尼氟酸在製備慢性內臟痛的抑制藥物中的應用的製作方法

2023-09-24 00:48:25 1

專利名稱：：尼氟酸在製備慢性內臟痛的抑制藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於醫學領域，尤其涉及一種尼氟酸在製備慢性內臟痛的抑制性藥物中的應用。
背景技術：
：慢性內臟痛在臨床上極為普遍，而且常伴有情緒反應和防禦反應，如果疼痛達到一定程度，還可以引起心率減慢、外周心血管舒張等效應，導致血壓下降，甚至更嚴重後果。世界衛生組織於2000年認為「慢性疼痛是一類疾病」，從而將慢性疼痛歸到了疾病之列。因此，慢性內臟痛不再僅僅是內臟疾病的伴隨症狀，其本身就是一種疾病。雖然炎症、腫瘤等是慢性內臟痛常見的致病因素，但臨床上仍有相當比例的慢性內臟痛患者體檢無明顯的器質性變化，如功能性胃腸病(functionalgastrointestinaldiseases,FGIDs)。腸易激症候群(IrritableBowelSyndrome,IBS)就是其典型代表,也是消化內科病人求治的最常見原因之一。統計資料顯示，IBS佔臨床消化門診病例的三分之一，其主要臨床特徵是反覆發作的慢性腹痛及排便習慣的改變，病程遷延漫長，但缺乏異常體徵，且病因不明，給臨床治療帶來很大的麻煩，嚴重影響病人的生活。在美國僅IBS—項醫療費用每年消耗超過80億美元。直到2000年，Al-Chaer等才首次報導了IBS樣慢性內臟痛敏大鼠模型。該模型表現為新生期大鼠遭受疼痛或炎症刺激，成年後出現慢性內臟痛敏，伴有腹瀉、便秘等症狀，而且沒有病理形態學改變的證據。這一模型的出現為IBS研究提供了可靠的工具。以往IBS的研究主要集中在消化道運動功能紊亂現象，近年來內臟痛覺高敏感日益受到關注，被認為可能是產生IBS症狀(腹痛和腸道運動異常等)的主要原因。所謂內臟痛覺高敏感是指引起內臟疼痛的閾值降低，內臟對生理性刺激產生不適感或對傷害性刺激反應強烈的現象。對於內臟痛覺高敏感發生機制目前存在四種假設:①胃腸道傳入神經的敏感化(外周敏感化)脊髓背側角神經元的敏感化(中樞敏感化)改變對脊髓傷害性神經元下行的易化或抑制的影響(可能受心理過程影響)；④由於認知和情感的偏倚(警覺過度)將非傷害性感覺誤認為傷害性感覺，是精神心理障礙的結果。超極化環核苷酸門控陽離子(hyperpolarization-activatedcyclicnucleotidegatedcation,HCN)通道由Noma和Irisawa首次報導。他們發現在兔子竇房結細胞上存在著一個超極化激活的內向電流，並且被Brown等命名為If(為「funny」電流，因為它具有不尋常的激活特性)。後來的研究進一步發現這一電流也存在其他組織中，稱之為Ih(超極化激活電流)，也被稱為I,(為「queer」電流)。而其分子基礎在很長時間內未能得到證明。直到1997年，SantOT0等才從大鼠大腦中克隆出一個候選離子通道，並且證明為腦環核苷酸門控通道(mBCNG)。這一通道具有共同特徵，長時程的起搏功能，並且屬於一個4成員家族。此後兩年陸續克隆出多種超極化激活環核苷酸(HCN)通道，其中哺乳動物存在著四種亞型，分別稱之為HCN1、HCN2、HCN3和HCN4。HCN通道廣泛地分布於全身，在可興奮和不可興奮的組織中都存在。HCN通道主要分布在心臟，包括竇房結和房室結以及心肌裡，也分布於整個大腦和神經組織。已經證實，外周敏感化和中樞敏感化等機制參與導致組織損傷和炎症情況下的內臟痛覺高敏感。脊髓背角傷害性突觸傳遞的增強是中樞敏化的一部分，也是神經病理疼痛行為的另一個重要誘因。傷害性中心末端的興奮性神經遞質如P物質和穀氨酸釋放增加，對神經病理疼痛有很大作用。研究表明，HCN通道在脊髓背角的傷害性中心末端和機械敏感性中心末端有表達。此外，HCN2陽性終端也含有SP和穀氨酸。它們構成興奮性中間神經元與突觸連接。如此分布有助於HCN通道參與突觸前神經遞質釋放的調節以及隨後的脊髓背角的中間神經元興奮性調節。因此我們有理由猜測脊髓HCN可能參與了脊髓背角的中樞敏化。一般而言，在神經系統受傷後，傷害性傳導途徑出現興奮性過度，這會擴大正常性或有害性刺激，誘發慢性、異常性疼痛反應。離子通道是神經興奮性的主要決定因素，而且包含廣泛，包括Na+通道，K+通道和Ca2+通道等非常有趣的離子通道。最近研究表明，HCN通道在神經病理性疼痛起作用，是個有價值的靶點。用各種各樣的動物模型進行的一系列研究陸續展示了Ih對神經病理性疼痛的作用。將ZD7288按一定形式給以神經病理痛模型，腹內注射，或者鞘內注射，或者對損傷的坐骨神經進行外周神經阻滯，或者蹠肌內注射入受傷後掌，或者受傷的DRG的局部用藥，結果都觀察到顯著的鎮痛效果而無運動功能能障礙。此夕卜，幾種臨床使用的止痛藥，如洛哌丁胺(loperamide),異丙酹和可待因等起的鎮痛效果，也是通過抑制Ih發揮作用。但是，目前對HCN通道在疼痛中作用的研究主要集中在神經病理痛模型。鑑於內臟痛的病理生理過程有別於軀體痛，因此，本課題組對DRG和脊髓背角的HCN通道是否參與內臟痛敏的形成進行了初步的探討。本實驗室前期研究，採用急性內臟痛模型和IBS模型，通過腹壁撤退反射評分、痛閾測定和腹外斜肌放電測量等三項指標來評估大鼠對結直腸擴張刺激的反應程度，結果顯示無論是急性內臟痛模型，還是IBS模型，ZD7288鞘內給藥均能劑量依賴性降低大鼠腹壁撤退反射評分和腹外斜肌放電幅值，同時升高痛閾。該結果提示，阻斷脊髓水平的HCN通道對急、慢性內臟痛大鼠可能有鎮痛作用；同時HCN通道免疫組織化學研究也顯示，在IBS模型大鼠脊髓的腰骶段、胸腰段和背根神經節等組織中，HCN2的表達顯著強於正常組大鼠。免疫反應性表明，HCN不僅在脊髓中有分布，在大腦組織中也有分布。HCN2在大腦中廣泛分布，而HCNl主要位於皮質，集中分布於新皮質、海馬、上丘和小腦。雙倍免疫螢光法闡釋HCNl和HCN2在海馬和新皮質樹突遠端的錐體細胞中都有表達。眾所皆知，新生大鼠的神經系統特別脆弱，具有可塑性，而我們前期的研究也發現脊髓部位存在著HCN表達的可塑性改變。有鑑於此，我們推測IBS模型大鼠的大腦組織中，可能也存在著HCN表達的可塑性改變。目前HCN通道阻斷劑在臨床已經開始使用，包括心動過緩藥。Procolan(類似於伊伐布雷定(ivabradine)),—種特異性Ih阻斷劑，對HCN通道的四個亞型沒有藥理學選擇性，在歐洲已經用於穩定型心絞痛的對症治療，但是由於目前缺乏HCN通道亞型特異性阻斷劑，其在臨床治療中出現了一系列的副作用。因此在研究HCN通道在疼痛中時，探知究竟HCN哪一亞型在起作用，或者哪一亞型的作用更大，以及開發出更具有亞型特異性的阻斷齊U，意義非常重大。最新研究發現尼氟酸是HCN2亞型通道的特異性阻斷劑。尼氟酸是一種非甾體抗炎鎮痛藥，以往多用於風溼性疼痛的治療，有研究表明尼氟酸能作用於S4電壓敏感區域的外區從而改變HCN2起搏通道的門控作用。鑑於本實驗室的前期研究結果，本課題考慮在IBS模型大鼠幼年期腹腔給以尼氟酸，觀察HCN2通道亞型在慢性內臟痛的作用。本研究應用IBS模型，在IBS模型幼鼠早期給予超極化激活環核苷酸門控陽離子通道亞型2(HCN2)的特異性阻斷劑尼氟酸進行幹預，通過行為學(腹壁撤退反射評分和痛閾測定)，電生理學(腹外斜肌放電幅值)等方法測定其成年後內臟痛敏感性的變化，並結合免疫組織化學實驗方法闡明HCN2通道在慢性內臟痛中的作用及其機制，以期為內臟痛的藥物治療提供新的作用靶點。
發明內容本發明的目的在於提供一種尼氟酸在製備慢性內臟痛的抑制性藥物中的應用，即尼氟酸作為HCN2亞型通道的特異性阻斷劑的應用，可以作為治療慢性內臟痛的藥物。本發明的目的是這樣實現的，所述的尼氟酸是一種非甾體抗炎鎮痛藥，能作為HCN2亞型通道的特異性阻斷劑。所述的尼氟酸是一種非留體抗炎鎮痛藥，在製備治療慢性內臟痛藥物中的應用。本發明具有如下的優點:所述的尼氟酸是一種非留體抗炎鎮痛藥，以往多用於風溼性疼痛的治療。該研究表明尼氟酸能作用於S4電壓敏感區域的外區從而改變HCN2起搏通道的門控。本課題的研究也表明，在IBS模型大鼠的生長發育階段給予HCN2通道的特異性阻斷劑尼氟酸，結果發現尼氟酸能減輕IBS模型大鼠成年時的內臟敏化狀態，該結果從另一個角度提示了HCN2可能參與慢性內臟痛的形成。尼氟酸(HCN2通道的特異性阻斷劑)能劑量依賴性抑制IBS大鼠的內臟痛反應，並提高其痛反應閾，提示尼氟酸早期應用可有效阻斷大鼠慢性內臟痛的形成，該通道亞型有望成為慢性內臟痛藥物治療的新靶點。圖1為本發明的實驗一的技術路線圖。圖2為本發明實驗二的技術路線圖。圖3為腹壁撤退反射(AWR)評分圖。圖4為正常和IBS模型大鼠腹壁撤退反射評分圖。圖中的林<0.01，vscontrolrats。圖5為正常和IBS模型大鼠痛閾圖，圖中的**:/*<0.01,vscontrolrats。圖6為正常和IBS模型組大鼠腹外斜肌放電幅值圖；圖中的*，林<0.05,P<0.01,vscontrolrats。圖7為對照大鼠結腸HE染色(X200倍)圖。圖8為IBS模型大鼠結腸HE染色(X200倍)圖。圖9為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表達(X400倍)圖，圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠胸腰段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖10為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照和IBS模型大鼠胸腰段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖11為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠腰骶段脊髓的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠腰骶段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖12為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠腰骶段脊髓的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照大鼠和IBS模型大鼠腰骶段脊髓中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖13為HCNl在對照和IBS模型大鼠大腦中縫核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠中縫核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖14為HCN2在對照和IBS模型大鼠大腦中縫核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照大鼠和IBS模型大鼠中縫核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖15為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠大腦室旁核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照大鼠和IBS模型大鼠室旁核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖16為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠大腦中室旁核的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照和IBS模型大鼠室旁核中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上,而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖17為HCNl在正常對照和IBS模型大鼠大腦海馬的表達(X400倍)圖；圖中可見HCNl在正常對照和IBS模型大鼠海馬中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖18為HCN2在正常對照和IBS模型大鼠大腦海馬的表達(X400倍)圖；圖中可見HCN2在正常對照和IBS模型大鼠海馬中均有分布，主要表達在細胞膜和細胞質上，而在IBS模型大鼠上表達顯著增強。圖19為尼氟酸對IBS模型大鼠痛閾的作用圖；圖中的*，**:P<0.05,P<0.01，vsIBSmodelratswithDMSO。圖20為尼氟酸對慢性內臟痛大鼠腹外斜肌放電幅值的抑制作用圖；圖中的**-.P<0.01，vsIBSmodelratswithDMSO:P<0.01，vsIBSmodelratswithNFAlmg;#:P±s表示。在OmmHg壓力下的腹外斜肌放電為基礎放電,為消除基礎放電不同對結果的影響，將每隻幼鼠在20、40、60、80mmHgCRD壓力下腹外斜肌放電幅值減去其基礎放電幅值，其差值代表各個不同CRD壓力下腹外斜肌放電幅值。AffR評分及腹外斜肌放電數據採用重複測量方差分析，痛閾採用單因素方差分析。選取尼氟酸給藥劑量5mg組，用2X2析因分析統計方法進行統計分析。統計分析採用SPSS13.0統計學軟體進行統計分析，以/7<0.05差異具有統計學意義。圖像處理採用MoticMed6.0數碼彩色醫學圖像分析系統，測定上述免疫組化染色的脊髓與大腦切片。每張切片隨機選取3個高倍鏡視野(400倍)，經彩色圖像分析儀，讀取並輸入計算機，由系統進行分析，測得每個視野中的平均累積光密度，3個視野測得的平均值即為該例的平均累積光密度。平均累積光密度越大，反映組織染色越強。平均累積光密度值用採用單因素方差分析，統計分析採用SPSS13.0統計學軟體進行統計分析，以P<0.05差異具有統計學意義。結果I慢性內臟痛大鼠IBS模型的評價1.1腹壁撤退反射在2060mmHg結直腸擴張壓力下，IBS模型大鼠AWR評分顯著高於對照大鼠，而在SOmmHg結直腸擴張壓力下兩組大鼠評分差異無統計學意義(見圖4)。腹壁撤退反射測定大鼠的痛閾與正常大鼠相比，IBS模型大鼠的痛閾顯著降低0°<0.01)(見圖5)。腹外斜肌放電在20SOmmHg各個結直腸擴張壓力下，IBS模型大鼠腹外斜肌放電均明顯高於對照大鼠(見圖6)。結腸組織病理改變觀察比較對照和IBS模型大鼠遠端降結腸局部組織學的病理改變，肉眼均未見明顯的腸腔擴張以及與周圍組織粘連等病理改變。降結腸HE染色光鏡下均未見明顯組織損傷，無中性粒細胞浸潤，間質無明顯水腫(見圖7，8)。通道與慢性內臟高敏關係的形態學研究2.1HCNUHCN2在大鼠胸腰段脊髓的表達觀察比較HCN1、HCN2在正常與IBS模型大鼠胸腰段脊髓的表達，結果顯示，HCNl和HCN2均主要在神經元細胞和神經膠質細胞的細胞膜和細胞漿上表達(見圖9，10)。圖像分析結果表明，IBS模型大鼠胸腰段脊髓HCNl和HCN2平均積分光密度值(integrateopticaldensity,10D)均顯著高於正常大鼠,差異有統計學意義(見表I,表2)。表IHCNl在大鼠胸腰段脊髓的,達_權利要求1.尼氟酸在製備HCN2亞型通道的特異性阻斷劑中的應用。2.尼氟酸在製備治療慢性內臟痛的藥物中的應用。全文摘要本發明公開一種尼氟酸在製備慢性內臟痛的抑制藥物中的應用，尼氟酸在製備HCN2亞型通道的特異性阻斷劑中的應用，以及尼氟酸在製備治療慢性內臟痛藥物中的應用。該研究表明尼氟酸能作用於S4電壓敏感區域的外區從而改變HCN2起搏通道的門控。本課題的研究也表明，在IBS模型大鼠的生長發育階段給予HCN2通道的特異性阻斷劑尼氟酸，結果發現尼氟酸能減輕IBS模型大鼠成年時的內臟敏化狀態，該結果從另一個角度提示了HCN2可能參與慢性內臟痛的形成。尼氟酸(HCN2通道的特異性阻斷劑)能劑量依賴性抑制IBS大鼠的內臟痛反應，並提高其痛反應閾，提示尼氟酸有望成為治療慢性內臟痛藥物。文檔編號A61K31/455GK103070866SQ20121048907公開日2013年5月1日申請日期2012年11月27日優先權日2012年11月27日發明者林春,盧大力,唐影,陳瑜申請人:福建醫科大學