基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的dna測序裝置的製作方法

2023-09-24 00:29:25

專利名稱：基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的dna測序裝置的製作方法
技術領域：
本實用新型屬於DNA分子測序技術領域，具體涉及一種基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的DNA測序裝置。
背景技術：
脫氧核糖核酸(DNA)測序技術是現代生命科學研究的核心技術之一。為實現千美元人類基因組(TDG)、百美元人類基因組(HDG)目標，推進個體化疾病診斷與治療，迫切需要一種新型低成本、高通量的直接測序方法。基於納米孔的單分子測序被認為是最有希望實現上述目標的關鍵技術。截止目前，已經報導的各種基於納米孔的DNA單分子測序方法中，離子電流阻塞法提出的最早，研究也最為廣泛。這種方法的基本原理如下，測序反應腔被帶有納米孔的膜一分為二，單鏈DNA分子被加入到膜的一邊，在膜另一邊正電位電極的吸引下，帶有負電荷的聚合鏈進入納米孔，並從膜的一邊滑動到膜的另一邊，在聚合鏈穿越納米孔時對會對原有的納米孔中離子電流造成堵塞，電流會急劇下降到原電流的10%左右，研究人員通過對多聚核苷酸鏈穿越過程的穿越時間(t)、阻塞發生的間隙(At)以及阻塞電流(IB)的定量檢測來實現DNA分子測序。然而，這種納米孔離子電流阻塞法在實際應用中面臨一些根本性的問題。早期所採用的生物分子納米孔(其典型代表是a -溶血素蛋白分子(protein a-hemolysin)構成的納米孔)穩定性差、壽命短，對環境因素極其敏感，且生物分子納米孔的孔徑難以人工控制，內部孔徑僅約為1. 5nm，不適於不同核酸分子的檢測。目前普遍採用的固態納米孔(Solid-state nanopore)雖然克服了上述生物分子納米孔的缺點,但是也存在如下問題首先，固態納米孔通道長度通常為5nm以上，可以容納十多個鹼基，這一尺寸對於測序所需要的分辨單個鹼基引起的電流變化過長；其次，當單個核苷酸佔據納米孔時只有大約100個離子穿過納米孔，而4個鹼基在結構上只有數個原子的差異，這種細微的結構化差異導致的離子電流變化很微弱，以至於研究人員很難區分出每個鹼基；第三，基於固態納米孔的測序方法目前尚不能有效地控制DNA通過納米孔的速度，由於速度太快，造成了鹼基檢測識別率不高。這些問題嚴重製約了這種測序方法的實際應用。藉助於其他輔助手段的各種納米孔測序方法，如螢光標記輔助納米孔測序法、雜交輔助納米孔測序法、隧道電流輔助納米孔測序法、以及探針修飾納米孔測序法等，在本質上仍屬於間接測序方法，存在設備複雜、低速、高成本等問題。所以，實現千美元人類基因組(TDG)目標、甚至百美元人類基因組(HDG)目標，推進個體化疾病診斷與治療的發展，需要新型的直接、高效、低成本測序方法。

實用新型內容本實用新型提出了一種基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的DNA測序裝置，能夠實現DNA分子準確、高效、低成本的測序。為了實現上述目的，本實用新型採用如下技術方案基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的DNA測序裝置，該DNA測序裝置是以石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構為核心組裝而成，具體包括置於電解液11中的矽基襯底1，在矽基襯底I上半部刻蝕有倒金字塔形微腔2，下半部刻蝕有直徑大於倒金字塔形微腔2塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔2的塔頂為固態納米孔3，絕緣層6包覆在矽基襯底I外部，在矽基襯底I上部有通過內置電極8固定於絕緣層6上的石墨烯微帶4，石墨烯微帶4上刻蝕有石墨烯納米孔5，石墨烯納米孔5和固態納米孔3同軸，所述石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構將測序反應腔分為上下兩部分，置於反應腔上部的外接電極7接負電位，置於反應腔下部的外接電極7接正電位，外接電極7和縱向微弱電流測量設備9以及電源12構成縱向微弱電流測量迴路，內置電極8和橫向微弱電流測量設備10以及電源14構成橫向微弱電流測量迴路。所述固態納米孔3的直徑為1. 5-10nm。所述石墨烯納米孔5的直徑為1. 5-7nm。所述石墨烯微帶4為單層或多層石墨烯。所述縱向微弱電流測量設備9為皮安級電流測量儀。所述橫向微弱電流測量設備10為亞微安級電流測量儀。用於產生驅動單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的靜電場由電源12提供，所述電源12的偏置電壓應為0. 05-0. 2V，靠近石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構中石墨烯納米孔5 —側的電極接負電位，靠近固態納米孔3 —側的電極接正電位。所述電解液11為KCl、NaCl或LiCl，其濃度為0.8 1. 5mol/L，pH為8. O。本實用新型和現有技術相比，具有如下優點第一，本實用新型所採用的石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構中，固態納米孔克服了生物分子納米孔的不穩定性和孔徑不易控制性；石墨烯納米孔的採用解決了常規固態納米孔通道太長導致測序解析度難以達到單個鹼基的問題。此外，通過在石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構周圍增加環形電場、改變電解質溶液組分、控制溫度、改變石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構容積等方法，可以調節、甚至定量控制單鏈DNA分子通過納米孔的速度，為檢測贏得了時間。這些優點為實現單鹼基解析度、直接納米孔測序奠定了基礎。第二，本實用新型採用了 DNA分子穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔孔結構時，縱向離子電流阻塞和橫向石墨烯微帶中納米孔周圍電導變化的雙數據解析測序新思想。採用這種雙向數據解析測序可以提供單鏈DNA分子穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構時更多的信息，改善了傳統納米孔離子電流阻塞法信噪比低、易受外界環境幹擾等問題，從而提高測序精度，有望從根本上解決目前新一代DNA測序所面臨的根本問題。

附圖為本實用新型基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的DNA測序裝置示意圖。
具體實施方式

以下結合附圖和具體實施方式
對本實用新型做進一步的說明。如附圖所示，本實用新型一種基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的DNA測序裝置，該裝置是以石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構為核心組裝而成，具體包括置於電解液11中的矽基襯底I，在矽基襯底I上半部刻蝕有倒金字塔形微腔2，下半部刻蝕有直徑大於倒金字塔形微腔2塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔2的塔頂為固態納米孔3，絕緣層6包覆在矽基襯底I外部，在矽基襯底I上部有通過內置電極8固定於絕緣層6上的石墨烯微帶4，石墨烯微帶4上刻蝕有石墨烯納米孔5，石墨烯納米孔5和固態納米孔3同軸，所述石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構將測序反應腔分為上下兩部分，置於反應腔上部的外接電極7接負電位，置於反應腔下部的外接電極7接正電位，外接電極7和縱向微弱電流測量設備9以及電源12構成縱向微弱電流測量迴路，縱向微弱電流測量設備9用於測量縱向離子電流阻塞，內置電極8和橫向微弱電流測量設備10以及電源14構成橫向微弱電流測量迴路，橫向微弱電流測量設備10用於測量橫向石墨烯微帶4中石墨烯納米孔5周圍電導的變化。 優選固態納米孔3的直徑為1. 5-10nm。優選石墨烯納米孔5的直徑為1. 5_7nm。優選石墨烯微帶4為單層或多層石墨烯。優選縱向微弱電流測量設備9為皮安級電流測量儀。優選橫向微弱電流測量設備10為亞微安級電流測量儀。用於產生驅動單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的靜電場由電源12提供，優選電源12的偏置電壓應為0. 05-0. 2V，靠近石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構中石墨烯納米孔5 —側的電極接負電位，靠近固態納米孔3 —側的電極接正電位。優選電解液11為KC1、NaCl或LiCl，其濃度為0. 8 1. 5mol/L, pH為8. O。本實用新型的工作原理為首先將單鏈DNA分子13加入到盛有電解液11的測序反應腔上部，在靜電場的驅動作用下，單鏈DNA分子13成線狀通過石墨烯納米孔5，進入倒金字塔形微腔2，並最終通過固態納米孔3到達測序反應腔的下部；在單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構時，一方面對通過石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的電解液離子電流造成堵塞，導致縱向離子電流急劇變化，另一方面，對石墨烯納米孔5周邊電導產生影響，導致石墨烯微帶4中橫向電流密度發生改變，由於單鏈DNA分子13中不同鹼基結構不同，在穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構時在上述縱向和橫向兩個方向造成的電流和電導改變也不同，採用縱向微弱電流測量設備9對單鏈DNA分子13穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構過程中的穿越時間t，縱向離子電流發生阻塞的時間間隔At1、阻塞離子電流的大小IB1進行定量檢測，同時採用橫向微弱電流測量設備10對橫向石墨烯微帶4中電流密度發生改變的時間間隔△ t2、電流的大小IB2進行定量檢測，再通過對所測得的雙向數據進行解析計算DNA分子序列Sequence=f (t, A t1； IB1, A t2, IB2),即可得到所測DNA分子的序列。
權利要求1.基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的DNA測序裝置，其特徵在於該DNA測序裝置是以石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構為核心組裝而成，具體包括置於電解液(11)中的矽基襯底(I )，在矽基襯底(I)上半部刻蝕有倒金字塔形微腔(2)，下半部刻蝕有直徑大於倒金字塔形微腔(2)塔底直徑的柱狀孔，倒金字塔形微腔(2)的塔頂為固態納米孔(3 )，絕緣層(6 )包覆在矽基襯底(I)外部，在矽基襯底(I)上部有通過內置電極(8 )固定於絕緣層(6)上的石墨烯微帶(4)，石墨烯微帶(4)上刻蝕有石墨烯納米孔(5)，石墨烯納米孔(5)和固態納米孔(3)同軸，所述石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構將測序反應腔分為上下兩部分，置於反應腔上部的外接電極(7)接負電位，置於反應腔下部的外接電極(7) 接正電位，外接電極(7)和縱向微弱電流測量設備(9)以及電源(12)構成縱向微弱電流測量迴路，內置電極(8)和橫向微弱電流測量設備(10)以及電源(14)構成橫向微弱電流測量迴路。
2.根據權利要求1所述的DNA測序裝置，其特徵在於所述固態納米孔(3)的直徑為1.5_10nmo
3.根據權利要求1所述的DNA測序裝置，其特徵在於所述石墨烯納米孔(5)的直徑為1.5_7nm0
4.根據權利要求1所述的DNA測序裝置，其特徵在於所述石墨烯微帶(4)為單層或多層石墨稀。
5.根據權利要求1所述的DNA測序裝置，其特徵在於所述縱向微弱電流測量設備(9) 為皮安級電流測量儀。
6.根據權利要求1所述的DNA測序裝置，其特徵在於所述橫向微弱電流測量設備 (10)為亞微安級電流測量儀。
7.根據權利要求1所述的DNA測序裝置，其特徵在於用於產生驅動單鏈DNA分子(13) 穿越石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的靜電場由電源(12)提供，所述電源(12)的偏置電壓應為O. 05-0. 2V，靠近石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構中石墨烯納米孔(5) 一側的電極接負電位，靠近固態納米孔(3) 一側的電極接正電位。
8.根據權利要求1所述的DNA測序裝置，其特徵在於所述電解液(11)為KCl、NaCl或 LiCl，其濃度為 O. 8 1. 5mol/L, pH 為 8. O。
專利摘要本實用新型公開了一種基於石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構的DNA測序裝置，該裝置主要由帶有石墨烯納米孔的石墨烯微帶、矽基襯底中倒金字塔形微腔、微腔頂部的固態納米孔結構組成。測序時，測序反應腔被石墨烯納米孔-微腔-固態納米孔結構一分為二，單鏈DNA分子在靜電場的作用下成線狀穿過石墨烯納米孔，進入倒金字塔形微腔，最後經固態納米孔穿出；利用微弱電流測量設備同時測量DNA分子穿越活動引起的納米孔中縱向離子電流阻塞和石墨烯微帶中納米孔周圍橫向電導變化，進而利用同步數據記錄和處理系統對雙向數據進行解析計算，實現單鏈DNA分子的序列分析。
文檔編號G01N27/416GK202854093SQ20122048677
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月21日 優先權日2012年9月21日
發明者劉澤文, 鄧濤, 陳劍 申請人:清華大學