官能化納米膜及其製備方法和用途與流程
2023-09-24 05:12:15 2
本發明涉及官能化納米膜、該官能化納米膜的製備方法及其用途。
背景技術：
透射電鏡術(tem)是用於分子和分子聚集體的結構表徵，尤其是用於結構生物學的有力方法。為了通過tem確定樣品的結構，將其沉積在足夠薄的使電子透明的膜上。負染色的生物樣品的tem被廣泛用於篩選樣品以及獲取初步信息。為使生物樣品在電子束的輻射損害中保持穩定，往往在低溫下(冷凍tem)將它們包埋在非常薄的玻璃冰薄膜中。
傳統的無定形碳膜經常被用作玻璃化的樣品的冷凍tem的支持膜，其厚度為10-15nm。更薄的碳膜機械性能不穩定。更糟糕的是，該無定形碳膜的導電性隨著溫度的下降而下降。這對在液態氮或液態氦的溫度下研究樣品的冷凍tem來說尤其重要，以致薄的碳膜變得完全電絕緣。由於這些不良的電子和機械性能，在這些溫度下的樣品圖像遭受到非彈性散射、靜電充電和光束引起的運動的損害，嚴重限制了可達到的解析度(r.henderson,ultramicroscopy1992,46,1)。儘管已開發出直接電子探測器，以實現對光束引起的運動的校正，但樣品仍然是最關鍵的部分。
另外，在常規的支持膜上的樣品沉澱是相對沒有選擇性地進行的，因此，在研究前，必須對樣品進行富集/純化。對於蛋白質和蛋白質複合物的情況，樣品的富集/純化常常因為低表達率以及純化足夠量的用於冷凍tem的材料存在困難而受阻。如果在樣品製備中必須使用洗滌劑，例如在溶解膜蛋白的單粒子冷凍tem中就存在這種情況，洗滌劑可導致蛋白膜由於減小的表面張力而從有孔的碳膜的孔上脫離，該事實使問題更為嚴重。
除無定形碳以外的一些新的最先進的支持膜材料在現有技術的領域中已被知曉。其中，原始石墨烯和石墨烯氧化層已被嘗試作為無機和生物樣品的tem的支持膜材料(j.c.meyeretal.,nature2008,454,319；r.s.pantelicetal.,j.struct.biol.2011,174,234；r.s.pantelicetal.,solidstatecommun.2012,152,1375；r.s.pantelicetal.,j.struct.biol.2010,170,152)。而石墨烯氧化層為親水的，因此比原始石墨烯更有利於含水生物樣品的製備，但是，石墨烯氧化層僅表現出非常低的導電性，尤其在低溫下。另一方面，原始石墨烯非常疏水，阻礙了其作為冰包埋生物樣品的冷凍tem的支持膜的用途以及其化學官能化。
另外一個嚴重的問題是蛋白質與支持膜的非特異性結合。抑制這種非特異性結合的非常確定的方法是形成例如由低聚乙二醇(oeg)單元組成的生物排斥性的水凝膠層。這些單元可以通過不同的接枝策略被附著在表面上。在目前的研究工作中，薄的碳納米膜已被蛋白排斥性的聚乙二醇層官能化了(n.etal.,acsappl.mat.interf.2013,5,5129)。
為選擇性地將樣品結合在這種生物排斥性層上，可以引入選擇性分子標記。為此，通常使用具有氨基或者羧酸基團的oeg分子來進一步官能化水凝膠表面。
通過選擇性分子標記使樣品與tem支持膜選擇性結合的嘗試僅有少數。目前，蛋白質已被結合在脂質層、用親和基團官能化的2d蛋白晶體或者抗體，這些脂質層、用親和基團官能化的2d蛋白晶體或者抗體又被物理吸附到常規的碳支持膜上(d.f.kellyetal.,j.mol.biol.2008,382,423；g.sharmaetal.,j.struct.biol.2013,181,190；b.g.hanetal.,j.struct.biol.2012,180,249；y.guimeietal.,j.struct.biol.2014,187,1)。這種方法的缺點在於：脂質層和2d蛋白晶體對洗滌劑的敏感性使它們與例如洗滌劑-溶解膜蛋白的結構分析不相容。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供官能化納米膜，克服現有技術中，尤其是目前的生物tem的支持膜中的缺陷。特別地，本發明還將提供可被用作新型支持膜的官能化納米膜，促進和加快通過tem對生物樣品的高解析度的結構分析，並能夠從原始混合物中直接和選擇性地分離標記的生物分子，從而使樣品可以通過負染色tem進行研究或者直接通過冷凍tem進行玻璃化和研究。
進一步，本發明還將提供可釋放冷凍tem的全部潛力的官能化納米膜，這意味著將提供超薄和高度均勻的官能化納米膜，其儘量減小了測量過程中電子的非彈性散射，具有導電性，並具有用於選擇性結合生物分子樣品以簡化樣品製備的特異性生物識別位點。
本發明的另一個目的在於提供一種製備官能化納米膜的製備方法。
本發明的第一個目的通過官能化納米膜實現。該官能化納米膜包括：
a)包括納米材料的第一層；
b)包括生物排斥性材料的第二層，該第二層被附著在該第一層的至少一個面上；以及
c)親和基團，其附著在該第二層。
此處所使用的術語「生物排斥性材料」意味著排斥生物分子，如胺基酸、脂質、碳水化合物、蛋白質、多糖和/或核酸，的材料或化合物。
在本申請中，術語「官能化」應被理解為納米材料、生物排斥性材料和/或親和基團各自的功能基團之間的化學鍵，如共價鍵、配位鍵、氫鍵、離子或分散(範德華)鍵的形成，優選為共價鍵的形成。
術語「親和基團」意思是與特定的樣品選擇性地結合的分子殘基或化學基團。這種特定的(生物)識別動機可導致官能化納米膜和各樣品之間更高程度的親和力。
優選地，該第一層由納米材料組成。
優選地，該納米材料用作機械支持。
更優選地，該納米材料為納米膜。
優選地，該第一層的納米材料選自碳納米膜、石墨烯、石墨烯氧化物、無定形碳膜和矽納米膜、氮化矽或二氧化矽。
本發明中，「碳納米膜」由厚度小於100nm，優選為小於10nm，並優選為從有機前體所形成的納米膜組成。該有機前體優選為包括低分子芳香族化合物，如苯基、聯苯、三聯苯、萘、蒽、聯吡啶、三聯吡啶、噻吩、二噻吩、三聯噻吩、吡咯及其組合。該有機前體優選為具有如羥基、氨基或酯基的端基，表現為可能發生碳納米膜被生物排斥性材料官能化的官能團。優選地，「碳納米膜」是通過交聯作用從該有機前體的自組裝單層(sams)形成的納米膜。
本申請中，作為「矽，氮化矽或二氧化矽的納米膜」，優選使用市售的，例如由simpore生產的膜作為tem的支持材料。這些膜具有反應性si-oh基團，在其上可能發生生物排斥性材料的共價結合。
優選地，該無定形碳膜的厚度範圍為3-30nm，優選為5-15nm。
更優選為，矽、氮化矽和氧化矽的納米膜的厚度範圍為1-15nm，優選為4-6nm，更優選為5nm左右。
進一步，碳納米膜的厚度範圍優選為0.5-4nm，更優選為0.6-3nm.
在一優選實施例中，官能化碳納米膜的厚度範圍為3-25nm，更優選為3-10nm。
更優選地，該官能化納米膜材料在厚度和組成上是高度均勻的。
在一優選實施例中，該官能化納米膜為無支撐式的納米膜。
優選地，該包含在第二層的生物排斥性材料至少部分設置在第二層的表面，優選地大致組成第二層的外表面，也就是說，朝向第一層和第二層的交界面的表面。更為優選地，第二層為大致由生物排斥性材料組成。
更優選地，該生物排斥性材料由聚甘油(pg)、聚乙二醇(peg)、低聚乙二醇(oeg)、肽、蛋白質、低聚碳水化合物或兩性離子聚合物組成。
更優選地，該親和基團為選自特異性識別對，優選為螯合物/寡聚組氨酸、生物素/(鏈黴)親和素、或特異性dna/rna有義/反義對中的一種。
根據本發明，「特異識別對」由兩個分子基序組成，它們可以在包含幾種分子種類的競爭環境中區分並彼此結合。該親和基團僅由一個分子種類，如每個特定識別對的一個分子基序，組成。
根據本發明，「螯合物」為非常穩定的複合物，由多齒配體組成，優選為乙二胺四乙酸(edta)、n-氨三乙酸(nta)、或者其衍生物和陽離子，如cu2+、ni2+、fe3+以及co2+，優選為ni2+。
本發明的第二個目的通過一種製備創造性的官能化納米膜的方法實現，該方法包括以下步驟：
a)提供包括納米材料的第一層；
b)用生物排斥性材料使該第一層官能化，獲得包括該生物排斥性材料的第二層；以及
c)用親和基團使該第二層官能化。
優選地，步驟b)中的官能化通過接枝工藝進行。
更優選為，步驟c)中的官能化通過烷化、醯化或者環氧化合物開環作用進行。
優選地，由該納米材料組成的該第一層是被支持在tem網格上的納米材料。
本發明的第三個目的通過以下手段實現：將創造性的官能化納米膜作為支持膜，優選作為在tem中的支持膜，更優選作為在冷凍tem中的支持膜，用於生物分子的結構分析。
更優選地，該官能化納米膜被支持在tem網格上。
優選地，本發明可使用現有技術中已知的tem網格，但更優選的，使用純tem網格或者具有多孔碳的分層的tem網格或者具有多孔金的tem網格。
意外地，已發現該新型的超薄官能化納米膜可被作為用於生物分子的結構分析的tem支持膜，並進一步解決有關現有技術中已知的tem樣品製備的問題。其中，該超薄以及高度均勻的官能化納米膜減小了測量過程中的電子的非彈性散射，從而改進了數據收集。該官能化納米膜的用途允許標記的生物分子直接從原始混合物中分離。因此，該樣品可直接通過冷凍tem被玻璃化和研究。該創造性的官能化納米膜通過可與標記的生物分子特異性結合的親和基團實現自我區分。另外，該生物排斥性中間層防止了原混合物中不需要的成份與膜的非特異性結合。進一步地，該創造性的納米膜可在無支撐狀態也可被支撐在tem網格上使用。該新型的工程支持膜作為無支撐的納米膜具有機械穩定性，從而使玻璃化樣品穩定。
附圖說明
現通過附圖和詳細描述對本發明做進一步說明，可從中獲取進一步的特徵和優點。應當注意，以下闡述僅出於說明和描述的目的，而並非旨在窮舉或者將本發明限定在所公開的精確形式中。
圖1示意性地說明了設置在支持膜上的碳納米層的化學納米光刻；
圖2顯示了(a)具有pg作為生物排斥性材料以及edta衍生物作為親和基團的官能化碳納米膜、(b)x-射線光電子能譜(xps)、以及(c)無支撐的官能化碳納米膜的低解析度氦離子顯微鏡(him)圖像。
圖3顯示了使用官能化碳納米膜用於從細胞裂解物中原位分離/隔離合適標記的生物分子的示意圖。
圖4為負染色的組氨酸標記(his-tag)的生物分子特異性結合在pg和edta官能化的碳納米膜上的tem圖像。
圖5顯示為(a)轉移至石墨烯片的碳納米膜(cnm)以及(b)官能化cnm通過石墨烯條紋圖案化。
圖6顯示在安裝於網格上的官能化無定形碳膜上的負染色的組氨酸標記的p.furiosus(嗜熱古細菌)的熱聚體的tem圖像。
具體實施方式
圖1顯示為設置在支持材料上的cnm通過電子輻射或者極端uv(euv)光的化學納米光刻。芳族的自組裝單層(sam)的電子輻射導致其橫向交聯((a.turchaninetal.,proc.surf.sci.2012,87,108；w.geyeretal.,appl.phys.lett.1999,75,2401；a.turchaninetal.,langmuir2009,25,7342)。該交聯將自組裝單層轉化為具有一個分子的厚度的機械穩定的分子納米層，該一個分子的厚度可在0.5-3nm之間調整(a.turchaninetal.,acsnano2013,7,6489；us8,377,243b2)。在以硝基為端基的聯苯sams的化學納米光刻的情況下，可以在金上的4'-硝基-1,1'-聯苯-4-硫醇(nbpt)sam中產生交聯的以氨基為端基的區域。尤其是，硝基基團被還分別還原成可被修飾成用於製備官能化納米膜的氨基基團(us6,764,758b1)。
類似的芳族sams的交聯可以通過euv光獲得。另外，euv通過使用euv幹涉光刻(euv-il)為納米圖案化的納米膜的製造開創了新的機會。euv-il結合了平行製作工藝和10nm以下的非常高的解析度。從解析度或者吞吐量方面講，euv-il的納米圖案化能力遠超過光刻、電子束光刻和掃描探針光刻。euv-il可用於製作多種形狀的無支撐圖案化的納米膜。
無支撐的碳納米膜也可被化學官能化。在有的情況下，甚至可在碳納米膜的第二面上實現修飾。這些無支撐的雙面碳納米膜常被稱為「janus納米膜」。
圖2顯示為具有pg作為生物排斥性材料以及edta衍生物作為親和基團的官能化碳納米膜。已經顯示以氨基為端基的交聯表面不僅能通過接枝工藝表現出生物排斥性，而且可以通過醯化作用被修飾。優選地，如edta的多齒配體，如edta，被用作能夠可逆地結合ni2+離子的親和基團。圖2b顯示原始的官能化碳納米膜(頂部)、用ni2+離子孵育的該官能化納米膜(中間)、已經用edta溶液去除ni2+離子的該官能化納米膜(底部)的xps。xps分析顯示該官能化碳納米膜可逆地結合ni2+離子，這意味著樣品可逆地吸附/脫附成為可能。進一步，無支撐的pg和edta官能化納米膜從原始的金基底轉移至tem網格上。圖2c顯示為在tem網格上的無支撐的pg和edta官能化納米膜的him圖像。
該創造性的官能化納米膜可作為tem支持膜，通過生物識別反應對生物分子在其表面進行特異性固定。圖3顯示為該創造性的碳納米膜的使用構思。僅通過將官能化納米膜浸沒於原料混合物，例如，細胞裂解物，就可實現生物分子的選擇性固定。該水凝膠中間層防止了細胞裂解物組分與納米膜的非特異性結合。最終組裝適用於通過冷凍tem進行玻璃化及隨後的結構分析。
圖4顯示為特異性結合在被pg和edta官能化的碳納米膜上的負染色的組氨酸標記的生物分子的tem圖像。tem分析顯示，組氨酸標記熱聚體分子結合在官能化碳納米膜上。圖4a顯示為附著在官能化碳納米膜上的負染色的組氨酸標記的pyrococcusfuriosus(嗜熱古細菌)的熱聚體的tem圖像。圖4c顯示為對照實驗的tem圖譜。其顯示為在與未經組氨酸標記和負染色的熱聚體一起孵育後的官能化碳納米膜。除了暗色沉積物以外，未見熱聚體顆粒。
圖5顯示為可與石墨烯結合的官能化碳納米膜，以增強其導電性從而減少在tem測量時的樣品充電。圖5a顯示為官能化納米膜沉積在分別製備的石墨烯片上。由於毗鄰(如通過隧穿作用)，在碳納米膜上收集或者形成的電荷可輕易地轉移至高度導電的石墨烯片。圖5b中，在cnm的其餘部分被功能化之前，例如通過延長的電子局部處理，將部分碳納米膜轉換成石墨烯條紋。在生物分子的tem分析中，通過電接地的石墨烯條紋收集電荷。兩種策略都保持樣品電中性，並通過電荷/電荷相互作用減少散射效果。
圖6顯示在安裝於網格上的官能化無定形碳膜上的負染色的組氨酸標記的p.furiosus(嗜熱古細菌)的熱聚體的tem圖像。
實施例
1)碳納米膜(cnm)的形成
在金上，通過由電子輻射引起的4'-硝基-1,1'-聯苯-4-硫醇(nbpt)sams的交聯製備cnms。為形成sams，使用在雲母上的300nm厚的熱蒸發金膜。該基底在uv/臭氧清潔劑中清潔，用乙醇漂洗然後在氮氣流中吹乾。可使用兩種方法生成sam。任一個基底在氮氣氛圍下置於密封的燒瓶中，浸沒在～10mmol的由nbpt在脫氣、乾燥的二甲基甲醯胺(dmf)中形成的溶液中72小時。之後，樣品被用dmf和乙醇漂洗，並用氮氣吹乾。或者，在低於10-5毫巴的真空中，使nbpt從努森池蒸發至金膜上。在高真空(<5×10-7毫巴)下通過電子能量為100ev，劑量為50mc/cm2的電子流槍實現了與cnm的交聯和硝基基團到氨基基團的轉化。
2)第二層的形成(此處：為聚甘油)
處於在金-雲母基底上的cnm被沉澱到盛有10％(w/w)的由縮水甘油在乾燥的n-甲基吡咯烷酮(nmp)中形成的溶液的乾燥且潔淨的聚四氟乙烯(ptfe)容器中。在ptfe容器緊密關閉後，在烘箱中將其加熱至150℃保持10小時。冷卻後，去除膜，用nmp、水、和丙酮清洗，然後在無塵環境中乾燥。
3)用親和基團(此處：為edta)將第二層官能化
將乙二胺四乙酸二鈉鹽(na2edta×2h2o，510mg)在乾燥的二甲基甲醯胺(dmf，15ml)中分散，加入亞硫醯二氯(0.3ml)。在室溫下攪拌2小時後，加熱該混合物至80℃並維持45分鐘。冷卻後，該膜系統被立即浸入該反應混合物中以50轉/分鐘的速率搖晃2小時。然後取出該膜，並用dmf、乙醇、水和丙酮清洗。在無塵環境中乾燥該膜。
4)剝離膜系統並轉移至tem網格
使用溶解在氯苯或乙酸乙酯中的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)保護層將官能化的cnm轉移至tem網格上。該層用於在轉移過程中cnm的機械穩定化。將總共厚度約為400nm的的兩層聚合物按順序旋塗在cnm上。首先，將一層低分子量pmma(50k)，然後是一層高分子量pmma(950k)以4000轉/分鐘的速率旋轉30秒，並在90℃的熱板上固化5分鐘。通過將多層樣品中的一個邊/角稍微浸入水中，底層雲母載體與金/官能化的cnm/pmma結構相分離，從而使該多層樣品最終(在分離後)漂浮在空氣/水界面上。進一步，通過使用雲母片將樣品從水面轉移至i2/ki/h2o蝕刻浴(1:4:10)中，使金膜在15分鐘內溶解。然後將cnm轉移至純水中，以膜進行徹底清潔去除碘汙染。最後，cnm/pmma結構由目標基底tem網格捕獲，並且使用臨界點乾燥器將pmma層溶解在丙酮中從而使無支撐部件的損傷最小化。
5)在官能化cnm上的生物樣品的電子顯微術(此處：基於edta/ni2+/his-標記相互作用)
將tem格網上的官能化cnm與3μlnicl2(pbs緩衝液中含有1mg/ml的ni2+)孵育30秒，並用蒸餾水漂洗。隨後，將3μl蛋白質溶液(源自嗜熱古細菌的his標記的熱聚體，約0.2mg/ml)施加在官能化cnm上處理30秒，用蒸餾水漂洗並用1％鈾醯乙酸鹽溶液負染色。在feitecnaispirit透射電子顯微鏡中以120kv的加速電壓分析樣品。使用4k×4kccd攝像頭(gatan)拍攝圖像。
6)無定形碳膜的官能化
用氧等離子體處理金-雲母基底上的連續的無定形碳膜。使用在2至10nm範圍內的厚度確定的膜。已發現厚度在4至5nm的膜在機械穩定性和透明度之間表現出有利的平衡。類似於cnms的官能化，將在金-雲母基材上的等離子體處理的無定形碳膜沉積在裝有10％(w/w)的由縮水甘油在乾燥的nmp中形成的溶液的乾燥且清潔的ptfe容器中。在密封ptfe容器後，將其在烘箱中加熱至140℃，保持6-24小時。冷卻後，取出薄膜，在水中浸漬10分鐘，然後在氮氣流中乾燥。舉例來說，通過將基底在含0.1％(w/w)edta單酸酐的無水dmf溶液中加熱至90℃，並保持1小時，使第二層用edta基團官能化。通過改變edta單酸酐的濃度，可以改變表面的官能團負載。將官能化的無定形碳膜按照方案(見實施例4)轉移到tem網格。舉例來說，將膜轉移到多孔碳塗層tem網格。類似地，可以實現向多孔金或多孔/花邊碳塗層或純tem網格的轉移。官能化的無定形碳膜可以連接到石墨烯(如圖5中的cnm所示)以增強導電性從而減少在tem測量中的樣品充電。
7)官能化無定形碳膜上生物樣品的電子顯微術(此處：基於edta/ni2+/his-標記相互作用)
為了活化官能化無定形碳膜，3μl的1mm的naoh被加入，吸乾，並被蒸餾水洗滌一次。隨後，加入3μl0.1％niso4溶液並放置30秒。樣品被用3μl蒸餾水洗滌兩次。將3μl樣品加入網格中並放置30秒。網格用濾紙吸乾。將網格用3μl蒸餾水洗滌兩次，吸乾水分，並用醋酸鈾醯染色。在feitecnaispirit透射電子顯微鏡中以120kv的加速電壓分析樣品。
上述說明書，權利要求書和附圖中公開的特徵可以單獨地或以任何組合形式的用於以各種形式實現本發明的材料。