人肝素酶的rna幹擾靶點序列及其應用的製作方法

2023-10-09 18:38:29

專利名稱：人肝素酶的rna幹擾靶點序列及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，具體涉及2個人肝素酶的RNA幹擾耙點序列， 由於這2個幹擾序列經過克隆入載體，轉入腫瘤細胞後可使腫瘤細胞中人肝素酶蛋白 在轉錄後水平表達明顯下調，從而f劃中瘤在轉移，血管生成等各方面受到明顯抑制。 因此本發明所涉及的幹擾序列可以用於審恪有關抗腫瘤的藥物。
背景技術：
1999年，澳大利亞的Parish和以色列的Voldavsky同時首次克隆並鑑定出與腫瘤轉 移密切相關的肝素酶基因(HPA) 。 HPA定位於4號染色體q213位置，其cDNA包含的 長度為1629bp的開放閱讀框編碼含543個胺基酸分子量為61.2KD的多肽。其表達產物 屬內P-D-葡萄豐臘酶，能特異性識別、切斷硫翻幹素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS) 側鏈。HSPG是細胞外基質(ECM)和基底膜(BM)的主要成分之一，在組織構成、 血管形成和細胞粘附等諸多方面發揮重要的生理作用。高度水化的HS側鏈及所帶的負 電荷形成結構緻密的選擇性分子篩，是阻止腫瘤細胞侵襲擴散的首要屏障之一，同時， 伸展的HS側鏈還儲備著大量生長因子、趨化因子和酶類等生物大分子。肝素S每促腫瘤 轉移的機制一方面在於它能糊軍HSPG，破壞ECM和BM的完整性，另一方面又間接地 釋放和活4toS結合的多種生長因子，如bFGF、 EGF等，促進腫瘤血管形成，為發生轉 移的腫瘤細胞在局部定植提供營養。HPA基因mRNA在脾臟、淋巴結、胸腺、夕卜周血 白細胞、骨髓及胎肝等免疫組織中均可檢測到，而在除胎盤以外的成熟非免疫組織(如 心臟、骨骼肌及胰腺等)均不表達，但在轉移性的惡性腫瘤細胞中普遍存在。包括肝 細胞癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、胰腺癌、多發性骨髓瘤、 急性髓細胞樣白血病等等。所有這些研究發現意味著人肝素酶可能是我們在腫瘤治療 過程中一個新靶點。由於肝素酶在惡性腫瘤中的廣泛表達的特性，人們一直在利用各 種方法尋找其抑制劑。通過構建攜帶反義全長人肝素酶cDNA腺病毒載體，人們發現 人肺癌AS49細胞的體外侵襲能力和體內轉移能力都被特異性抑制。同樣的發現還有在 黑色素瘤細胞的轉移和侵襲方面。RNAi主要;M過在轉錄後水平阻斷基因表達，藉此劍門可以研究基因的功能。 同時它為我們提供了一個治療疾病的新途徑。比如，我們可以按擬定的方式來關閉非必需或致病基因的功能。隨著人們對多種生物體基因組序列了解的深入，RNAi技術 可以幫助劍門更細緻的了解複雜的生理學過程。RNAi技術與基因組學、蛋白質組學 和功能蛋白質組學密切相關，因此，人們可以利用RNAi開發更多的新藥。隨著RNAi現象的發現及其技術的不斷成熟和進步，尤其是應用與哺乳動物後。 相比傳統的基因組學技術，RAM更迅速，更直接，更高效，其在構建基因敲減動物 模型和研究遺傳疾病中的作用越來越突出。基於上述研究發現，我們通過構建shRNA載體，利用其較長久穩定的基因敲減作 用來研究肝素S每在肝癌HepG2細胞中蛋白表達情況。並且發現經過RNA幹擾後，肝 癌HepG2細胞中的HPA蛋白表達明顯下調，這表明RNA幹擾X寸肝癌HepG2細胞的 肝素酶的具有顯著的抑制作用。發明內容本發明的目的在於提供人肝素酶的2個RNA幹擾耙點序列，分別為 SEQIDNO: 1 GGCTATCTCTTCTGTTCAA SEQIDNO: 2 CTCAGTTGCTCCTGGACTAo通過這2個耙點的RNAi作用，可明顯抑制人肝素酶在腫瘤細胞中的表達，因此， 本發明的另一目的是關於所述RNA幹擾耙點序列及由其獲得的siRNA在用於製備抗腫 瘤藥物中的應用。本發明的上述2條幹擾序列，是通過網絡在線工具(www.genscript.com)篩選獲得， 篩選的原則如下1. 熱力學性質熱力爭性質不穩定的序列被篩除。2. SiRNA耙點長度預先設置為19個鹼基每個序列。3. 靶點的GC含量預先設置GC含量在40-60。/。。 GC含量低的革巴序列(60%)的耙序列的幹擾效果更好。對於GC含量高的基因，我們可以調整 GC含量的上限。4. 革巴序列的來源劍門推薦以開放閱讀框為激門選取序歹啲來源。在起始密碼子 ATG下遊50-100nt後選取效果更好。5.生物體人、鼠和兔的基因組是當前可禾鵬的。6. RNA的二級結構計算RNA二級結構和每個耙點的正義鏈和反義鏈的最小自由能。7. 重複序列去除串聯重複序列。8. 去除能觸發機體免疫反。9. BLAST/Smith Waterman搜索每一個候選序列經ilBLAST確保與特定生物體 的mRNA序列同源性小於15bp。10. AE和等級所有的候選序列在GenScript所有的算法和AE的基礎上經行排列。 並構建含幹擾片段的dsDNA，送生物公司合成，然後克隆入質粒pGenesil-l，測 序鑑定；通過穩定轉染(脂質體法，ioche公司DOTAP月旨質體)至肝癌HepG2細 胞，經G418抗性篩選後得到陽性克隆；挑取單個克隆，進行擴大培養，得到的各 組細胞分別含目的幹擾序列;Western Blot檢測鑑定各組幹擾序列對人肝素酶蛋白的 抑制效果。在發明說明書和附圖中，使用IUPAC—IUB國際生化命名委員會推薦的方式表示 鹼基(或稱核苷酸)和胺基酸的縮寫 A:腺嘌呤 T:胸腺嘧啶 G:鳥嘌呤 C:胞嘧啶dsDNA:雙鏈脫氧核糖核酸


圖l為pGenesi1-l質粒圖譜。圖2為網絡在線工具獲取前十位耙點圖。圖3為pGenesil-Hpal-l (SEQIDNO: 1)測序結果。圖4為pGenesil-Hpal-2 (SEQIDNO: 2)測序結果。圖5為pGenesil-Hpal-3 (SEQIDNO: 3)測序結果。圖6為穩定轉染後H印G2細胞的螢光表達的檢測，其中圖A、 B、 C、 D是HepG2 細胞分別轉染pGenesil-Hpal-l、 pGenesil-Hpal-2、 pGenesi1-Hpal-3 、 pGenesil-Hpal-N後可見光視野下的細胞(MX200);圖Al、 Bl、 Cl、 Dl分別是與A、 B、 C、 D同視野下螢光表達(FMX200)。圖7為抗性篩後陽性克隆的螢光檢測，其中圖A、 B、 C、 D分別是轉染pGenesil-Hpal-l、 pGenesil-Hpal-2、 pGenesil-Hpal-3 、 pGenesil-Hpal-N後經G418抗性篩 選3周後可見光視野下克隆(MX100);圖A1、 Bl、 C、 D1分別是與A、 B、 C、 D 同視野下螢光表達(FMXIOO)。圖8:為Western Blot檢測圖。圖9為WesternBlot定量分析圖,橫坐標l、 2、 3、 4、 5分別表示圖8中的SEQ IDNO: 2、 SEQIDNO: 1、 SEQIDNO: 3、陰性對照組和正常細胞組。
具體實施方式
以下通過具體實施例對本發明作進一步的說明，以下實施例僅用於說明本發明， 而不用於限定本發明的範圍。實施例一人肝素酶mRNA序列的獲取從國際開放共享基因庫NCBI GeneBank中查找出Al幹素酶mRNA序列謹因 ID:AF165154)如下formula see original document page 0901MGGCTGGTGGAGAAGTGATTGATTCAGTTAGATGGGATGACTACTA丌TGMTGGACGG961ACTGGTACCAGGGMGATTTTCTAMGCCTGATGTATTGGACATTT丌ATTTGATCTGTG則CAAMAG丌TTCCAGGTGGTTGAGAGGACGAGGCCTGGCAAGMGGTCTGGTTAGGAGM1081ACMGGTCTGGATATGGAGGCGGAGCGCCGTTGCTATCCGACACCTTTGCAGCTGGCTTT1141ATGTGGCTGGATMATTGGGCCTGTGAGCCCGMTGGGMTAGMGTGGTGATGAGGCM1201GTA丌G丌TGGAGCAGGAMGTAGCATTTAGTGGATGAMACTTCGATCCTTTACCTGAT1261TATTGGGTATGTC丌GTGTTCMGAMTTGGTGGGGAGGAAGGTGTTMTGGCAAGCGTG1321CMGGTTGMAGAGAAG6MGCT職GTATACCTTGATTGCACAMCACTGACMTCCA訓AGGTATAMGMGGAGA丌TMGTCTGTATGCCATAMCCTCCATMTGTCACCMGTAC1441TTGCGGTTACCCTATCCTTTTTCTMGMGCMGTGGATAMTAGCTTCTMGACCTTTG1501GGACCTGATGGATTAC丌TCGMATCTGTGCMGTCMTGGTGTMCTCTAMGATGGTG1561GATGATCAMCC丌GCCACCTTTMTGGAAAAACCTCTCCGGGCAGGMGTTCACTGGGC1621TTGCGAGC丌TCTGATATAGTIIIIIIGTGATMGAMTGCCAMG丌GCTGCTTGCATC1681TGAAMTAMATATACTAGTCCTGAAAAMAAAAAAAMAAAM幹鵬列的設計鵬匿genscript. can網站在線siRNA革巴點設計工具進行分析(具體原則貼)， 得到前10位的耙點(圖2)。選擇NOl (SEQIDNO: 1) ， N03 (SEQIDNO: 3) ， N06 (SEQIDNO: 2)為的目的序列。再設計一組無關序列作為陰t，照，具體序列 為:5 ， -ACTACCGTTGTATAGGTGT-3，。 實施例三載體的構建構建01igo單鏈，在正義和反義鏈之間連結Loop環，在SEQEDNO: 1的A鏈的 5'端加上BamH I酶切位點，3，端加上終止密碼子，並在與其互補的B鏈5，端加上Hind III酶切位點(如下表所示)。BamH I酶切位點及巡Loop環W慈終丄卜.密碼子SEQ ID NO: IB 3'-GCAACTTGTCTTCTC丁ATCGG AGTTCTGC CCGATAGAGAAGACAAGTT AAAAA A 77Q^l-5'然後進行人工合成後，將SEQIDNO: 1的A鏈與B鏈、退火連成雙鏈。同樣的 方法應用於SEQIDNO: 2和SEQIDNO: 3鏈及陰性對照鏈。BamH I和HindIII雙酶切質粒pGenesi1-1 (質粒圖譜如圖1)，然後將雙鏈DNA克隆至質粒pGenesi1-1， 送公司測序鑑定(圖3、圖4、圖5)。各質粒分別命名為pGenesil-Hpal-l (SEQIDNO: 1) 、 pGenesil畫Hpal-2 (SEQIDNO: 2) 、 pGenesil-Hpal-3 (SEQIDNO: 3) 、 pGenesil陽 Hpal-N (陰十頓照)。 實施例四穩定轉染、抗性篩選及擴大培養將各構建好的載體用脂質體法分別穩定轉染至肝癌H印G2細胞，12小時後更換無 血清DMEM培養基為含5%胎牛血清的DMEM高糖培養基。48小時後觀察各組細胞螢光表 達情況(圖6)，轉染效率大約為20%-30%。然後各組細胞均加G418進行抗性篩選(G418 濃度為300ug/ml) ， 3周後形成陽性克隆(圖7)。無菌條件下各組均挑取單個克隆於 24孔板中進行擴大培養。各組細胞分別命名為pGenesil-Hpal-l/ H印G2、 pGenesil-Hpal-2/ H印G2、 pGenesil-Hpal-3/ H印G2、 pGenesil誦Hpal-N/ H印G2。 實施例五Western Blot檢測各組蛋白的表達情況在100ml培養瓶中培養正常HepG2細胞和分別轉染pGenesil-Hpal-l 、 pGenesil-Hpal-2、 pGenesil-Hpal-3、 pGenesil-Hpal-N並經抗性篩選後的HepG2細胞。待細胞 匯合率達到80-90%時，用蛋白提取液分別處理各組細胞，收集總蛋白；BCA法定量 後SDS-PAGE電轉膜；免疫抗體反應；最後化學增強發光法(ECL)顯帶；以GAPDH 為內參照。(圖8)用Quantity One軟體對Western Blot檢測圖進行分析。結果發現3條幹擾IIX寸人 肝素酶蛋白的表達均有抑制作用，抑制效率分別達到SEQIDNO: 1幹擾序列(57%)、 SEQIDNO: 2幹iW歹U (71%) 、 SEQIDNO: 3幹擾序列(43%)。根據對人肝素酶蛋白的表達抑制效率，選擇SEQIDNO: l和SEQIDNO: 2為篩選後的幹擾耙點序列。
權利要求
1. 人肝素酶RNA幹擾靶點序列，包含SEQ ID NO1和SEQ ID NO2核苷酸序列。
2.針對權利要求1所述的RNA幹J贈巴點序列獲得的siRNA。
3.權利要求1戶;M的AI幹素酶RNA幹J贈巴點序列在制Mi^中fK物中的應用。
4.權利要求2所述的siRNA在製備抗癌藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了人肝素酶的2個RNA幹擾靶點序列，分別為SEQ ID NO1 GGCTATCTCTTCTGTTCAA SEQ ID NO2 CTCAGTTGCTCCTGGACTA。通過這2個靶點的RNAi作用，可明顯抑制人肝素酶在腫瘤細胞中的表達，抑制效率分別達到了71％和57％。因此，所述RNA幹擾靶點序列及由其獲得的siRNA可用於製備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61K48/00GK101255418SQ200710078659
公開日2008年9月3日 申請日期2007年6月27日 優先權日2007年6月27日
發明者楊仕明, 震 熊 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院