另外，還顯示這些偶聯物誘導增強應答的能力。
表5顯示了家兔中免疫原性研究的結果。使用3』氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀醯基-rEPA(實施例4)或3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚穀氨酸-ADH-rEPA(實施例6)，產生了對這兩種偶聯物的高滴度抗體。這些滴度保持升高6個月以上。
表1-用3』AMNid-Suc-rEPA處理小鼠

劑量根據蛋白質試驗。
滴度是相應的注射後一周的算術平均值。
表2-用3』AMNid-pGlu-ADH-rEPA處理小鼠

劑量根據凍幹偶聯物的乾重。
滴度是相應的注射後一周的算術平均值。
表3-用3』AMNid-Suc-rEPA處理大鼠

劑量根據蛋白質試驗。
滴度是相應的注射後一周的算術平均值。
表4-用3』AMNid-pGlu-ADH-rEPA處理大鼠

劑量根據凍幹偶聯物的乾重計算。
滴度是相應的注射後一周的算術平均值。
表5-用3』AMNic-Suc-rEPA和3』AMNic-pGlu-ADH-rEPA處理家兔

對3』AMNic-Suc-rEPA根據蛋白質試驗計算劑量，對3』-AMNic-pGlu-rEPA根據乾重計算劑量滴度是第三次注射後6-7周的算術平均值。
實施例10-ELISA試驗和抗體特異性尼古丁分子本身不適合包被ELISA板，需要將它連接於有較好粘附特性的較大分子。聚-L-賴氨酸或聚-L-穀氨酸通常用於這一目的。將衍生的尼古丁半抗原3』-氨基甲基-(-)-尼古丁(3』AMNic)偶聯於聚-L-穀氨酸，並將獲得的3』-氨基甲基(-)-尼古丁-聚-L-穀氨酸偶聯物(3』AMNic-pGlu)用於包被ELISA板。
如下用3』AMNic-pGlu ELISA評估產生的抗3』AMNic疫苗的抗體100ul/孔，用0.1M碳酸氫鹽緩衝液(pH 9.6)配製的10ng/ml 3』AMNic-pGlu包被Dynatech Immulon4微量滴定板(Chantilly，VA)，室溫(RT)培養過夜(ON)。然後抽吸這些平板，用PBS配製的1％BSA室溫封閉1小時。用PBB(1％BSA、0.3％BRIJ用PBS配製，pH 7.2)稀釋樣品和參考血清，直到稀釋液450nm的光密度(OD)接近2.0。用9％NaCl，0.1％BRIJ洗板5次，加入稀釋的樣品和參考血清。將參考品和樣品稀釋2倍，板上的終體積為100μl/孔，37℃培養此板1小時。然後再洗板，加入用PBB稀釋的過氧化物酶-偶聯的抗種系IgG，Fc特異性抗體(Jackson，West Grove，PA)，100μl/孔，37℃培育1小時。洗板，室溫與100μl/孔，用H2O2(由TMB試劑盒提供)1∶1稀釋的3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(TMB)底物(KPL，Gaithersburg，MD)培育10分鐘。加入100μl/孔1M磷酸終止反應，在MR4000微量滴定板讀數儀(Dynatech)上以450nm讀數。相對於參考品以平行線分析定量測定樣品。指定的參考品為其數值(U/ml)，相應於450nmOD值約2.0的稀釋液。
用ELISA抑制試驗評估了抗體的特異性。將各[3』AMNic-Suc-rEPA]血清稀釋到一濃度，其450nm光密度約為2.0濃度的兩倍。採用上述3』AMNic-pGluELISA，37℃用遞增量的測試抗原(抑制劑)，以1∶1(v/v)吸收被測試的稀釋血清3小時，用未吸收的血清為參考在ELISA中測試吸收的樣品。確定各樣品相對未吸收樣品的吸收百分比。
以酒石酸尼古丁作為抑制劑，用ELISA抑制試驗計算含抗體(對3』AMNic-Suc-rEPA應答反應中產生的)的大鼠血清的特異性。該抗體的IC50為3.5×10-6M。以酒石酸尼古丁作為抑制劑，用ELISA抑制試驗計算含抗體(對3』AMNic-Sur-rEPA應答反應中產生的)的兔血清的特異性。該抗體的IC50為2.3×10-6M。
實施例11-抗體親和力和結合能力用0.7ml血漿、Teflon半微量杯、分子量篩截斷值為12-14kD的Spectrapor2膜和Sorenson緩衝液(0.13M磷酸，pH 7.4)，37℃用平衡透析4小時測定了抗體的結合能力，見Pentel等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.246，1061-1066(1987)。在到達平衡透析終點時測定血清的pH，只有最終pH為7.30-7.45的樣品才可用。
用可溶性放射免疫試驗計算抗體對尼古丁的親和力，見Mueller，Meth.Enzymol.，92，589-601(1983)。測得IgG的分子量為150kD。
用放射免疫試驗得到的結合常數和親和力如下。抗-[3』AMNic-Suc-rEPA]大鼠血清的IC50(摩爾)為1.36×10-7。Ka(摩爾-1)為2.57×107。結合部位濃度為2.61×10-6結合位點/L，尼古丁-特異性IgG濃度為0.2mg/ml。
實施例12-評估動物模型的血漿和腦中尼古丁的分布在各種動物模型中評價了本發明的疫苗。用大鼠模型來評估主動或被動免疫對血漿和腦中尼古丁分布的作用。一項研究檢驗了被動免疫對尼古丁減弱運動的作用，即尼古丁對中樞神經系統(CNS)的作用。另一研究評估了被動免疫對尼古丁對心血管系統作用的影響評估收縮期血壓。
為了評估本發明的免疫療法，開發了一動物模型，模擬人迅速吸收兩支煙的尼古丁。Hieda(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.283(3)1076-1081描述了這種動物模型。在這種模型中，用0.03mg/kg尼古丁靜脈注射大鼠為時10秒，模擬吸菸者由肺迅速吸收尼古丁。注射尼古丁後3和10分鐘採集血樣，測定血漿尼古丁。當測定尼古丁腦濃度時，在注射尼古丁後3分鐘處死動物，迅速取出它們的腦。在大鼠中評估了實施例4中的疫苗，確定它們對尼古丁在血漿和腦中分布的作用。
A.主動免疫尼古丁疫苗免疫接種大鼠，每次25μg疫苗(3』AMNic-Suc-rEPA)腹腔內注射，間隔2周共3次。注射0.03mg/kg尼古丁(為時10秒)後3和10分鐘，這些動物的血漿尼古丁水平升高(與未免疫接種的對照動物相比)。見圖1。所以主動免疫對增加血漿中尼古丁的結合是有效的。已知適當地減少到達腦部的尼古丁的量能顯著改變尼古丁的行為作用。
B.被動免疫用被動免疫，可確定免疫IgG在增加尼古丁血漿水平和減少尼古丁腦水平中的劑量應答反應作用。每次注射大鼠不同量的抗-(3』AMNic-Suc-rEPA)IgG(12.5-50mg)。如圖2所示，存在明顯的劑量應答反應作用，增加IgG的劑量，將增加血清尼古丁水平而降低腦尼古丁水平。
如圖3所示，每次注射給予總量為50mg的抗體後30分鐘和1天，大鼠的血清中存在抗尼古丁抗體(抗3』AMNic-Suc-rEPA)而且是活性的。如圖3所示，用尼古丁攻擊後(0.03mg/kg注射10秒)，這些抗體有效地降低了腦中尼古丁濃度，增加了血漿中尼古丁水平(給予抗體後30分鐘和1天)。
用本發明尼古丁疫苗被動免疫有效的另一證明是，它能抵抗連續注入的尼古丁。在大鼠分開的被動免疫試驗中，多次劑量的尼古丁並沒有耗竭存在的抗體或明顯降低它們結合新鮮注入的尼古丁的能力。圖4中，在0時注入50mg抗-[3』AMNic-Suc-rEPA]，24小時後，從右頸靜脈注射5次0.03mg/kg尼古丁(10秒)，每20分鐘一次共80分鐘。進行總量為5次的尼古丁注射。第5次尼古丁注射用3H-尼古丁示蹤。第五次注射後1分鐘收集血液和腦。以下顯示了結果，並在圖4和5中圖解。


這些結果顯示即使在注射了五次尼古丁後，抗體依然能有效地增加血清尼古丁的水平並降低腦尼古丁水平。用3H-尼古丁的結果證明抗體能有效地抵抗第五劑注射的尼古丁。
實施例13-評估尼古丁的運動作用設計本試驗以確定被動免疫能否預防尼古丁的即刻CNS介導作用。由Dr.David Malin開發了用於本試驗的大鼠模型，描述見Malin等人，「尼古丁-特異性IgG減少了大鼠腦中尼古丁的分布並減弱其行為和心血管作用」(遞交給尼古丁和菸草研究協會的第五次年會，San Diego，CA，1999年3月5-7日)。為了確定基線，測定了皮下注射0.8mg/kg酒石酸尼古丁對大鼠運動能力水平的作用。0.8mg/kg酒石酸尼古丁是不引發運動異常的最高可用劑量。
注射尼古丁後，未用抗-[3』AMNic-Suc-rEPA]預處理的和用50mg正常家兔血清IgG預處理的大鼠活性水平增加。見圖6A的右直方和圖6B的左直方。用50mg抗-[3』AMNic-Suc-rEPA]免疫IgG預處理動物抑制了這種作用(圖6B右直方)。這顯示抗尼古丁血抗血清消除了尼古丁的體內刺激作用。
實施例14-評估尼古丁對收縮期血壓的作用在本試驗中，測定了尼古丁行為作用的另一標誌收縮期血壓的變化。用抗-[3』AMNic-Suc-rEPA]IgG或對照IgG預處理大鼠。用0.1mg/kg酒石酸尼古丁皮下注射處理大鼠。對照大鼠顯示當用尼古丁處理時，收縮期血壓增加42.6±3.2mmHg。當大鼠用抗尼古丁抗血清IgG預處理時，尼古丁的攻擊效果差。當抗尼古丁血清給予的量增加時，可消除尼古丁升高血壓的能力。如圖7所示，作為IgG劑量的函數血壓呈負線性趨勢。
權利要求
1.一種半抗原載體偶聯物，它具有下式II結構 式中，n是0-12，Z是NH2、COOH、CHO或SH，且-(CH2)n-Z連接於3』、4』或5』位；其中，該Z部分能直接或通過接頭連接於載體。
2.如權利要求1所述的半抗原載體偶聯物，其特徵在於，所述接頭是琥珀醯基部分。
3.如權利要求1所述的半抗原載體偶聯物，其特徵在於，所述載體蛋白包括T細胞表位。
4.如權利要求1所述的半抗原載體偶聯物，其特徵在於，所述T細胞表位能刺激對象的T細胞，從而誘導B細胞產生針對該半抗原載體偶聯物的抗體。
5.權利要求1所述的半抗原載體偶聯物在製備用於治療或預防尼古丁成癮用的藥劑中的用途。
6.針對權利要求1所述的半抗原載體偶聯物產生的抗體。
7.權利要求6所述的抗體的功能性片段。
8.一種產生抗體的方法，其特徵在於，該方法包括用權利要求1所述的半抗原載體偶聯物免疫宿主哺乳動物。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述抗體是單克隆抗體。
10.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述抗體是多克隆抗體。
11.一種疫苗組合物，它含有權利要求1所述的至少一種偶聯物。
12.一種用於檢測樣品中尼古丁的存在的試劑盒，它包括權利要求6所述的抗體。
全文摘要
一種新穎半抗原－載體偶聯物，能在體內誘導產生特異性結合尼古丁的抗體。這些偶聯物含有偶聯於免疫原性載體蛋白質的尼古丁半抗原。這種新穎的偶聯物保留了尼古丁的手性，呈天然(S)－(－)狀，具有良好的穩定性。可將這種偶聯物用於配製主動免疫的疫苗，用於預防或治療尼古丁成癮。對該尼古丁半抗原－載體偶聯物應答反應中產生的抗體可用於被動免疫。給予這些抗體來預防和治療尼古丁成癮。
文檔編號A61K39/395GK1768861SQ200510092438
公開日2006年5月10日 申請日期1999年12月1日 優先權日1998年12月1日
發明者S·恩尼法, A·I·法託姆, R·B·納索 申請人:Nabi生物製藥公司