一種高純度11s大豆球蛋白的製備方法及其應用的製作方法

2023-10-28 13:21:22 1

一種高純度11s大豆球蛋白的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高純度11S大豆球蛋白的製備方法及其應用。本發明公開的一種11S大豆球蛋白的製備方法，包括如下步驟：（1）將脫脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液；（2）將（1）的粗提液進行強陰離子交換層析進行分離純化，收集目的洗脫液1；（3）將目的洗脫液1進行陶瓷羥基磷灰石層析分離純化，收集目的洗脫液2，即為目的蛋白；所述目的蛋白為沉降係數為11S的大豆球蛋白。本發明公開的方法工藝簡單，易於流水線分離純化，便於工業化生產。
【專利說明】一種高純度11S大豆球蛋白的製備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高純度IlS大豆球蛋白的製備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]大豆不僅是優良的油料作物，而且是理想的食用蛋白資源，隨著現代科技的發展以及人們對大豆蛋白營養特性和功能特性認識的加深，高蛋白含量的脫脂大豆粉及其分離純化的蛋白已經廣泛應用於動物養殖、食品加工等領域。
[0003]根據超速離心法的沉降係數不同將大豆蛋白分為2S、7S、11S和15S大豆球蛋白。7S與IlS球蛋白佔大豆總蛋白含量的80%以上，它們的功能性質(水溶性、乳化性與表面活性等)與營養性質存在顯著差異，IIS大豆球蛋白具有高凝膠性，7S大豆球蛋白具有高乳化性。
[0004]目前分離IlS與7S大豆球蛋白的方法主要是根據等電點不同採取酸沉澱法使兩種蛋白分步沉澱。但由於IlS與7S大豆球蛋白的等電點相差不大，由該方法往往需要採用多步分離，並藉助低溫設備與高速離心裝置提高分離的精度，分離工藝繁雜冗長，大多只能用於實驗室樣品的製備；其次，大部分方法分離所得的蛋白純度較低，限制了兩種蛋白在實際生產中的應用，目前還沒有一種工藝相對簡單且能夠面向工業化生產的有效方法。

【發明內容】

[0005]本發明的目的 是提供一種高純度IlS大豆球蛋白的製備方法及其應用。
[0006]本發明公開的一種IlS大豆球蛋白的製備方法，包括如下步驟:
[0007](I)將脫脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液；
[0008](2)將(I)的粗提液進行強陰離子交換層析進行分離純化，收集目的洗脫液I ;
[0009](3)將目的洗脫液I進行陶瓷羥基磷灰石層析分離純化，收集目的洗脫液2，即為目的蛋白；
[0010]所述目的蛋白為沉降係數為IlS的大豆球蛋白。
[0011]上述方法中，所述步驟(1)的步驟為:
[0012]I)將所述脫脂大豆粉與含有IOmM巰基乙醇的Tris-HCl緩衝液按照lg:20ml的比例混合，37°C提取I小時，離心後收集上清液；
[0013]2)將I)的上清液pH調至6.4，離心收集沉澱；
[0014]3)將2)的沉澱用Tris-HCl緩衝液溶解，經濾膜過濾收集濾液，即為所述蛋白粗提液；
[0015]所述Tris-HCl 緩衝液為 50mM pH8.0 的 Tris-HCl 緩衝液；
[0016]所述濾膜為0.45 μ m濾膜。
[0017]上述任一所述的方法中，所述步驟(2)中，強陰離子交換層析的柱填料為CaptoQ;
[0018]所述強陰離子交換層析的柱的內徑為1.6cm，填料高度為5cm ；[0019]所用的洗脫緩衝液由如下A溶液和B溶液組成:
[0020]A 溶液:50mM ρΗ8.0Tris-HCl 緩衝液；
[0021]B溶液:在50mM pH8.0Tris-HCl緩衝液中加入NaCl至終濃度為IM ；
[0022]洗脫方式為線性梯度洗脫，所述B溶液在所述洗脫緩衝液中的體積百分含量變化為從O到100% ；
[0023]所用洗脫緩衝液的用量為3-4個柱體積；
[0024]所述洗脫緩衝液的流速為10ml/min ；
[0025]在280nm處監測洗脫液的吸光度，收集各洗脫峰；將各洗脫峰進行SDS-PAGE電泳，根據蛋白分子量確定哪種洗脫峰為目的洗脫液I。
[0026]上述任一所述的方法中，所述步驟(3)中，所述陶瓷羥基磷灰石的柱的內徑為1.6cm，填料高度為5cm ；
[0027]所用的洗脫緩衝液由如下A溶液和B溶液組成:
[0028]A 溶液:50mM pH6.5 的 PB 緩衝液；
[0029]B溶液:在50mM pH6.5的PB緩衝液中加入NaCl至終濃度為IM ；
[0030]洗脫方式為線性梯度洗脫，所述B溶液在所述洗脫緩衝液中的體積百分含量變化為從O到100% ；
[0031]所述洗脫緩衝液的用量為3-5`個柱體積；
[0032]所述洗脫緩衝液的流速為10ml/min ；
[0033]在280nm處監測洗脫液的吸光度，收集各洗脫峰；將各洗脫峰進行SDS-PAGE電泳，根據蛋白分子量確定哪種洗脫峰為目的洗脫液2。
[0034]上述任一所述的方法在製備IlS大豆球蛋白中的應用也屬於本發明的保護範圍；
[0035]所述IlS大豆球蛋白為沉降係數為IlS的大豆球蛋白。
[0036]本發明具有如下優點和有益效果:
[0037](I)將酸沉澱和柱層析有效結合，從而提高了 IlS大豆球蛋白的純度，純度在97%以上。
[0038](2) IlS大豆球蛋白分離純化工藝簡單，易於流水線分離純化，便於工業化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為IIS大豆球蛋白的Capto Q純化譜圖。
[0040]圖2為IIS大豆球蛋白的SDS-PAGE電泳檢測。
[0041 ] 圖3為IIS大豆球蛋白的CHT純化譜圖。
【具體實施方式】
[0042]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0043]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0044]50mM pH8.0的Tris-HCl緩衝液按照如下方法製備:121gTris鹼，加800ml純水，溶解後，用濃鹽酸調節pH值到8.0，然後用純水再定容到1L，配製成IM的母液,然後用純水按照1:20的體積比稀釋成50mM pH8.0的Tris-HCl緩衝液。
[0045]500mM pH6.5的PB緩衝液按照如下方法製備:[0046]A 液:取 NaH2PO4.H2027.6g 溶於蒸餾水，定容至 1000ml。
[0047]B 液:取 Na2HPO4.7H2053.6g 溶於蒸餾水，定容至 1000ml。
[0048]取A液68.5ml與B液3L 5ml混合，用水定容至400ml，調pH至6.5。
[0049]50mM pH6.5的PB緩衝液按照如下方法製備:將500mM pH6.5的PB緩衝液用水稀
釋10倍。
[0050]巰基乙醇購自北京益德益華科技發展有限公司，產品目錄號為M-6250。
[0051]脫脂大豆粉購自安陽市奇天生物技術有限公司，產品目錄號為201010101010。
[0052]Capto Q 填料購自 GE Healthcare，貨號為 20091005。
[0053]XK16/20 柱購自 GE Healthcare，貨號為 28_9889-37。
[0054]CHT 填料購自 Bio-Rad，貨號為 Bio-Scale CHTl。
[0055]實施例1、11S大豆球蛋白的分離純化
[0056]一、IlS大豆球蛋白的粗提取
[0057](一)將脫脂大豆粉按照lg:20ml的體積比與50mMpH8.0的Tris-HCl緩衝液(含IOmM巰基乙醇)混合，37°C提取I小時，28°C 1000Orpm離心15分鐘，收集上清液。
[0058](二)用2mol/L的HCl將上清液的pH調至6.4，28°C 1000Orpm離心15分鐘，收集沉澱。
[0059](三)將沉澱用50mMpH8.0的Tris-HCl緩衝液溶解，經0.45 μ m濾膜過濾收集濾液。
[0060]二、IlS大豆球蛋白的強陰離子交換層析
[0061](一)取IOmlCapto Q填料裝填XK16/20柱子(內徑1.6cm,填料高度為5cm),裝填完畢後用50mM pH8.0的Tris-HCl緩衝液平衡10個柱體積。
[0062](二)將步驟一得到的濾液上柱，採用50mM pH8.0的Tris-HCl緩衝液平衡柱子，平衡完畢後採用洗脫緩衝液進行線性梯度洗脫，共洗脫3-4個柱體積，流速為10ml/min，在280nm處測收集管溶液的吸光度，收集各洗脫峰。
[0063]洗脫緩衝液由A溶液和B溶液組成:
[0064]A 溶液:50mM ρΗ8.0Tris-HCl 緩衝液；
[0065]B溶液:在50mM pH8.0Tris-HCl緩衝液中加入終濃度為IM的NaCl ；
[0066]線性梯度洗脫過程中，B溶液在洗脫緩衝液中的體積比例由0%_100%逐漸提高。
[0067]洗脫曲線如圖1所示。
[0068]圖1中:A-1 (洗脫峰體積8mL)、A-2 (洗脫峰體積為7mL)和A-3 (洗脫峰體積為5mL)為三個洗脫峰。
[0069]三、採用SDS-PAGE電泳分別檢測各洗脫峰，確定目的蛋白分布峰。
[0070]分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%，以分子量標準蛋白(條帶大小分別為100、30、25、20、15、10、5、3.4KDa)以及三個洗脫峰A_1、A_2和A-3進行電泳，電泳條件為濃縮膠恆壓80V，分離膠恆壓120V。電泳結束後用考馬斯亮蘭G250染色液染色6小時以上，脫色觀察。檢測結果如圖2所示。
[0071]圖2 中，I 為 Capto Q 穿透 I ;2 為蛋白質 marker ；3 為 Capto Q 穿透 2 ;4 為 CaptoQ穿透3 ;5為Capto Q洗脫I ;6為Capto Q洗脫2 ;7為Capto Q洗脫3 ;8為Capto Q洗脫
4;9為CHT洗脫；10為CHT穿透。[0072]Capto Q穿透l、Capto Q穿透2、Capto Q穿透3和Capto Q穿透4分別是指上樣後不同時間點流出的溶液(未與柱子內的填料結合的液體);Capto Q洗脫1、CaptoQ洗脫2和Capto Q洗脫3分別代表三個洗脫峰A-1、A_2和A_3 ；Capto Q洗脫4代表洗脫峰A-3之後收集的洗脫液。
[0073]圖2表明，洗脫峰A-3中含有IlS大豆球蛋白(即分子量為340000_375000Da的蛋
白質)。
[0074]四、IlS大豆球蛋白的陶瓷羥基磷灰石純化
[0075]取IOml CHT填料裝填XK16/20柱子(內徑1.6cm,填料高度為5cm)，裝填完畢後用50mM pH6.5的PB緩衝液平衡10個柱體積，將步驟三檢測的含有IlS球蛋白的A-3樣品上柱，上樣完畢後繼續用50mM pH6.5的PB緩衝液平衡，平衡完畢，再用洗脫緩衝液進行線性梯度洗脫，共洗脫3-5個柱體積，流速為10ml/min，在280nm處測收集管溶液的吸光度，收集各洗脫峰。
[0076]洗脫緩衝液由A溶液和B溶液組成:
[0077]A 溶液:50mM ρΗ6.5 的 PB 緩衝液；
[0078]B溶液:在50mM pH6.5的PB緩衝液中加入終濃度為IM的NaCl ；
[0079]線性梯度洗脫過程中，B溶液在洗脫緩衝液中的體積比例由0%_100%逐漸提高。
[0080]洗脫曲線如圖3所示。
[0081]圖3中，B-1 (洗脫峰體積15mL)和B-2 (洗脫峰體積為7mL)為兩個洗脫峰。
`[0082]五、採用SDS-PAGE電泳分別檢測各洗脫峰，確定目的蛋白分布峰。
[0083]分離凝膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4%，以分子量標準蛋白(條帶大小分別為100、30、25、20、15、10、5、3.4KDa)以及兩個洗脫峰B-1和B-2進行電泳，電泳條件為濃縮膠恆壓80V，分離膠恆壓120V。電泳結束後用考馬斯亮蘭G250染色液染色6小時以上，脫色觀察。檢測結果如圖2所示。
[0084]圖2中，其中9代表CHT洗脫(B_2) ；10代表CHT穿透。CHT穿透是上樣過程中的收集的流穿溶液(未與柱子內的填料結合的液體)。
[0085]圖3表明，洗脫峰B-2含有IlS大豆球蛋白，經過第二次柱純化後IlS大豆球蛋白得到有效分離收集，HS大豆球蛋白的純度達到97%以上。
【權利要求】
1.一種IlS大豆球蛋白的製備方法，包括如下步驟: (1)將脫脂大豆粉用酸沉法得蛋白粗提液； (2)將(I)的粗提液進行強陰離子交換層析進行分離純化，收集目的洗脫液I; (3)將目的洗脫液I進行陶瓷羥基磷灰石層析分離純化，收集目的洗脫液2，即為目的蛋白； 所述目的蛋白為沉降係數為HS的大豆球蛋白。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述步驟(1)的步驟為: 1)將所述脫脂大豆粉與含有IOmM巰基乙醇的Tris-HCl緩衝液按照lg:20ml的比例混合，37°C提取I小時，離心後收集上清液； 2)將I)的上清液pH調至6.4，離心收集沉澱； 3)將2)的沉澱用Tris-HCl緩衝液溶解，經濾膜過濾收集濾液，即為所述蛋白粗提液； 所述Tris-HCl緩衝液為50mM pH8.0的Tris-HCl緩衝液； 所述濾膜為0.45 μ m濾膜。
3.根據權 利要求1或2所述的方法，其特徵在於:所述步驟(2)中，強陰離子交換層析的柱填料為Capto Q ； 所述強陰離子交換層析的柱的內徑為1.6cm，填料高度為5cm ； 所用的洗脫緩衝液由如下A溶液和B溶液組成: A 溶液:50mM ρΗ8.0Tris-HCl 緩衝液； B溶液:在50mM pH8.0Tris-HCl緩衝液中加入NaCl至終濃度為IM ； 洗脫方式為線性梯度洗脫，所述B溶液在所述洗脫緩衝液中的體積百分含量變化為從O 到 100% ； 所用洗脫緩衝液的用量為3-4個柱體積； 所述洗脫緩衝液的流速為10ml/min ； 在280nm處監測洗脫液的吸光度，收集各洗脫峰；將各洗脫峰進行SDS-PAGE電泳，根據蛋白分子量確定哪種洗脫峰為目的洗脫液I。
4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特徵在於:所述步驟(3)中，所述陶瓷羥基磷灰石的柱的內徑為1.6cm,填料高度為5cm ； 所用的洗脫緩衝液由如下A溶液和B溶液組成: A溶液:50mM pH6.5的PB緩衝液； B溶液:在50mM pH6.5的PB緩衝液中加入NaCl至終濃度為IM ； 洗脫方式為線性梯度洗脫，所述B溶液在所述洗脫緩衝液中的體積百分含量變化為從O 到 100% ； 所述洗脫緩衝液的用量為3-5個柱體積； 所述洗脫緩衝液的流速為10ml/min ； 在280nm處監測洗脫液的吸光度，收集各洗脫峰；將各洗脫峰進行SDS-PAGE電泳，根據蛋白分子量確定哪種洗脫峰為目的洗脫液2。
5.權利要求1-4任一所述的方法在製備IlS大豆球蛋白中的應用； 所述IlS大豆球蛋白為沉降係數為IlS的大豆球蛋白。
【文檔編號】C07K1/36GK103755792SQ201410026014
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月21日 優先權日:2014年1月21日
【發明者】譙仕彥, 白晶, 宋青龍, 何濤 申請人:北京龍科方舟生物工程技術有限公司