一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法
2023-10-18 16:59:24 1
專利名稱：一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法
技術領域：
本發明公開一種ELISA方法，尤其涉及一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心 ELISA方法，屬於醫藥生物檢測技術領域。
背景技術：
血管生長素(Angiogenin，ANG)是存在於正常血漿及實體腫瘤組織中的一種分子量為14. lkD.pl 9. 5的蛋白質，基因定位於染色體14qll。ANG是一種能有效促進新生血管形成的刺激因子，具有很強的促血管生成作用，ANG被認為是促血管生成最主要的細胞因子之一。ANG最初是於1985年從人結腸癌細胞株HT-29的培養液中分離而得，隨後在人血漿和牛乳中檢測到它的存在，它屬於核糖核酸酶超家族成員，一級結構與人胰核糖核酸酶有 35 %相同，具有微弱的核糖核酸酶活性。ANG是通過與血管內皮細胞表面的受體結合，激活胞內的第二信使而發揮一系列生物學作用(如介導細胞粘連、誘導細胞入侵、組織新生管狀結構的形成等)，從而達到促進新生血管形成的作用。ANG促進新生血管形成的研究意義主要體現在三個方面(1)改善局部微循環，特別是在血循環較差的半月板纖維軟骨的修復以及梗塞或創傷、燒傷等損傷組織中的重建側枝循環等過程中發揮著重要的作用。(2)實體腫瘤的生長依賴於腫瘤內部血管的快速生長， 因此可以通過抑制ANG的生物學活性，阻止新生血管的形成從而達到治療腫瘤的目的。(3) 研究表明，胰腺癌、乳腺癌等患者的外周血血清中，ANG的水平明顯升高，血清ANG的水平與這些腫瘤的發展及轉移呈顯著正相關。另外，研究還表明，胃癌、肺癌、大腸癌及乳腺癌患者血清中ANG水平較正常對照明顯增高，因此，可以通過檢測血清及腫瘤組織中ANG的水平來預測腫瘤的發生與發展情況。
發明內容
針對上述問題，本發明公開一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法檢測 ANG含量，用於腫瘤、自身免疫疾病等Angiogenin相關疾病的臨床輔助診斷。本發明的技術方案是這樣的一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法， 首先構建ANG2基因製備ANG2蛋白，再表達並純化ANG2蛋白，以ANG2蛋白為抗原製備高效價和高特異性抗人ANG2單克隆抗體和ANG2多克隆抗體，以抗人ANG2多克隆抗體為捕獲抗體，以生物素標記的抗人ANG2單克隆抗體為檢測抗體，建立檢測可溶性ANG2含量的雙抗夾心ELISA方法。上述的一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，其中，所述的構建ANG2 基因製備ANG2蛋白應用RT-PCR技術釣取ANG2基因序列，構建pET28a/ANG2重組表達質粒， 並轉入大腸桿菌BL21宿主菌株中，IPTG誘導表達His-ANG2融合蛋白，鎳柱親和層析純化 ANG2蛋白，採用SDS-PAGE分析表達。上述的一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，其中，所述的ANG2單克隆抗體的製備工藝採用純化的His-ANG2融合蛋白作為抗原，免疫BALB/c小鼠和骨髓瘤細胞進行細胞融合，以HAT培養基選擇培養，間接ELISA法篩選陽性孔，將克隆後的雜交瘤細胞接種入小鼠腹腔產生腹水，收集腹水並進行純化。上述的一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，其中，所述的ANG2多克隆抗體的製備工藝，其特徵在於，採用純化的His-ANG2融合蛋白免疫家兔，製備並純化多克隆抗體。與現有技術相比，本發明具有檢測方法簡單，靈敏度高，為腫瘤及自身免疫疾病等 Angiogenin相關疾病的診斷、療效觀察及預後判斷提供了一種簡便、經濟的檢測方法，為研究Angiogenin蛋白功能及在腫瘤篩查診斷等方面奠定基礎。說明書附1為雙抗夾心ELISA標準曲線；橫坐標為不同稀釋濃度的ANG2抗原標準品，縱坐標為相應的0D450nm吸光值。
具體實施例方式下面結合具體實施例，對本發明做進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。一、ANG2基因的構建、表達及純化1 方法1. 1ANG2基因的釣取ANG2 基因 cDNA 序列1 ATGTGGCAGA TTGTTTTCTT TACTCTGAGC TGTGATCTTG TCTTGGCCGCAGCCTATAAC AACTTTCGGA AGAGCATGGA CAGCATAGGA AAGAAGCAAT101 ATCAGGTCCA GCATGGGTCC TGCAGCTACA CTTTCCTCCT GCCAGAGATGGACAACTGCC GCTCTTCCTC CAGCCCCTAC GTGTCCAATG CTGTGCAGAG201 GGACGCGCCG CTCGAATACG ATGACTCGGT GCAGAGGCTG CAAGTGCTGGAGAACATCAT GGAAAACAAC ACTCAGTGGC TAATGAAGCT TGAGAATTAT301 ATCCAGGACA ACATGAAGAA AGAAATGGTA GAGATACAGC AGAATGCAGTAGAACCAG ACGGCTGTGA TGATAGAAAT AGGGACAAAC CTGTTGAACC401 AAACAGCGGA GCAAACGCGG AAGTTAACTG ATGTGGAAGC CCAAGTATTAAATCAGACCA CGAGACTTGA ACTTCAGCTC TTGGAACACT CCCTCTCGAC501 AAACAAATTG GAAAAACAGA TTTTGGACCA GACCAGTGAA ATAAACAAATTGCAAGATAA GAACAGTTTC CTAGAAAAGA AGGTGCTAGC TATGGAAGAC601 AAGCACATCA TCCAACTACA GTCAATAAAA GAAGAGAAAG ATCAGCTACAGGTGTTAGTA TCCAAGCAAA ATTCCATCAT TGAAGAACTA GAAAAAAAAA701 TAGTGACTGC CACGGTGAAT AATTCAGTTC TTCAGAAGCA GCAACATGATCTCATGGAGA CAGTTAATAA CTTACTGACT ATGATGTCCA CATCAAACTC801 AGCTAAGGAC CCCACTGTTG CTAAAGAAGA ACAAATCAGC TTCAGAGACTGTGCTGAAGT ATTCAAATCA GGACACACCA CGAATGGCAT CTACACGTTA901 ACATTCCCTA ATTCTACAGA AGAGATCAAG GCCTACTGTG ACATGGAAGCTGGAGGAGGC GGGTGGACAA TTATTCAGCG ACGTGAGGAT GGCAGCGTTG
1001 ATTTTCAGAG GACTTGGAAA GAATATAAAG TGGGATTTGG TAACCCTTCAGGAGAATATT GGCTGGGAAA TGAGTTTGTT TCGCAACTGA CTAATCAGCA1101 ACGCTATGTG CTTAAAATAC ACCTTAAAGA CTGGGAAGGG AATGAGGCTTACTCATTGTA TGAACATTTC TATCTCTCAA GTGAAGAACT CAATTATAGG1201 ATTCACCTTA AAGGACTTAC AGGGACAGCC GGCAAAATAA GCAGCATCAGCCAACCAGGA AATGATTTTA GCACAAAGGA TGGAGACAAC GACAAATGTA1301 TTTGCAAATG TTCACAAATG CTAACAGGAG GCTGGTGGTT TGATGCATGTGGTCCTTCCA ACTTGAACGG AATGTACTAT CCACAGAGGC AGAACACAAA1401 TAAGTTCAAC GGCATTAAAT GGTACTACTG GAAAGGCTCA GGCTATTCGCTCAAGGCCAC AACCATGATG ATCCGACCAG CAGATTTCTA A根據Genebank中所提供的人ANG2mRNA序列(Genebank登錄號NM001147)，設計帶有限制性內切酶酶切位點的特異性引物，引物序列如下ANG2-F :5，-gcTCTAGAGAATTCatgtggcagattgttttcttac-3，(帶有 EcoR I 酶切位佔)ANG2-R :5，-tccCCCGGGAAGCTTgaaatctgctggtcggatca-3，(帶有 Hind III 酶切位佔)PCR反應程序94"C 4min ICycle
權利要求
1.一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，其特徵在於，首先構建ANG2基因製備ANG2蛋白，再表達並純化ANG2蛋白，以ANG2蛋白為抗原製備高效價和高特異性抗人ANG2單克隆抗體和ANG2多克隆抗體，以抗人ANG2多克隆抗體為捕獲抗體，以生物素標記的抗人ANG2單克隆抗體為檢測抗體，建立檢測可溶性ANG2含量的雙抗夾心ELISA方法。
2.根據權利要求1所述的一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，其特徵在於，所述的構建ANG2基因製備ANG2蛋白應用RT-PCR技術釣取ANG2基因序列，構建pET28a/ ANG2重組表達質粒，並轉入大腸桿菌BL21宿主菌株中，IPTG誘導表達His_ANG2融合蛋白， 鎳柱親和層析純化ANG2蛋白，採用SDS-PAGE分析表達。
3.根據權利要求1所述的一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，其特徵在於，所述的ANG2單克隆抗體的製備工藝採用純化的His-ANG2融合蛋白作為抗原，免疫 BALB/c小鼠和骨髓瘤細胞進行細胞融合，以HAT培養基選擇培養，間接ELISA法篩選陽性孔，將克隆後的雜交瘤細胞接種入小鼠腹腔產生腹水，收集腹水並進行純化。
4.根據權利要求1所述的一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，其特徵在於，所述的ANG2多克隆抗體的製備工藝，其特徵在於，採用純化的His-ANG2融合蛋白免疫家兔，製備並純化多克隆抗體。
全文摘要
一種基於Angiogenin檢測的雙抗夾心ELISA方法，旨在提供一種方法簡單，靈敏度高的檢測ANG2含量的方法；其技術要點是首先構建ANG2基因製備ANG2蛋白，再表達並純化ANG2蛋白，以ANG2蛋白為抗原製備高效價和高特異性抗人ANG2單克隆抗體和ANG2多克隆抗體，以抗人ANG2多克隆抗體為捕獲抗體，以生物素標記的抗人ANG2單克隆抗體為檢測抗體，建立檢測可溶性ANG2含量的雙抗夾心ELISA方法；本發明屬於醫藥生物檢測技術領域；可用於腫瘤及自身免疫疾病等Angiogenin相關疾病的診斷、療效觀察及預後判斷，為研究Angiogenin蛋白功能及在腫瘤篩查診斷等方面奠定基礎。
文檔編號C07K14/515GK102221615SQ20111008108
公開日2011年10月19日 申請日期2011年3月31日 優先權日2011年3月31日
發明者孫奮勇, 康賢通, 馬紀 申請人:廣州華燦醫藥科技有限公司