一種高產菊粉內切酶的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株的製作方法

2023-10-18 18:04:49 2

一種高產菊粉內切酶的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株，所述菌株命名為畢赤酵母（Pichia?pastoris）GS115-A3-G2，已於2014年04月16日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCC?NO：9049。本發明的菌株通過兩種質粒pPIC9K和pGAPZαA將菊粉內切酶基因INU2多拷貝整合入畢赤酵母GS115基因組上，並從中篩選獲得了高效表達菊粉內切酶的雙啟動子多拷貝酵母基因工程菌株。實驗證實，該菌株在3L高密度發酵中菊粉酶酶活性可達3006U/ml，簡單純化的粗酶液即可直接用於水解菊粉產生低聚果糖，轉化效率高，使其在工業中用菊粉酶解法生產低聚果糖成為現實，具有巨大的實用價值。
【專利說明】—種高產菊粉內切酶的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程和發酵工程領域，涉及一種高水平表達菊粉內切酶單一酶組分的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株及構建方法與應用。
【背景技術】
[0002]菊粉是由β粉2，1-糖苷鍵連接的D-呋喃果糖分子組成的鏈狀大分子，末端常含有一個葡萄糖基。菊粉酶(inulinase)是一種催化水解菊粉中β _2，1-呋喃果糖苷鍵的水解酶。根據其對底物的作用方式，可將其分為2類:一類是菊粉外切酶(exoinulinase)，它能從菊粉末端逐一切下一個果糖單位，產物為果糖及少量葡萄糖；另一類是菊粉內切酶(endoin μ linase)，它從菊粉分子內部隨機切斷某個β _2，1-糖苷鍵，水解產物為寡聚糖，可以用來生產低聚果糖。
[0003]低聚果糖(Inulooligosaccharides, 10S)是功能性低聚糖,在食品、醫藥等方面具有極大的應用價值，相比於蔗糖，具有難消化性、食物纖維的作用、低齲齒性、促進雙歧桿菌的增殖、改善脂質代謝作用等優越性，適合現代人們對食品安全性、健康性及功能性等需求的特點，逐漸成為菊粉生物轉化應用中極其重要的方向。
[0004]低聚果糖的生產方法主要有兩種:一種是以蔗糖為原料利用呋喃果糖苷轉移酶(Frucofranosidase)作用來製備,該方法的缺點是反應產物中生成大量的葡萄糖,通常佔到35%以上，去除難度大，導致其生產成本的增加；另一種方法是以菊粉為原料利用微生物產出生產用的內切型菊粉酶酶解製備低聚果糖，該方法的優點勢是只需一步酶解就可以生成80%以上的高純度低聚果糖，產物中的葡萄糖含量極低，又由於菊粉的來源豐富，價格便宜，使得該方法具有非常廣闊的應用前景。
[0005]用菊粉酶法生產低聚果糖的工藝，對微生物具有較高要求，首先微生物所產的酶液中只能有內切型菊粉酶，而不能有外切酶及轉移酶的存在；第二是微生物所產酶液中菊粉酶的酶活力要高、穩定性要好。因此，獲得優良的產菊粉內切酶微生物是以菊粉為原料用菊粉酶解法生產低聚果糖能否工業應用的關鍵。然而自然界菌株中已知具有上述功能菌株一般表達水平很低並且既表達菊粉內切酶也表達菊粉外切酶，使的大規模生產困難而且產物純化成本很高，所以到目前為止，菊粉內切酶生產低聚果糖的工藝沒有真正實現在工業生產中規模化應用。因此，通過生物技術開發出酶活力高、產量大、熱穩定性好的產菊粉內切酶菌株意義重大。經檢索，目前具有高水平表達菊粉內切酶單一酶組分的重組畢赤酵母菌株還未見報導。

【發明內容】

[0006]針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種高水平表達菊粉內切酶單一酶組分的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母菌株及構建方法與應用。
[0007]本發明的技術方案概述:分別構建組成型和誘導型兩種啟動子所調控的菊粉內切酶INU2基因的表達質粒，再將這兩種質粒多拷貝整合在宿主巴斯德畢赤酵母的基因組上，獲得高產菊粉內切酶的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株，實現對菊粉內切酶INU2的高水平表達。
[0008]本發明所述的高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株，其特徵在於:所述菌株命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3-G2，已於2014年04月16日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCCNO:9049o
[0009]上述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株的構建方法，步驟是:
[0010]克隆菊粉內切酶基因INU2，將菊粉內切酶基因，通過限制性內切酶位點分別與畢赤酵母表達質粒PPIC9K和pGAPZ αΑ連接獲得重組表達載體pPIC9K_INU2和pGAPZ a A-1NU2 ;然後將pP IC9K_INU2導入巴斯德畢赤酵母GSl 15中，通過遺傳黴素G418篩選得到多拷貝AOX啟動子的轉化子，再將pGAPZ a A-1NU2導入多拷貝AOX啟動子的轉化子中，通過博來黴素抗性篩選獲得多拷貝GAP啟動子的轉化子；用實時螢光定量PCR確定多拷貝轉化子的拷貝數，對不同拷貝數的轉化子進行誘導發酵比較，確定出產量最高的雙啟動子多拷貝轉化子，即獲得高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株。
[0011]上述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株的構建方法中:所述產量最高的雙啟動子多拷貝轉化子優選是GS115-A3-G2，其中:GS115表示巴斯德畢赤酵母基因，A3表示有3個AOX啟動子，G2表示有2個GAP啟動子。
[0012]本發明所述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌在水解菊粉用於生產低聚果糖中的應用。
[0013]將本發明所述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌在3L高密度發酵中菊粉酶酶活性可達3006U/ml，簡單純化的粗酶液即可直接用於水解菊粉產生低聚果糖，轉化效率高，在工業中用菊粉酶解法生產低聚果糖具有巨大的發展前景。
[0014]本發明的有益效果是:所述工程菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3-G2能夠利用組成型和誘導型啟動子調控菊粉內切酶INU2的高水平表達，可以無需甲醇誘導就可以高產菊粉內切酶INU2，在3L高密度發酵中，未經甲醇誘導，粗酶液(發酵上清液)酶活即可以達到800U/ml以上，可以通過組成型啟動子來達到快速發酵獲取菊粉內切酶INU2 ;也可以再用甲醇進行該菌株發酵的誘導，在3L高密度發酵中，甲醇誘導8~10天，粗酶液酶活可達到3000U/ml以上，酶蛋白分泌量在2g/L以上，預示可以用此來工業上大批量生產菊粉內切酶。並且提供的重組菌株所產的重組菊粉內切酶INU2可以直接作用於底物菊粉來生產高附加值的低聚果糖，具有巨大的商業應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]本發明所述巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3_G2,已於2014年04月16日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCC NO:9049。
[0016]圖1:重組質粒pPIC9K-1NU2的構建示意圖。
[0017]圖2:1NU2和GAPDH的標準曲線。
[0018]圖3:多拷貝INU2轉化子酶活曲線。[0019]圖4:質粒pGAPZ a A-3INU2的構建方案圖。
[0020]圖5:質粒pGAPZ a A-1NU2的構建圖。
[0021]圖6:質粒 pGAPZ a A-2INU2 的構建圖。
[0022]圖1:質粒 pGAPZ a A-3INU2 的構建圖。
[0023]圖8:GS115-A3-G2的生長和酶活曲線。
[0024]圖9:薄層層析結果圖。
[0025]圖10:1mageJ軟體分析結果圖。
【具體實施方式】
[0026]以下結合具體實施例，對本
【發明內容】
進行進一步說明。
[0027]下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規條件，如《分子克隆實驗指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2002)中所述的條件進行。
[0028]本發明的實施例中使用了一下菌株和質粒:
[0029]大腸桿菌(E.coli DH5 α ):北京全式金生物科技有限公司。
[0030]無花果麴黴(Aspergillus ficuum) CGMCC3.4322:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0031]pPIC9K質粒:表達質粒，具有AOX啟動子，遺傳黴素(G418)抗性，購買於Invitrogen0
[0032]pGAPZ a A質粒:表達質粒，具有GAP啟動子，博來黴素(Zeocin)抗性，購買於Invitrogen0
[0033]巴斯德畢赤酵母GS115:購買於Invitrogen。
[0034]實施例1:Α0Χ啟動子菊粉內切酶INU2多拷貝重組畢赤酵母的構建
[0035]1.重組質粒pPIC9K-1NU2的構建
[0036]1.1基因組的提取
[0037]用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction KitCBioer Technology c0., Ltd.)提取無花果麴黴(Aspergillus ficuum) CGMCC3.4322的基因組，具體製備方法參考試劑盒的操作手冊。
[0038]1.2基因INU2的克隆
[0039]將1.1提取的基因組作為PCR反應的模板，根據NCBI上已知的菊粉內切酶基因序列設計 I 對引物:INU2-EcoR I 上遊:ACGCGAATTCCAGTCTAATGATTACCGTCCTT (劃線部分為EcoR I 酶切位點)，INU2-Not I 下遊:ATAGCGGCCGCTCATTCAAGTGAAACACTCC(劃線部分為 NotI酶切位點)，進行PCR反應，克隆INU2。PCR擴增條件:預變性94°C 2min;98°C IOsec;退火55°C 30sec;延伸72°C 2min;35個循環；72°C延伸IOmin; 12°C保溫。利用DNA純化回收試劑盒(購買於天根生化科技(北京)有限公司)對目的基因產物進行回收，具體操作方法參考試劑盒操作手冊。1%瓊脂糖凝膠電泳驗證擴增結果。目的條帶大小為1503bp。
[0040]1.3重組質粒pPIC9K-1NU2的構建
[0041]用限制性內切酶EcoR I和Not I分別對回收的目的基因產物INU2和質粒載體PPIC9K進行雙酶切，利用DNA純化回收試劑盒分別回收酶切後的INU2和質粒片段，然後利用T4連接試劑盒將這兩個片段進行連接，形成重組質粒載體pPIC9K-1NU2。它的構建過程如圖1。具體酶切和連接步驟，參考操作說明書。
[0042]1.4測序分析
[0043]將1.3中的連接液轉化大腸桿菌(E.coli DH5a )，具體轉化步驟參考說明書，獲得的陽性克隆送至英濰捷基(上海)貿易有限公司進行測序分析，INU2的開放閱讀框(ORF)包括1482bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，編碼494個胺基酸。
[0044]經測序無誤的陽性克隆表達質粒命名為pPIC9K-1NU2。
[0045]2.pPIC9K-1NU2電轉畢赤酵母GSl 15及其多拷貝的篩選驗證
[0046]2.1製備線性化質粒pPIC9K-1NU2
[0047]利用限制性內切酶Sacl/Sall對質粒pPIC9K_INU2進行酶切線性化，利用DNA純化回收試劑盒進行回收，確保回收濃度在200ng/l.! I以上，保存備用。
[0048]2.2製備畢赤酵母GSl 15感受態細胞
[0049](I)接種畢赤 酵母單菌落到含有5ml YPD液體培養基中，30°C培養過夜；
[0050](2)轉接培養液到含有50ml液體YPD的大三角瓶中，接種量1% (v/v)，30°C培養過夜，直到OD6qq=L 3~1.5 ;
[0051](3)在1500g，4°C條件下，離心培養液5min，沉澱用50ml冰浴的雙蒸水重懸；
[0052](4)在第三步條件下執行離心操作，沉澱細胞用25ml冰浴的雙蒸水重懸；
[0053](5)在第三步條件下執行離心操作，沉澱細胞用2ml冰浴的IM的山梨醇溶液重懸;
[0054](6)在第三步條件下執行離心操作，沉澱細胞用Iml冰浴的IM的山梨醇溶液重懸，使菌懸液體積大約為1.5ml，得到畢赤酵母感受態細胞，每管80μ I於-80°C中保存備用。
2.3電轉質粒
[0055](I)將2.2中製備的80 μ I感受態細胞和2.1中製備的5~20 μ g線性化質粒PPIC9K-1NU2加入到1.5ml預冷的離心管中，混勻。將反應液轉移到預先冰浴的轉化杯中；
[0056](2)冰浴裝有轉化液的轉化杯5min ；
[0057](3)按照如下參數設置電轉儀，進行酵母電轉化:Cuvette Gap0.2cm ；Voltagel.5kV ；Field Strength7.5kV/cm ；Capacitor25 μ F;Resistor (pulse control)400 ；Time constant approximately9.0msec ；
[0058](4)脈衝後，立即向轉化杯中加入1ml預冷的IM的山梨醇溶液，把轉化液轉移到一個新的1.5ml離心管中；
[0059](5) 30°C靜置培養 I ~2h ;
[0060](6)分別吸取畢赤酵母GS115電轉液50 μ 1，100 μ I, 150 μ 1，分別塗布在MD培養
基上;
[0061](7)30°C培養直至轉化子出現。
[0062]2.4篩選不同遺傳黴素G418抗性的轉化子
[0063](I)吸取l-2ml無菌水於轉化子平板上，用滅菌刮子將His4+轉化子全部洗脫下來，將細胞懸液混合轉移到滅菌的離心管中，用分光光度計測定濃度，得到0D_=5X IO7個細胞/ml的細胞懸液。
[0064](2)準備 10 個 YPD 平板，遺傳黴素 G418 濃度分別為 0,0.25,0.5、1、1.5、2、2.5、3、
4、8mg/L，在每個YPD平板塗上IO5個細胞，置於30°C孵育，2~5天出現抗性克隆子。[0065](3)挑取步驟(2)中長出來的抗性單克隆子，接種於對應同抗性的YPD液體培養基中，30°C，200r/min,過夜培養，檢測是否能夠在該抗性壓力下正常生長，如果長起來，則繼續加大G418抗性，直至該克隆無法生長。
[0066](4)挑選出步驟(3)中檢測出的具有明顯不同G418抗性的單克隆轉化子，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組，備用於實時螢光定量PCR實驗，並保存菌株。
[0067]2.5實時螢光定量PCR確定轉化子的INU2拷貝數
[0068](I)標準曲線的建立
[0069]根據文獻的報導，GAPDH (甘油醛_3_磷酸脫氫酶)在畢赤酵母基因組中是單拷貝，因而選取GAPDH (甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因作為內參基因，根據NCBI上已知的GAPDH基因序列設計引物:GAP-上遊:CACAATGGCTATCACTGTCG，GAP-下遊:CACACTACAGCCCGCATT，以野生型GS115 (his4_)基因組作為模板，克隆GAPDH基因。將GAPDH基因構建到pEASY_T3載體上，獲得重組質粒pEASY-GAP，操作方法參見pEASY-T3克隆盒的指導說明書。同樣的方法，將目的基因INU2也構建到pEASY-T3載體上，獲得重組質粒pEASY_INU2。
[0070]參考天根生化科技(北京)有限公司提供的螢光定量實驗技術手冊。用核酸定量儀檢測提取的標準質粒PEASY-1NU2和pEASY-GAP的濃度，根據公式:
[0071]
【權利要求】
1.一種高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株，其特徵在於:所述菌株命名為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115-A3-G2，已於2014年04月16日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCCNO:9049o
2.權利要求1所述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株的構建方法，步驟是: 克隆菊粉內切酶基因INU2，將菊粉內切酶基因，通過限制性內切酶位點分別與畢赤酵母表達質粒PPIC9K和pGAPZ a A連接獲得重組表達載體pPIC9K_INU2和pGAPZ a A-1NU2 ;然後將pPIC9K-1NU2導入巴斯德畢赤酵母GSl 15中，通過遺傳黴素G418篩選得到多拷貝AOX啟動子的轉化子，再將pGAPZ a A-1NU2導入多拷貝AOX啟動子的轉化子中，通過博來黴素抗性篩選獲得多拷貝GAP啟動子的轉化子； 用實時螢光定量PCR確定多拷貝轉化子的拷貝數，對不同拷貝數的轉化子進行誘導發酵比較，確定出產量最高的雙啟動子多拷貝轉化子，即獲得高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組巴斯德畢赤酵母工程菌株。
3.如權利要求2所述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌株的構建方法，其特徵在於:所述產量最高的雙啟動子多拷貝轉化子是GS115-A3-G2，其中:GSl 15表示巴斯德畢赤酵母基因，A3表示有3個AOX啟動子，G2表示有2個GAP啟動子。
4.權利要求1所述高產菊粉內切酶INU2的雙啟動子多拷貝重組畢赤酵母工程菌在水解菊粉用於生產低聚果糖中的應用。
【文檔編號】C12N1/19GK103981112SQ201410215648
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月21日 優先權日:2014年5月21日
【發明者】林建強, 林勝強, 白楊, 林建群 申請人:山東大學