用於轉基因油菜(籽)實時pcr檢測的引物序列和試劑盒的製作方法

2023-10-09 07:06:54 6

專利名稱：用於轉基因油菜(籽)實時pcr檢測的引物序列和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因的擴增與檢測。
背景技術：
隨著轉基因產品不斷商品化，其安全性問題一直被世人關注，並不斷發生爭議。為了保障人類的身體健康，消除消費者顧慮，有利於國際貿易和商品流通，以歐盟為代表的很多國家，在經歷了短暫的爭議後，對此類特殊產品都制定出安全管理條例，以便嚴格管理。歐洲、日本等多國還制定了相應的限量法規。我國農業部也於今年出臺了轉基因產品的管理辦法。然而，要使消費者了解或接受轉基因產品，各項法規能得以實施，除了給以相關信息及增加透明度外，關鍵問題是能夠有相應的科學檢測方法來分析與鑑別傳統產品與轉基因產品。尤其面對國內外貿易中對轉基因產品的限量要求，更應有相應的、準確地定量方法對轉基因產品，尤其是轉基因食品進行定性、定量檢測。在目前國內外常用的轉基因產品的檢測方法中，主要是以核酸為基礎的PCR檢測方法。PCR方法又分為定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶鏈式反應PCR已廣泛應用於基於核酸的各個研究和臨床診斷等領域，該方法使用兩段(約17～20多個核苷酸)寡核苷酸作為反應的引物，這兩段寡核苷酸引物的序列應不發生互補作用。但它們可和稱為模板的待測DNA兩條鏈上在一定的位點分別發生互補。反應液包括含有鎂離子的反應緩衝液、4種單核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通過溫度的變化，DNA變性及退火，而合成兩個互補位點之間的DNA片斷。這樣的反應反覆進行，使第一個循環產生的DNA片斷得以擴增。經25～30個循環，擴增倍數達106。用該方法檢測轉基因產品整個過程繁雜，操作步驟多，而且需要PCR後處理，如瓊脂糖凝膠電脈和溴化乙錠染色，紫外光觀察結果或通過聚丙烯醯胺凝膠電泳或銀染檢測，不僅需要多種儀器，而且費時費力，所使用的染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實驗過程又給汙染和假陽性提供了機會，嚴重影響對結果的正確判斷。

發明內容
本發明的目的是克服上述不足問題，提供一種用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列和試劑盒，用於轉基因產品定量檢測的引物也可以對轉基因產品進行定性檢測，靈敏度高、避免交叉汙染造成假陽性，使檢測方法操作簡單、省時省力、結果可靠。
本發明為實現上述目的所採用的技術方案是用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列，用於檢測轉基因油菜(籽)RT73品系外源結構基因的上遊引物序列是5』-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3』，該引物的最小序列是5』-cca tca tact-3』；下遊引物序列是5』-gct tat acg aag gca agaaaa gga-3』，該引物的最小序列是5』-aag gca a-3』。
用於檢測轉基因油菜(籽)MS8品系外源結構基因的上遊引物序列是5』-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3』，該引物的最小序列是5』-aat ttt ctc-3』；下遊引物序列是5』-gcc ttt tct tat cga cca tgt act c-3』，該引物的最小序列是5』-at cga cca-3』。
用於檢測油菜(籽)內源基因(FatA)的上遊引物序列是5』-ggt ctc tcagca agt ggg tga t-3』，該引物的最小序列是5』-gca agt g-3』；下遊引物序列是5』-tcg tcc cga act tca tct gta a-3』，該引物的最小序列是5』-ga act tc-3』。
按上述引物序列製成的用於轉基因油菜(籽)及其加工產品實時PCR檢測的SYBR？Green螢光體系。
SYBRGreen染料能選擇性結合雙鏈DNA，並且由此而發出螢光，PCR擴增產物隨著擴增循環次數的增加的同時，螢光信號隨之也增強，因此，通過實時追蹤螢光信號的強度就能精確計算出由單鏈寡核甘酸引物擴增的雙鏈產物的數量，對於靶基因鑑定或少量反應時，SYBRGreen染料是一種理想的化學試劑。更重要的是SYBRGreen染料在PCR反應中所要求的極端溫度下同樣十分穩定，通過分析目的產物的熔解曲線，使用SYBRGreen染料可有效區別特異性產物、非特異性產物以及引物二聚體，以彌補其特異性差的缺點。SYBRGreen螢光體系不僅簡單實用，而且其特異性隨著所採用PCR引物的精心設計和篩選而得以保證，完全可以和螢光探針PCR媲美，具有較高的實用價值。
按上述引物序列製成的用於轉基因油菜(籽)及其加工產品實時PCR檢測的試劑盒。
本發明的有益效果是本發明通過檢測作物本身所具有的內源參照基因(Endogenous Reference Gene)，如油菜(籽)FatA內源基因，一方面可以測定檢查模板DNA的質量，另一方面可以測定樣品中轉基因作物和非轉基因作物的總DNA模板量；通過檢測轉基因作物中轉入的外源基因，如RT73品系外源結構基因、MS8品系外源結構基因，一方面可以測定是否有轉基因成分存在，另一方面可以測定樣品中轉基因作物的DNA模板量，通過建立轉基因作物標準參照樣品的內源參照基因與外源基因Ct值之差(ΔCt)與轉基因成分百分含量的標準曲線，可以計算出樣品及其加工產品中轉基因成分的百分含量。用於轉基因產品定量檢測的引物也可以對轉基因產品進行定性檢測，具有靈敏度高、避免交叉汙染造成假陽性的優點。本發明實時PCR技術採用完全閉管檢測，無需PCR後處理，避免了交叉汙染和假陽性。該技術巧妙地運用了PCR技術的DNA高效擴增的缺點，更重要的是SYBRGreen染料在PCR反應中所要求的極端溫度下同樣十分穩定，通過分析目的產物的熔解曲線，使用SYBRGreen染料可有效區別特異性產物、非特異性產物以及引物二聚體，以彌補其特異性差，檢測技術快速和敏感，使得本方法具有操作簡單、省時省力、結果可靠和準確靈敏等優點。


圖1為本發明SYBRGreen實時PCR檢測原理示意圖。
圖2轉基因產品和非轉基因產品SYBRGreen實時PCR檢測溶解曲線圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步的詳細說明，但不限於實施例。
實施例1用於轉基因油菜(籽)RT73品系的SYBRGreen實時PCR檢測的引物序列和試劑盒，按常規引物製備合成方法製造，檢測轉基因油菜(籽)RT73品系外源結構基因(轉基因成分)。
檢測基因RT73品系的外源結構基因。
引物5』-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3』、5』-gct tat acg aag gca agaaaa gga-3』。
試劑盒應用該引物序列採用常規製法製成的用於檢測轉基因油菜(籽)RT73品系的外源結構基因的試劑盒。
實施例2用於轉基因油菜(籽)MS8品系的SYBRGreen實時PCR檢測的引物序列和試劑盒，按常規引物製備合成方法製造，檢測轉基因油菜(籽)MS8品系外源結構基因(轉基因成分)。
檢測基因MS8品系外源結構基因。
引物5』-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3』、5』-gcc ttt tct tat cga cca tgtact c-3』。
試劑盒應用該引物序列製成的用於檢測轉基因油菜(籽)MS8品系外源結構基因的試劑盒。
實施例3用於油菜(籽)SYBRGreen實時PCR檢測的引物序列和試劑盒，按常規引物製備合成方法製造，檢測轉基因油菜(籽)內源基因。
檢測基因FatA基因。
引物5』-ggt ctc tca gca agt ggg tga t-3』、5』-tcg tcc cga act tca tct gta a-3』。
試劑盒應用該引物序列製成的用於檢測油菜(籽)內源FatA基因的試劑盒。
檢測用主要儀器實時PCR儀、超淨工作檯、消毒滅菌鍋、製冰機、核酸蛋白分析儀、高速冷凍離心機，臺式小型離心機，Mini個人離心機、低溫冰箱，冷藏冷凍冰箱、純水器、雙蒸水器、旋渦震蕩器、微量進樣器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
檢測用主要試劑10×PCR緩衝液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、SYBRGreen、引物(按引物序列製成試劑盒)等。
SYBRGreen實時PCR檢驗所用引物序列如實施例1～3所述。
SYBRGreen實時PCR反應體系
SYBRGreen實時PCR的反應參數為
上機運行按預先設定的樣品擺放順序將PCR反應管依次擺放，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免物質洩漏汙染儀器，開始運行進行實時PCR反應。具體設置方法因儀器而異，應參照儀器使用說明書。
結果分析與計算定性分析基線的設置實時PCR反應結束並分析後，應設置無效基線範圍。無論採用任何螢光通道基線範圍選擇在3-20個循環；閾值設置原則以基線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，且Ct值＝40為準。
結果判斷待測樣品外源基因檢測Ct值≥40，內參照基因檢測Ct值23-30者，表明未檢出×××基因；待測樣品外源基因檢測Ct值28-34，內參照基因檢測Ct值23-30者。表明檢出×××基因。
定量分析用EXCEL或其它方法計算數據，可以創建以DNA濃度(x)對應循環數Ct值(Y)的標準曲線。對於樣品DNA的濃度，可以根據回歸方程logX＝Y-b/m計算(b為交叉點值，m為斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-內源基因Ct值。將ΔCt值代入方程，即可得出樣品中某一外源基因的相對含量。
如圖2所示，外源基因出現PCR擴增，表明該樣品檢測出了外源轉基因成分，即為轉基因產品。未出現外源基因PCR擴增，表明該樣品未檢測出外源轉基因成分。
權利要求
1.用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列，其特徵是用於檢測轉基因油菜(籽)RT73品系外源結構基因的上遊引物的最大序列是5』-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3』，最小序列是5』-cca tca tact-3』；下遊引物的最大序列是5』-gct tat acg aag gca aga aaa gga-3』，最小序列是5』-aaggca a-3』。
2.根據權利要求1所述的用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列，其特徵是用於檢測轉基因油菜(籽)RT73品系外源結構基因的上遊引物序列是5』-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3』，下遊引物序列是5』-gcttat acg aag gca aga aaa gga-3』。
3.用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列，其特徵是用於檢測轉基因油菜(籽)MS8品系外源結構基因的上遊引物的最大序列是5』-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3』，最小序列是5』-aat ttt ctc-3』；下遊引物的最大序列是5』-gcc ttt tct tat cga cca tgt act c-3』，最小序列是5』-at cgacca-3』。
4.根據權利要求3所述的用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列，其特徵是用於檢測轉基因油菜(籽)MS8品系外源結構基因的上遊引物序列是5』-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3』，下遊引物序列是5』-gccttt tct tat cga cca tgt act c-3』。
5.用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列，其特徵是用於檢測油菜(籽)內源基因(FatA)的上遊引物的最大序列是5』-ggt ctc tcagca agt ggg tga t-3』，最小序列是5』-gca agt g-3』；下遊引物的最大序列是5』-tcg tcc cga act tca tct gta a-3』，最小序列是5』-ga act tc-3』。
6.根據權利要求5所述的用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列，其特徵是用於檢測油菜(籽)內源基因(FatA)的上遊引物序列是5』-ggt ctc tca gca agt ggg tga t-3』，下遊引物序列是5』-tcg tcc cga acttca tct gta a-3』。1002 2001.7
7.根據權利要求1-6任一所述的用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列製成的用於轉基因油菜(籽)SYBRGreen實時PCR檢測的SYBRGreen螢光體系。
8.根據權利要求1-6任一所述的用於轉基因油菜(籽)實時PCR檢測的引物序列製成的用於轉基因油菜(籽)SYBRGreen實時PCR檢測的試劑盒。
全文摘要
用於轉基因油菜(籽)SYBR
文檔編號C12Q1/68GK1699600SQ200510046408
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月9日 優先權日2005年5月9日
發明者曹際娟, 劉善斌, 趙昕 申請人:曹際娟, 劉善斌, 趙昕