牛胚胎性別的無創傷性鑑定分子檢測方法
2023-09-24 13:07:05
專利名稱：牛胚胎性別的無創傷性鑑定分子檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學及畜牧業領域，涉及一種提供了快速的牛(指普通牛(Sew /做rM)或稱家牛，下同)胚胎(包括胎兒，下同)性別無創傷性鑑定分子檢測方法。
背景技術：
動物的性別控制技術是通過對動物的正常生殖過程進行人為幹預，使成年雌性動物 按照人們的意願產出所期望的性別後代的一門生物技術。該技術在畜牧生產上具有重要 的意義，可以實現性別的控制生產，也為伴性遺傳性疾病的診斷提供了手段。性別鑑定 則是性別控制的重要步驟和手段。
傳統的對胚胎或胎兒性別鑑定的方法，主要有結合胚胎移植的性別鑑定，或妊娠後 的性別鑑定。結合胚胎移植的性別鑑定，需要胚胎顯微操作儀器，並結合染色體分型分 析或分子方法，價格昂貴，操作技術要求高，對胚胎也會造成一定的損傷，故在實際生 產中難以應用；傳統的妊娠後胚胎(胎兒)性別鑑定，分有創性和無創性兩種，前者採 用羊膜腔穿刺和絨毛吸取術，對產前胎兒細胞進行遺傳學診斷，這類方法雖然準確率高， 但對母體尤其是胚胎會造成一定的傷害，並可誘發宮內感染、流產、死胎等問題；後者 有超聲波診斷等方法，雖然對母體和胎兒沒傷害，但其敏感性低，且假陽性率較高，多 用於妊娠後期。1997.年，Lo等應用煮沸法從人類母體血槳和血清中提取出胎兒游離 DNA，用常規PCR擴增單拷貝序列，對母體血漿中胎兒DNA的Y染色體特異性序列 (SRY)進行分析，從而鑑定胎兒性別，為進行早期胚胎的無創性性別鑑定開闢了另一途 徑。但由於母體血漿和血清中胎兒游離DNA量非常微量，普通的PCR方法檢測的靈敏 度和特異性均受到影響。
巢式PCR (nested PCR)，是指利用兩套PCR引物(巢式引物)對進行兩輪PCR 擴增反應。在第一輪擴增中，外引物用以產生擴增產物，此產物再在內引物的存在下進 行第二輪擴增。由於巢式PCR反應有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可 能性(因為與兩套引物都互補的引物很少)，增加了檢測的敏感性；並且有兩對PCR 引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。牛是哺乳綱偶蹄目(Artiodactyla)牛科(Bovidae)牛屬(Bos)和水牛屬(Bubalus) 家畜的總稱。牛屬包括4個種①普通牛(Bostaurus)，即家牛，包括常見的奶牛、肉 牛和我國黃牛品種。②瘤牛(B.indicus)，亦稱駝峰牛。③犛牛(B.run-niens) 。 @野 牛(Bison)，如美洲野牛(B.bison)、歐洲野牛(B.bonasus)等。
人類母體血液中胎兒DNA的來源，己有諸多報到，可能源於以下幾個方面
① 來源於孕婦血液中的有核細胞妊娠後由於在胎盤界面的胎-母輸血，胎兒有核細 胞如有核紅細胞、白細胞、淋巴細胞等突破胎盤屏障進入母體血循環後，母體會對胎兒 有核細胞產生免疫排斥反應，使胎兒有核細胞破裂而將DNA釋放入母血漿，Lo等證實 孕婦外周血中有核紅細胞的數量與游離胎兒DNA的水平相平行。
② 來源於胎盤滋養層細胞早期胚胎滋養層發育很快，孕4周時滋養層間隙被母血 充盈，合體滋養層細胞可直接滲透入母血，激活母體免疫系統破壞胎盤滋養層細胞，導 致胎兒DNA直接進入母血循環。Ohashi等研究發現植入性胎盤的孕婦血漿中含有的胎 兒DNA明顯高於正常孕婦。
③ 來源於胎兒發育過程中凋亡的胎兒細胞凋亡即程序性細胞死亡，細胞核DNA分 解為核酸片段是細胞凋亡的一個特點。孕婦血漿中已被證實存在凋亡的胎兒細胞， Sckizawa等對應用螢光原位雜交技術標定的胎兒細胞行免疫組化染色，結果表明42% 帶有凋亡標誌。胎盤的凋亡隨著妊娠的進展而增高，母體血漿中胎兒DNA的水平也隨 著孕周的增加而增高。相關的報導表明最早在母體外周血中檢測到胎兒游離DNA都在 四周以後。
目前還沒有利用母牛血採用無創傷性的分子檢測方法準確、簡潔、快速地鑑定牛胚 胎性別的技術報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種牛胚胎性別的無創傷性鑑定分子檢測方法。
本發明的發明人在研究中發現，母牛妊娠後胚胎的DNA可以在母體血中檢測到， 隨著妊娠時間的增加，母體血中胚胎游離DNA的含量會逐漸增加，檢測的準確性也會 大大增加，在母牛妊娠2個月後母體血中能夠抽取到胚胎游離DNA的準確性可達100%。
本發明主要是利用牛母體血(全血、血漿或血清)中胚胎游離DNA，使用SRY基 因序列作為檢測胚胎性別的物質，應用巢式PCR技術檢測胚胎性別。
本發明的目的是通過下列技術措施實現的
牛胚胎性別鑑定分子檢測方法，其特徵在於該方法包括下列步驟a. 抽提DNA模板來集妊娠牛血樣，分離游離DNA;
b. 設計引物以牛Y染色體特異性序列設計兩對特異性引物，其中第二對特異性 引物擴增片斷的序列包含在第一對特異性引物擴增片斷的序列中；
c. 第一輪PCR反應以步驟a分離得到的游離DNA為模板，以第一對特異性引物 進行第一輪PCR反應；
d. 第二輪PCR反應以第一輪擴增產物為模板，以第二對特異性引物進行第二輪 PCR反應；
e. 結果判斷分別以第一輪和第二輪擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜
與陽性對照比較或者與陽性和陰性對照比較，如第二輪擴增產物出現陽性條帶或兩輪擴
增產物均出現陽性條帶則該妊娠牛的胚胎為雄性；否則，該妊娠牛的胚胎為雌性。 具體分析如下
第一輪擴增產物 第二輪擴增產物 胚胎性別判斷 說明 是否有陽性條帶 是否有陽性條帶
有 有 雄
有 無 雌 第一輪為假陽性
無 有 雄 第一輪為假陰性
無 無 雌
所述的檢測方法，其中牛血樣為全血、血清或血漿。
所述的檢測方法，其中第一對引物的上遊引物為SEQIDNo.l，下遊引物為SEQID No.2;第二對引物的上遊引物為SEQIDNo.3，下遊引物為SEQ ID No.4。
所述的檢測方法，其中第一輪PCR產物長度為182bp;第二輪PCR產物長度為 124bp。
所述的檢測方法，其中第一輪PCR產物序列為SEQIDNo.5;第二輪PCR產物序 列為SEQ ID No.6。若採用測序驗證，PCR產物與SRY基因對應片段的同源性為 98.8%~99.5%。
所述的檢測方法，其中妊娠牛為妊娠2個月以上的牛，所述的牛為普通牛。 通常，妊娠4 8周(或第1 8周，由於胚胎分期法不同所致)的胎體為胚胎；妊 娠8周以後的胎體為胎兒。本發明技術方案中所述胚胎包括胎兒。 本發明的有益效果
我們根據妊娠母牛的(外周)血中存在游離的胚胎DNA，建立了妊娠牛胚胎性別無創傷性鑑定的分子檢測方法，實現牛胚胎的性別診斷，避免對胚胎的損害，以保證胚 胎的正常發育和生長，為母牛胚胎性別鑑定提供了一條準確、簡潔、快速的新方法，並 為牛性別控制和胎兒伴性遺傳性疾病的診斷與控制提供了一種手段。
本發明根據牛SRY基因序列設計，合成了特異於牛SRY基因的巢式PCR引物，用 於胚胎的性別鑑定。以此兩對引物對32頭成年荷斯坦公牛和50頭母牛基因組DNA進 行擴增，公牛均出現182 bp和124 bp條帶，母牛均無此條帶，準確率為100%;採集 10頭地方黃牛公牛和25頭母牛，進行同樣的測定，性別鑑定的準確率為100%;鑑定 110頭不同妊娠階段的荷斯坦母牛胚胎性別，並與實際產犢結果比較，妊娠50天至2 個月的準確率>90%,妊娠2個月以上的準確率為100%。任意選取荷斯坦牛擴增陽性 條帶樣品進行了克隆測序，通過和牛(bovine) SRY基因比對，證明擴增產物就是SRY 基因，說明所設計的引物具有特異性，可用於胚胎性別鑑定。
圖l:第一輪巢式PCR擴增結果的電泳分析圖。
M—DNA分子量標準；陽一陽性對照；陰一陰性對照，1—8為樣品。其中1 5出 現182bp條帶，6~8未出現182bp條帶。
圖2:第二輪巢式PCR擴增結果的電泳分析圖。
M—DNA分子量標準；陽一陽性對照；陰一陰性對照，l一8為樣品。其中1 5出 現124bp條帶，鑑定雄性；6-8未出現124bp條帶，為鑑定雌性。 圖3:是公牛克隆測序的圖譜片段。
圖4:是陽性樣本克隆測序的圖譜片段。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
以下實施例所述的牛為普通牛(5o"awnw)或稱家牛。
實施例1
1 DNA提取
陰陽性對照以及樣品DNA提取
以無妊娠史的青年母牛(或母犢牛)為陰性對照，以公牛(或公犢牛)為陽性對照， 採取外周血(血漿)。樣本為待測定妊娠母牛，同樣方法採集外周血(漿)。提取DNA。 (1)陰性、陽性對照DNA提取"1取700(JL血樣於2mL離心管中，用PBS液加滿離心管，充分混勻後8000r/min離 心10min，棄上清液。往沉澱物中再加600nL血樣後，加入PBS液至滿離心管，充分混 勻後8000r/min離心10min，棄上清液至沉澱物呈灰白色。加裂解液(尿素8mM;Nacl 0.3mM;SDS2%) 600pL和蛋白酶K lO^L, 55'C溫浴過夜。次日浴至4'C冰水中，待降 溫後，加等體積Tris飽和酚，混勻靜置10min， 12000r/min離心10min;上清液轉入另 一滅菌eppendorf管中。觀察上清液是否有蛋白層，若有則用Tris飽和酚重複抽提1-2 次，至無蛋白層出現。將上清液轉入另一 eppendorf管中，加入等體積的Tris飽和酚/ 氯仿/異戊醇(按體積比25:24:l)充分混勻10min， 10000r/min離心8min後，取上清轉入 潔淨的1.5mL離心管中。向有上清的離心管中加入上清體積倍數2.5倍的冰無水乙醇用 力搖晃，離心去除上清液後加入75%乙醇漂洗，並於10000r/min離心5min，重複漂洗 DNA沉澱2-3次。室溫下靜置至管內乙醇揮發盡，加50pL超純水至DNA完全溶解。 用紫外分光光度計測定OD值，0.7。/。瓊脂糖電泳檢測DNA提取效果。根據OD值及電 泳結果，可將DNA溶液稀釋至100ng/nL。置於-20'C保存備用。 (2)母體血漿中游離DNA的提取2]:
從妊娠母牛頸靜脈或尾靜脈採血5-10mL, ACD (枸櫞酸葡萄糖抗凝溶液)抗凝。 在採樣4h內於3000r/min離心10min，小心吸取上層血漿加入另一離心管中，再次以 14000r/min離心10min，小心吸取上層血漿，放入另一離心管中置於-20'C凍存。取母體 血槳2.0mL，加入15pLRNA酶於37'C溫浴lh，再加入40nL蛋白酶K於37'C水浴振 蕩過液，第二天加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)反覆抽提10min， 10000r/min 離心10min，取上清，然後加入等體積的氯仿/異戊醇(24:l)反覆抽提10min， 10000r/min 離心10min，取上清，加入3倍體積的無水乙醇以及1/10體積的醋酸鈉溶液(3mol/L) 冰浴30min, IOOOOr/min離心IOmin，棄上清，室溫下晾乾，在沉澱中加入20jaL滅菌超 純水進行溶解，用分光光度計測定其純度和濃度，然後置於-2(TC備用。
2應用本發明所篩選的引物SEQ ID No.l 、SEQ ID No.2; SEQ ID No.3、SEQ ID No.4 對提取的陰性、陽性對照以及樣品DNA進行巢式PCR擴增分析，並對第二輪擴增產物 進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，對電泳圖譜進行基因分析，具體操作過程如下 (1)第一輪反應體系與PCR反應程序
反應體系10xbuffer2pL; Mg2+1.6nL(25mM); dNTPs 0.5nL(10 mM); SRY primer 1 (上、下)l攀x2(20pM);模版DNA2攀(lPg-l嗎);TaqDNA 0.3pL(5U4iL);滅菌超 純水H20 11.6nL。 (SRYprimer 1上為SEQ ID No.l ，下為SEQ IDNo.2)PCR反應程序94'C預變性5min; 94。C30s， 53.5。C30s， 72。C30s， 72。Cl0min，共 32個循環，4'C保存。
(2) 第二輪反應體系與PCR反應程序 反應體系取第一輪PCR擴增產物4pL作為第二輪PCR的模板。PCR反應體系(2(VL)
為10xbuffer 2pL; Mg2+ 1.2nL(25mM); dNTPs 0.5nL(10 mM); SRY primer 2 (上、 下)1.0pLx2(20pM);第一輪PCR產物4.0nL(4 mM); TaqDNA 0.3jaL(5U/nL);滅菌超純 zKH209.6nL。 (SRYprimer2上為SEQIDNo.3,下為SEQIDNo.4)
PCR反應程序94'C預變性5min; 94'C30s, 54.5。C30s， 72。C30s， 72。Cl0min,共 32個循環，4'C保存。
(3) 電泳分析以第一輪和第二輪擴增產物分別2%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖l 和圖2。 M—DNA分子量標準；陽一陽性對照陰一陰性對照，1—8為樣品。根據第 二輪電泳圖譜，1 5泳道擴增出了 124bp條帶，與陽性對照一致，鑑定為雄性。6~8沒 有124bp產物，鑑定為雌性。
(取荷斯坦牛擴增陽性條帶樣品進行了克隆測序，第一輪擴增產物序列為SEQ ID No.5，第二輪擴增產物序列為SEQ ID No.6。)
實施例2:克隆測序
為驗證根據上述電泳結果判斷性別的可靠性，隨機挑選上述第二輪一陽性對照和一
陽性樣品擴增產物進行克隆測序，結果顯示，陽性對照擴增產物(片段，圖3)與牛(6oW^) 的SRY基因對應片段的同源性為99.5%，陽性樣品擴增產物(片段，圖4)與牛(6oW"e) 的SRY基因對應片段的同源性為98.8%，說明經過PCR擴增出來的目的片段就是SRY 基因。
參考文獻金冬雁，黎孟楓.分子克隆實驗指南[M].北京:科學出版社，1992: 463-469. [2]奧斯伯F，布倫特R,金斯頓RE,等主編.精編分子生物學實驗指南[M].北京:科學 出版社，1999， 31.〈110〉南京農業大學
〈120〉牛胚胎性別的無創傷性鑑定分子檢測方法 〈歸6
〈210〉 1 19 〈212> ■ 〈213>人工序列 〈220〉
〈223〉巢式第一輪引物的上遊引物 <400〉 1
acgccttcat tgtgtggtc 19
2 18 腿 <213〉人工序列
〈223>巢式第一輪引物的下遊引物 〈婦2
cgggtatttg tctcggtg 18
〈210〉 3 19 〈212> DNA 人工序列 〈220〉〈223>巢式第二輪引物的上遊引物 〈400〉 3
gaacgaagac gaaaggtgg 19
4 19 〈212〉 ■ <213〉人工序列 〈220〉
巢式第二輪引物的下遊引物 〈400〉 4
gtgcctcctc aaagaatgg 19
〈210> 5 〈211> 182 <212〉 DNA
〈213>擴增產物序列，來自荷斯坦牛(Holstein) 〈220〉
〈223> SRY基因1242bp-1423bp區域 <德5
acgccttcat tgtgtggtct cgtgaacgaa gacgaaaggt ggctctagag aatcccaaaa 60 tga,actc agacatcagc aagcagctgg gatatgagtg gaaaaggctt acagatgctg 120 aaaagcgccc attctttgeig gaggcac卿gactactagc catacaccga gacaaatacc 180 eg 啦
〈210〉 6 〈211〉 124 〈212〉 DNA
擴增產物序列，來自荷斯坦牛(Holstein) 〈220> SRY基因1265bp-1388bp區域 <400〉 6
gaacgaagac gaaaggtggc tctagagaat cagctgggat atgagtggaa aaggcttaca
gC3C
cccaaaatga aaaactcaga catcagcaag 60 gatgctgaaa agcgcccatt ctttgaggag 120
12權利要求
1、牛胚胎性別鑑定分子檢測方法，其特徵在於該方法包括下列步驟a.抽提DNA模板採集妊娠牛血樣，分離游離DNA；b.設計引物以牛Y染色體特異性序列設計兩對特異性引物，其中第二對特異性引物擴增片斷的序列包含在第一對特異性引物擴增片斷的序列中；c.第一輪PCR反應以步驟a分離得到的游離DNA為模板，以第一對特異性引物進行第一輪PCR反應；d.第二輪PCR反應以第一輪擴增產物為模板，以第二對特異性引物進行第二輪PCR反應；e.結果判斷分別以第一輪和第二輪擴增產物進行2％瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖譜與陽性對照比較或者與陽性和陰性對照比較，如第二輪擴增產物出現陽性條帶或兩輪擴增產物均出現陽性條帶則該妊娠牛的胚胎為雄性；否則，該妊娠牛的胚胎為雌性。
2、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於牛血樣為全血、血清或血漿。
3、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於第一對引物的上遊引物為SEQID No.l，下遊引物為SEQ ID No.2;第二對引物的上遊引物為SEQ ID No.3，下遊引物為 SEQIDNo.4。
4、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於第一輪PCR產物長度為182bp; 第二輪PCR產物長度為124bp。
5、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於第一輪PCR產物序列為SEQ ID No.5;第二輪PCR產物序列為SEQIDNo.6。
6、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於妊娠牛為妊娠2個月以上的牛。
7、 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於牛為普通牛。
全文摘要
本發明屬於分子生物學及畜牧業領域，公開了牛胚胎性別的無創傷性鑑定分子檢測方法。該方法通過妊娠牛血樣抽提DNA模板，以牛Y染色體特異性序列設計兩對巢式引物，進行巢式PCR，通過擴增產物是否出現陽性條帶判斷牛胚胎的性別。該方法實現牛胚胎的性別診斷，避免對胚胎的損害，以保證胚胎的正常發育和生長，為母牛胚胎性別鑑定提供了一條準確、簡潔、快速的新方法，並為牛性別控制和胎兒伴性遺傳性疾病的診斷與控制提供了一種手段。
文檔編號C12Q1/68GK101514369SQ20091003025
公開日2009年8月26日 申請日期2009年3月24日 優先權日2009年3月24日
發明者崔群維, 王根林, 程凱寧 申請人:南京農業大學