一種檢測l-抗壞血酸的方法

2023-09-23 21:36:20 5

專利名稱：一種檢測l-抗壞血酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學傳感器的製備以及用該傳感器對L-抗壞血酸的測定。
背景技術：
L-抗壞血酸(AA)，即維生素C，廣泛存在於食品、藥物及人體中，是維持生命的重要成分之一，但人體不能自身合成。AA在人體的生命過程中扮演了極其重要的作用，它可以清除人體內有害的自由基，提高人體對鐵的吸收；將膽固醇轉化為膽汁酸，使高膽固醇血症患者的膽固醇下降；可促進膠原蛋白抗體的合成，具有抗癌的作用；並參與神經介質、激素的生物合成。AA還參與人體內多種反應，在體內的氧化和還原作用以及細胞呼吸中起重要作用。研究表明，一個成人每天需要攝入AA的量約為70-90mg，AA的缺乏可導致多種疾病， 如壞血病、免疫力低下、感冒，抑鬱症、甚至是癌症。但是攝入過量的AA也會給身體帶來損害，患者會出現尿道結石、腹瀉、胃痙攣等症狀。AA含量高低常作為某些疾病診斷及營養分析的重要指標，但AA極易氧化失效，而且在某些食物中其含量較低，因此研究一種快速，靈敏，廉價的AA檢測方法是十分有必要的。目前對AA的檢測方法主要有有經典的碘量法，火焰原子吸收光譜、液相色譜法、分光光度法，還有常用的庫侖法、常規極譜法、螢光光度法、 化學發光法、液相色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法。這些方法中有的要求的實驗條件和操作技術較高，而有些方法步驟煩瑣，不利於快速分析。因此開發價格便宜，操作簡單，而靈敏度又較高的AA分析方法具有重大的實際意義。電化學傳感技術以其操作簡單，成本低，備檢測的樣品不需經過預處理可直接測量；電極響應快，需較短時間；選擇性、靈敏度較好； 穩定性和抗幹擾強，而具有良好的應用前景。

發明內容
針對現有檢測技術的缺點，本發明提供了一種採用L-半胱氨酸/殼聚糖修飾的電化學傳感器快速測定AA含量的方法。L-半胱氨酸是天然胺基酸中唯一具有活潑-SH基團的化合物，同時還含有同樣活潑的-NH2，具有良好的電化學活性，因而對其電化學特性研究具有十分重要的意義。L-半胱氨酸能和一些離子發生螯合作用，使得L-半胱氨酸修飾電極在化學分析和生物分析中具有廣泛的應用。殼聚糖，是由甲殼素進一步脫乙醯化後得到的線性、天然含氨基的聚糖，在自然界中含量豐富，成膜性好。其分子內具有豐富的-NH2和-OH，從而使得殼聚糖對許多離子、有機物具有離子交換、離子螯合、吸附等作用。因而在分析領域中得到廣泛應用，尤其是作為活性檢測物質製備的各種修飾電極，性能優越。但是殼聚糖的選擇性吸附能力不強，製備出的修飾電極缺乏良好的抗幹擾性。自組裝膜技術是活性分子通過化學鍵自發吸附在異相界面上而形成的有序分子組裝體系，可以在分子水平上按人們預期的目標進行設計。自組裝膜具有均勻一致、高密堆積和低缺陷等優點，並可按預先設計，通過精確的化學控制獲得特定的功能，具有超分子的結構及界面性質。在電極表面構築自組裝膜，將擴充修飾電極的應用範圍，在電催化、分子識別、光電轉換、化學及生物傳感器等方面具有顯著的優點和廣泛的應用前景。本發明人通過對殼聚糖和L-半胱氨酸的研究，經過大量的實驗，得出了採用L-半胱氨酸和殼聚糖複合起來製備電化學傳感器(工作電極)的思路，本發明採用自組裝法，製得了 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學傳感器(工作電極)。該傳感器既克服了殼聚糖對離子的選擇性吸附能力不強的缺點，也彌補了胺基酸不穩定、易脫落的劣勢，充分發揮了二者各自的優勢，增強了對離子的檢測能力，並充分發揮了自組裝技術製備簡便、穩定可靠、識別性高的優點，製得了具有較高靈敏度和穩定性的電化學傳感器。一種檢測L-抗壞血酸的方法，採用基於L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的工作電極的電化學傳感器對溶液中L-抗壞血酸的濃度進行測定，步驟如下(1)將待測L-抗壞血酸加入乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中，以此作為電解液；控制PH 為 5. 0-5. 4 ；(2)以L-半胱氨酸/殼聚糖修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為輔助電極，置於⑴中所述的電解液中，電化學測試。電解液中L-抗壞血酸濃度為1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L的範圍內峰電流成良好線性關係，檢出限為4. 3X 10_6mOl/L ；電解液pH較好為5. 0。本發明是通過以下措施實現的電化學傳感器的工作電極結構為在玻碳電極基底表面有一層L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；其製備步驟如下1.進行玻碳電極預處理，先用拋光粉對玻碳電極進行打磨、拋光，然後對玻碳電極進行超聲清洗，得到基底表面光潔的玻碳電極；2.將殼聚糖和L-半胱氨酸加入到醋酸溶液中，不斷攪拌使之溶解充分；其中， 殼聚糖的含量為0. 5 0. 7wt%, L-半胱氨酸的含量為0. 3 0. 5wt% ；3.將預處理好的玻碳電極侵入2所製得的溶液中，室溫下自組裝3-7小時；4.將玻碳電極取出並用蒸餾水清洗，以去除多餘的L-半胱氨酸和殼聚糖，室溫下晾乾，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的AA電化學傳感器的工作電極。5.將待測AA標準溶液加入pH為5. 0的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中，作為電解液，放入電解池中，並以以L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為輔助電極，置於電解液中，電化學測試。每次掃描結束，將三電極置於空白底液中循環掃描至無峰，用二次蒸餾水衝洗，濾紙吸乾後即可進行下一次掃描，這樣可保持電極良好的穩定性和重現性，實驗均在室溫下進行。玻碳電極包括玻碳基底，玻碳基底表面吸附有L-半胱氨酸/殼聚糖響應膜，玻碳基底與一電極引線相連，電極引線外側包覆有絕緣層。本發明的電化學傳感器具有快速、靈敏、抗幹擾能力強的優點。此外本發明採用自組裝法將活性檢測物質L-半胱氨酸和殼聚糖修飾到電極表面，電化學傳感器(工作電極) 的製備簡便、成本低廉。


圖1為本發明玻碳工作電極結構示意圖；圖2為在不同pH乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中，1. 5X 10_3mol/LAA的峰電流；圖3為本發明在不同修飾電極下1.5X10-3mol/L AA的循環伏安曲線，底液pH為 5的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液，a裸電極，b聚糖修飾電極，cL-半胱氨酸修飾電極，dL-半胱氨酸/殼聚糖修飾電極；圖4為不同AA濃度下的線性伏安曲線，底液pH為5的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液，其中的小圖為以濃度為橫坐標，峰電流為縱坐標作的標準曲線，其中，a Omol/L, b 1.0Xl(T5mol/L，c 8. 0 X 10_5mol/L, d 1 X l(T4mol/L，e2. 0 X ΙθΛιοΙ/L，f 5. 0 X l(T4mol/L，g 8. OX l(T4mol/L，h 1.0X 10_3mol/L, i2. 0X l(rtiol/L。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步闡述。實施例1本電化學傳感器的製備方法為(1)用拋光粉打磨玻碳電極，使其基底表面平整光潔，然後用超聲(頻率53KHZ，溫度25°C )清洗其表面，得到預處理的玻碳電極；(2)將1. Og殼聚糖和0. 6gL-半胱氨酸加入到200ml體積分數為1 %的醋酸溶液中，攪拌使它們充分溶解；(3)將預處理的玻碳電極浸入步驟(2)所製得的溶液中，室溫下自組裝3小時，使殼聚糖和L-半胱氨酸溶液自組裝到電極基底表面上，形成L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)用去離子水清洗浸泡的玻碳電極，去除多餘的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學傳感器。實施例2本電化學傳感器的製備方法為(1)用拋光粉打磨玻碳電極，使其基底表面平整光潔，然後用超聲清洗其表面，得到預處理的玻碳電極；(2)將1. 4g殼聚糖和1. OgL-半胱氨酸加入到200ml體積分數為1 %的醋酸溶液中，攪拌使它們充分溶解；(3)將預處理的玻碳電極浸入步驟(2)所製得的溶液中，室溫下自組裝5小時，使殼聚糖和L-半胱氨酸溶液自組裝到電極基底表面上，形成L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)用去離子水清洗浸泡的玻碳電極，去除多餘的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學傳感器。實施例3本電化學傳感器的製備方法為(1)用拋光粉打磨玻碳電極，使其基底表面平整光潔，然後用超聲清洗其表面，得到預處理的玻碳電極；(2)將1. 2g殼聚糖和0. SgL-半胱氨酸加入到200ml體積分數為的醋酸溶液中，攪拌使它們充分溶解；(3)將預處理的玻碳電極浸入步驟( 所製得的溶液中，室溫下靜置7小時，使殼
5聚糖和L-半胱氨酸溶液自組裝到電極基底表面上，形成L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)用去離子水清洗浸泡的玻碳電極，去除多餘的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學傳感器。將待測AA標準溶液加入pH為5. 0的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中，作為電解液，放入電解池中，並以以L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬電極為輔助電極，置於電解液中，電化學測試。每次掃描結束，將三電極置於空白底液中循環掃描至無峰，用二次蒸餾水衝洗，濾紙吸乾後即可進行下一次掃描，這樣可保持電極良好的穩定性和重現性，實驗均在室溫下進行。玻碳電極包括玻碳基底，玻碳基底表面吸附有L-半胱氨酸/殼聚糖響應膜，玻碳基底與一電極引線相連，電極引線外側包覆有絕緣層。見圖1。本發明具有靈敏度高、選擇性高的優點。下面通過電化學測試的結果闡述本發明的優點圖2為在不同pH條件下AA的峰電流，測定條件電解液為不同pH的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液(0. lmol/L)，AA濃度為1. 0 X 10_4mOl/L，測定方法為循環伏安法，電位掃描範圍-0. 2 IV，掃描速度100mV/S，由圖可以看出，在pH為5. 0的條件下峰電流響應最好；圖3為在不同修飾電極下AA的循環伏安曲線。測定條件電解液為pH5. 0的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液(0. lmol/L)，AA濃度為1. 5 X 10_3mol/L，測定方法為循環伏安法電位掃描範圍-0. 2 IV，掃描速度100mV/S，由圖可見L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的玻碳電極的峰電流最大，而裸電極上幾乎沒有峰電流響應，L-半胱氨酸修飾電極和殼聚糖修飾電極雖然有峰但電流響應很小，說明經過L-半胱氨酸/殼聚糖修飾後的電極兼具了二者的優勢，能夠更好地對AA產生電化學響應，提高了傳感器的靈敏度；圖4為不同AA濃度下的線性伏安曲線，測定條件電解液為pH5. 0.的乙酸-乙酸鈉緩衝溶液(0. lmol/L)，測定方法為線性伏安法掃描範圍-0. 2 IV，掃描速度100mV/S。 可以看出峰電流在AA濃度為1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L的範圍內成良好線性關係，檢出限為4. 3X 10_6mol/L(CL = 3Sic/X ；CL為檢出限，si為樣品測量讀數的標準偏差，c為樣品含量值，X為樣品測量讀數平均值。)。
權利要求
1.一種檢測L-抗壞血酸的方法，其特徵在於採用基於L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的工作電極的電化學傳感器對溶液中L-抗壞血酸的濃度進行測定，步驟如下(1)將待測L-抗壞血酸樣品加入乙酸-乙酸鈉緩衝溶液中，以此作為電解液；控制電解液 PH 為 5. 0-5. 4 ；(2)以L-半胱氨酸/殼聚糖修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極， 鉬電極為輔助電極，置於(1)中所述的電解液中，電化學測試。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於電解液中L-抗壞血酸濃度為4. 3X 10_6mol/L 2. OX 10_3mol/L，調整電解液pH為5. 0。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於電解液中L-抗壞血酸濃度為1. OX 10_5 2. OX 10_3mol/L。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於電化學傳感器的工作電極結構為在玻碳電極基底表面有一層L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；其製備步驟如下(1)打磨拋光玻碳電極，使其基底表面平整光潔，超聲清洗其表面，得到預處理的玻碳電極；(2)將殼聚糖和L-半胱氨酸加入到醋酸溶液中，不斷攪拌使之溶解充分；其中，殼聚糖的含量為0. 5 0. 7wt%, L-半胱氨酸的含量為0. 3 0. 5wt% ；(3)將⑴所得到的玻碳電極侵入(2)所製得的溶液中，室溫下自組裝3-7小時，得到 L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；(4)將(3)中製得的L-半胱氨酸/殼聚糖修飾玻碳電極用蒸餾水清洗，去除多餘的 L-半胱氨酸和殼聚糖，室溫下晾乾，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學傳感器的工作電極。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於醋酸溶液的體積濃度為1_2%。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於打磨拋光玻碳電極的過程是採用拋光粉對玻碳電極進行打磨、拋光。
全文摘要
本發明公開了一種檢測L-抗壞血酸的方法，採用新型L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的L-抗壞血酸(AA)電化學傳感器，包括玻碳電極，玻碳電極上有L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜，能對低含量的AA進行檢測。本發明公開了傳感器的製備方法，包括玻碳電極預處理；殼聚糖和L-半胱氨酸醋酸溶液的製備；將預處理的玻碳電極浸入所製得的溶液中，室溫下自組裝5～7分鐘，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝膜；洗去玻碳電極上多餘的L-半胱氨酸和殼聚糖，得到L-半胱氨酸/殼聚糖自組裝修飾的電化學傳感器。本傳感器對AA檢測其具有製備簡便、快速、靈敏的優點，AA濃度為1.0×10-5～2.0×10-3mol/L的範圍內峰電流成良好線性關係，檢出限為4.3×10-6mol/L。
文檔編號G01N27/26GK102375008SQ20101026178
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月20日 優先權日2010年8月20日
發明者侯保榮, 龐雪輝, 張潔, 解建東, 譚福能, 隋衛平, 魏琴 申請人:中國科學院海洋研究所