一種製備A型肝炎滅活疫苗的方法

2023-10-18 07:28:09 1

專利名稱：一種製備A型肝炎滅活疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種製備A型肝炎滅活疫苗的新方法。
背景技術：
A型肝炎，簡稱A肝，是由A型肝炎病毒引起的一種嚴重危害人類健康的急性傳 染病。A肝主要通過「糞-口」途徑傳播，或個人間的傳播，或因汙染了A肝病毒的水或者 食物從而引起A肝爆發。大齡兒童和成人感染A肝後，70%以上為臨床型感染，病死率為 0. 3% 0. 6% ；50歲以上患者的病死率為1. 8% ；慢性肝病者感染A肝後，發生急性肝衰竭 的危險性升高。隨著生活條件的改善，成年人感染A肝人數有增多趨勢，臨床型A肝比例上 升，從而A肝成為較嚴重的公共衛生問題。我國是A型肝炎高發區，每年至少有M萬人患A型肝炎，造成巨大的經濟損失和 社會危害，接種A型肝炎疫苗是預防A型肝炎流行的最有效措施。目前世界上有兩種預防控制A肝的疫苗，一種是A肝減毒活疫苗，A肝減毒活疫 苗如L-A-I株已用於規模生產近20年，在預防控制A肝的爆發和流行、降低發病率方面起 到了巨大作用，但減毒活疫苗存在毒力返祖，對一些免疫缺陷個體可能誘發嚴重疾病等缺 點；另一種是A肝滅活疫苗，A肝滅活疫苗具有安全性好、免疫後抗體水平高、效期長、穩定 性好的優點。目前國內生產的A型肝炎滅活疫苗，由於各生產廠家使用的毒株、細胞基質和生 產工藝不同，產品質量參差不齊。我國人口眾多，A肝疫苗遠不能滿足國內市場需求。

發明內容
本發明的目的是提供一種製備A型肝炎滅活疫苗的新方法。為了實現本發明目的，本發明的一種製備A型肝炎滅活疫苗的方法，其是將A肝 病毒與人胚肺二倍體細胞MRC-5混合吸附後接種到細胞工廠增殖A肝病毒，至病毒增殖高 峰期，用胰酶消化細胞，收穫細胞病毒液，經超聲破碎，氯仿抽提，超濾膜超濾，去除細胞雜 蛋白，然後經過凝膠過濾層析純化，除菌過濾，氫氧化鋁佐劑吸附，製成A型肝炎滅活疫苗。本發明的目的還可以採用以下的技術措施來進一步實現。本發明的一種製備A型肝炎滅活疫苗的方法，包括如下步驟1)按常規方法培養人胚肺二倍體細胞MRC-5，長成單層後將細胞基質用胰酶消化 分散為單個細胞，加入含10%小牛血清的MEM細胞培養液使細胞濃度為每毫升含100-150 萬個細胞，細胞液按0. 05-0. IMOI加入A肝病毒，在20-30°C溫度下進行混合吸附30-90分 鍾；其中，所述MEM 為 0. 03% Glu,0. 08% NaHC03、0. 01%青黴素禾口 0. 01%鏈黴素。2)將混合吸附的細胞-病毒混合液用含10V/V%小牛血清的MEM細胞培養液稀釋 10倍後按0. 5M0I接種於2-40層細胞工廠增殖A肝病毒；培養溫度為34_35°C，培養時間為 2H4 天。
3)病毒增殖高峰期，用0. 125W/v%胰酶常規消化細胞，以每平方釐米麵積加入 20 μ 1 0. OlM ρΗ值7. 2的PBS收集細胞病毒混合液。4)超聲破碎細胞病毒混合液，超聲破碎的輸出功率為1500W，每次在冰浴中超聲5 分鐘破碎細胞，共超聲4 6次，使破碎率達98%以上。5)離心步驟4)得到的混合液，取上清加入氯仿抽提，離心後取上層水相，得到粗 制A肝病毒液。其中，抽提為按三氯甲烷與病毒液1 2的體積比混合，振搖20分鐘，以 每分鐘4500轉的速度離心20分鐘，吸取上層水相。蛋白相再用抽提緩衝液(0. OlM PBS, ΡΗ7. 4)抽提4次，抽提4次即能將大部分病毒回收，合併上層水相。6)將步驟幻製得的粗製A肝病毒液經超濾膜超濾濃縮，所用超濾膜的分子量為 50-100KD。7)濃縮的病毒液經凝膠層析純化後，經0. 2 μ m濾膜除菌過濾，濾液用甲醛滅活。 其中，凝膠層析所用層析柱為Wienyl Sepharose 6FF。8)滅活後的病毒液經氫氧化鋁佐劑吸附，製成A型肝炎滅活疫苗。前述的方法，其中所用A肝病毒毒種為A肝病毒株SH，該毒株分離自A型肝炎 急性期患者糞便，經MRC-5細胞適應，命名為SH毒株，現已保藏於中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區大屯路中科院微生物研究所，保藏編號 CGMCCN0. 4501，保藏日期 2010 年 12 月 21 日。優選地，步驟1)所述的混合吸附為將長成單層的二倍體細胞棄去細胞生長液，用 0. 01mol/L PBS (pH6. 8)洗細胞面3次，加入0. 125w/v%胰酶-EDTA消化細胞，加入MEM細 胞培養液使細胞濃度為每毫升含100-150萬個細胞，細胞液按0. 05-0. IMOI加入A肝病毒 在20-30°C溫度下進行混合吸附30-90分鐘。優選地，步驟2、所述的培養為多層細胞工廠培養，培養溫度為34-35°C，培養時間 為21- 天，期間每7天更換細胞維持液一次，細胞維持液為MEM細胞培養液加2V/V%的小 牛血清。細胞工廠是丹麥NUNC公司出品的CELL FACTORIES或美國CORNING公司出品的 Cell STACK，譯成中文為細胞工廠或細胞培養室，其培養原理相同，外觀尺寸略有不同。細 胞工廠可有效節省空間和培養液，保證操作的無菌性。採用本發明方法製得的A型肝炎滅活疫苗，其滅活A型肝炎病毒抗原濃度為 640 800EU/ml。經小鼠體內效力試驗結果表明，EID50高於參比苗，其免疫原性優於參比
田ο本發明採用的新分離的產毒量高、培養周期短、人胚肺二倍體細胞適應良好的甲 型肝炎病毒毒株SH，可有效提高病毒產率，且安全性更好；採用細胞-病毒混合吸附技術， 提高了病毒產量，縮短了病毒增殖周期；使用細胞工廠培養細胞，有效利用了空間，節省了 廠房面積，提高了疫苗生產能力；經氯仿抽提、超濾膜超濾濃縮，可有效去除雜蛋白，再經凝 膠過濾層析純化，可得到高純度A型肝炎病毒滅活疫苗。本發明的方法可以提高疫苗安全性，提高疫苗產量，簡化工藝，縮短生產周期，降 低生產成本，實現A型肝炎滅活疫苗的規模化生產。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。以下實施例中採用的細胞工廠是美國CORNING公司出品的CellSTACK。實施例1取長滿單層的細胞工廠培養的人胚肺二倍體細胞(MRC-幻，經0. 125W/v%胰蛋白 酶-EDTA消化細胞，加入含10%小牛血清的MEM細胞培養液。其中，所述MEM為0. 03% Glu、 0. 08% NaHCO3>0. 01%青黴素和0. 01%鏈黴素。MEM購自北京清大天一生物技術有限公司， 生產批號080302。使細胞濃度為每毫升含100-150萬個細胞，細胞液按0. 05-0. IMOI加入A肝病毒 在20-30°C溫度下進行混合吸附30-90分鐘。將混合吸附的細胞-病毒混合液用含10% 小牛血清的MEM細胞培養液稀釋10倍後按0. 5M0I接種於2_40層細胞工廠增值A肝病 毒，置35°C 士0.5°C靜置培養21- 天，期間每隔7天換1次細胞維持液(細胞維持液為 MEM細胞培養液加2%的小牛血清)。待病毒增殖高峰期，用0. 125W/v%的胰酶常規消化 細胞，以每平方釐米麵積加入20 μ 1 0. OlM ρΗ值7. 2的PBS收集細胞病毒混合液。超聲 破碎細胞病毒混合液，超聲破碎為輸出功率1500W，每次在冰浴中超聲5分鐘破碎細胞，共 超聲5次。破碎後2000rpm離心10分鐘取上清病毒液，病毒液加入氯仿抽提，按三氯甲烷 與病毒液1 2的體積比混合，振搖20分鐘，以每分鐘4500轉的速度離心20分鐘，吸取上 層水相；蛋白相再用抽提緩衝液(0. OlM PBS, pH7. 4)抽提4次，抽提4次即能將大部分病 毒回收，合併上層水相。抽提液經截留分子量為50-100KD的超濾膜超濾濃縮10-40倍後 用Wienyl Sepharose 6FF疏水凝膠層析柱純化，用0. 9mol/L PB (pH6. 8)作為上樣緩衝液， 用O.Olmol/L PBS (pH6. 8)作為梯度洗脫液，收集病毒洗脫峰，為純化的A肝病毒液，再經 0. 2 μ m濾膜除菌過濾，在無菌條件下加入終濃度為80μ g/ml的甲醛37°C滅活12天。滅活 的A肝病毒液經進一步檢驗合格後，根據病毒抗原性滴度水平稀釋至1280EU/ml，經氫氧化 鋁佐劑吸附製成半成品，將半成品分裝於無菌的西林瓶中，製成成品疫苗。本發明製備的A型肝炎滅活疫苗經無菌試驗、異常毒性試驗、ρΗ值等檢驗後，各項 指標均達到合格標準，氫氧化鋁吸附後A肝病毒無解離，體外相對效力達到1. 12，檢驗結果 如表1所示。表1實施例1製備的A型肝炎滅活疫苗檢驗結果
權利要求
1.一種製備A型肝炎滅活疫苗的方法，其特徵在於，將A肝病毒與人胚肺二倍體細胞 MRC-5混合吸附後接種到細胞工廠增殖A肝病毒，至病毒增殖高峰期，用胰酶消化細胞，收 獲細胞病毒液，經超聲破碎，氯仿抽提，超濾膜超濾，去除細胞雜蛋白，然後經過凝膠過濾層 析純化，除菌過濾，氫氧化鋁佐劑吸附，製成A型肝炎滅活疫苗。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，包括如下步驟1)按常規方法培養人胚肺二倍體細胞MRC-5，長成單層後將細胞基質用胰酶消化分散 為單個細胞，加入含10%小牛血清的MEM細胞培養液使細胞濃度為每毫升含100-150萬個 細胞，細胞液按0. 05-0. IMOI加入A肝病毒，在20-30°C溫度下進行混合吸附30-90分鐘；其中，所述 MEM 為 0. 03% Glu,0. 08% NaHC03、0. 01%青黴素禾口 0. 01%鏈黴素；2)將混合吸附的細胞-病毒混合液用含10V/V%小牛血清的MEM細胞培養液稀釋10 倍後按0. 5M0I接種於2-40層細胞工廠增殖A肝病毒；3)病毒增殖高峰期，用0.125w/V%胰酶常規消化細胞，以每平方釐米麵積加入20 μ 1 0. OlM ρΗ值7. 2的PBS收集細胞病毒混合液；4)超聲破碎細胞病毒混合液；5)離心步驟4)得到的混合液，取上清加入氯仿抽提，離心後取上層水相，得到粗製甲 肝病毒液；6)將步驟幻製得的粗製A肝病毒液經超濾膜超濾濃縮；7)濃縮的病毒液經凝膠層析純化後，經0.2 μ m濾膜除菌過濾，濾液用甲醛滅活；其中，凝膠層析所用層析柱為Wienyl Sepharose 6FF ；8)滅活後的病毒液經氫氧化鋁佐劑吸附，製成A型肝炎滅活疫苗。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所用A肝病毒毒種為A肝病毒株SH， 保藏號為 CGMCC NO. 4501。
4.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述步驟幻培養溫度為34-35°C，培 養時間為21- 天。
5.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述步驟4)的超聲破碎，其輸出功率 為1500W，每次在冰浴中超聲5分鐘破碎細胞，共超聲4 6次。
6.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述步驟幻的氯仿抽提為按三氯甲 烷與病毒液1 2的體積比混合，振搖20分鐘，以每分鐘4500轉的速度離心20分鐘，吸取 上層水相。
7.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，所述步驟6)採用的超濾膜，其截留的 分子量為50-100KD。
全文摘要
本發明提供了一種製備A型肝炎滅活疫苗的方法，其是將A肝病毒株SH與人胚肺二倍體細胞MRC-5混合吸附後接種到細胞工廠增殖A肝病毒，至病毒增殖高峰期，用胰酶消化細胞，收穫細胞病毒液，經超聲破碎，氯仿抽提，超濾膜超濾，去除細胞雜蛋白，再經凝膠過濾層析純化，除菌過濾，氫氧化鋁佐劑吸附，製成A型肝炎滅活疫苗。採用本發明方法製備的A型肝炎滅活疫苗經小鼠體內效力試驗結果表明，ED50高於參比苗，其免疫原性優於參比苗。本發明方法可以提高疫苗安全性，簡化工藝，縮短生產周期，降低生產成本，實現A型肝炎滅活疫苗的規模化生產。
文檔編號A61P31/14GK102058882SQ201010622268
公開日2011年5月18日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者孟紅彥, 張現臣, 王春雨, 鍾漢斌, 魏文進, 黃秋香 申請人:北京民海生物科技有限公司