突變的人源成纖維生長因子及在治療內分泌疾病中的用途的製作方法

2023-10-17 08:48:44

專利名稱：突變的人源成纖維生長因子及在治療內分泌疾病中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及成纖維生長因子，尤其涉及突變的人源成纖維生長因子及其製備方 法，本發明還涉及該突變的人源成纖維生長因子在製備治療內分泌疾病藥物中的用途，屬 於成纖維生長因子領域。
背景技術：
糖尿病是繼心腦血管疾病和腫瘤之後的人類第三大殺手。隨著生活模式、飲食結 構的改變，全世界糖尿病患病率呈急劇上升的趨勢。預計到2030年世界糖尿病患病人數將 增至3. 66億人，糖尿病將成為世界各個國家一個沉重的負擔。對於2型糖尿病，絕大多數的患者不可避免的要用藥物來治療。其中，口服藥物有 三大類第一類為黃脲類。如優降糖，糖適平，達美康，美吡達等。黃脲類藥能夠刺激胰島分 泌胰島素，但胰島素分泌多了以後，可以引起低血糖，這對低血糖患者而言是一個不可忽視 的危險因素，而且部分藥物具有較大副作用，如可引起肝功能損傷。第二類藥是雙胍類藥。 如降糖靈和二甲雙胍；雙胍類藥並不刺激胰島素分泌，它刺激機體在細胞水平上提高胰島 素的利用，但對於胰島素分泌不足的糖尿病患者而言，其發揮的作用就很有限，而且還有乳 酸性酸中毒等不良反應。第三類藥是a糖苷酶抑制劑，如拜糖平等；這類藥的作用是減少人 體對飲食中糖的吸收，因為吸收減少，血糖升高也比較緩慢。但該藥的主要副作用就是胃腸 反應，服用後如發生低血糖反應，還要口服或靜脈注射葡萄糖。目前注射藥物主要是胰島素，注射用的胰島素在糖尿病的治療中發揮著重要的作 用。但也有其不足，主要為用藥後心慌、表情異常、流汗等，重者產生胰島素休克或低血糖性 驚厥；注射胰島素的患者，經一度停藥再用藥時，對胰島素的需用量愈來愈大，使患者必須 每天必須多次注射胰島素，給患者帶來很大痛苦，而且大劑量用藥也加大了集體產生副作 用的機制，其原因可能是機體產生了胰島素抗體，抗體與胰島素結合而減弱其作用。近年來，隨著人基因組序列的破譯，一批具有獨立調節血糖，有望成為新型治療糖 尿病藥物的蛋白被相繼發現，成纖維細胞生長因子-21 (FGF-21)就是其中之一。已有大量 實驗證明FGF-21是除胰島素外，生物體內又一個能夠獨立調節代謝水平的蛋白因子。在已 完成的研究中發現，FGF-21能夠獨立促進小鼠3T3-L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取(不論胰 島素存在與否)，並以劑量依賴性的方式降低ob/ob和db/db小鼠以及ZDF大鼠餐後及空腹 時血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平。更重要的是，在發揮作用的同時，FGF-21沒有引起 低血糖等其它糖尿病治療藥物常見的副作用。FGF-21的發現為糖尿病患者尤其是糖尿病晚 期胰島素抵抗嚴重的患者帶來了新的希望。但是FGF-21在人體內代謝時間較短，同胰島素 一樣需要多次注射才能穩定患者血糖。因此，將FGF-21進行適當改造，在不改變其原有活性的基礎上增加其穩定性及活 性，這對於將FGF-21應用于于臨床具有非常重要的意義。在以往生物藥物研究中，多採用 人為突變的方法進行蛋白改造，由於突變的隨機性及蛋白功能的複雜性，人為突變結果往 往適得其反，浪費了大量人力和物力。

發明內容
本發明的目的之一是提供突變的人源成纖維細胞生長因子-21及其編碼基因；本發明目的之二是提供含有突變的人源成纖維細胞生長因子-21基因的表達載 體或質粒以及含有該表達載體的宿主細胞。本發明目的之三是將該突變的人源成纖維細胞生長因子-21應用於製備成治療 糖尿病的藥物或藥物組合物。本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的一種突變的人源成纖維細胞生長因子-21 (hmFGF-21)，其胺基酸序列為SEQ ID NO :2所示；編碼該突變的人源成纖維細胞生長因子-21的核苷酸序列為SEQ ID N0:1所
7J\ ο本發明以人血細胞核酸為模板，依賴天然基因庫大量克隆正常人體中FGF-21基 因，建立一個天然人FGF-21樣本庫。通過SSCP，RFLP等高通量的篩選方法，篩選FGF-21的 天然突變體，由於該突變體存在於正常人體內，其基因編碼的突變蛋白避免了人為突變蛋 白可能的副作用如活性缺失、致癌、免疫耐受等等，節省了大量後續工作。有利於加快該蛋 白的藥用開發。作為參考，一種篩選本發明所述突變的人源成纖維細胞生長因子-21的方法，包 括如下步驟以從正常人血液中提取的RNA為模版，並以此為模板克隆編碼FGF-21的基因， 利用SSCP、RFLP等技術從得到的基因庫中篩選FGF-21突變體，將所獲得的突變基因連接到 構建好的表達載體中；將所述表達載體轉化適當的宿主細胞，並進行誘導表達，活性檢測。含有該突變的人源成纖維細胞生長因子-21核苷酸序列的表達載體以及含有該 表達載體的宿主細胞也當然的的包括在本發明的保護範圍之內。優選的，可以將突變的人 源成纖維細胞生長因子-21核苷酸序列與分子伴侶相連接，再將其克隆到表達載體中。其 中，所述的分子伴侶優選為小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)；本發明還提供了一種生產突變人FGF-21的方法，包括將突變的人成纖維細胞生 長因子-21核苷酸序列與分子伴侶相連接，再將其克隆到表達載體中，得到重組表達載體； 將該重組表達載體轉化至宿主細胞中；誘導表達FGF-21，分離純化FGF-21，利用蛋白酶切 除與其融合表達的分子伴侶部分，純化，即得。優選的，所述的表達載體可以是pET_30a(+)，所述的宿主細胞可以是 Transetta(DE3)；所述的分子伴侶優選為小分子泛素樣修飾蛋白(SUMO)；其中，所述的純化包括將酶切後的蛋白進行樹脂親和層析，依次經洗滌、洗脫、脫鹽。動物學試驗結果表明，本發明突變的人源成纖維細胞生長因子-21相比於野生型 成纖維細胞生長因子-21，能夠更加有效降低動物體內的血糖水平，此外，本發明突變的人 源成纖維細胞生長因子-21在降低血糖水平方面還具有起效快、藥效持續時間長等優點。 本發明突變的人源成纖維細胞生長因子-21可作為藥物治療糖尿病，代謝綜合症或脂代謝 紊亂等內分泌疾病。


圖1 hmFGF-21基因構建設計圖。
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圖2 hmFGF-21和hFGF_21調節細胞葡萄糖代謝的試驗結果；*P < 0. 05為差異顯 著，**P < 0. 001為差異極顯著。圖3不同蛋白處理3T3-L1脂肪細胞影響GLUTl的表達含量結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。說明本發明中涉及的基因的設計、合成和克隆，表達載體的構建，核酸提取及 序列分析及鑑定，以及表達產物的分離和純化等操作步驟，可按照本領域已知的技術進行 (參見CURRENT PROTOCOLS I匪OLECULAR BIOLOGY)。若未特別指明，實施例中所用的技術 手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1 hFGF-21基因的克隆根據hFGF-21基因去除信號肽的胺基酸序列，設計引物，通過互補延伸的方法獲 得去除信號肽的人reF-21基因。利用在線軟體Primer5. 0設計hFGF-21引物。以提取的正常人肝總RNA為模板，01 i go (dT) 15為引物，參照M-MLV反轉錄酶 M-MLVRT說明書進行cDNA第一條鏈合成，反應體系和具體操作分別如下Oligo(ClT)151. 0μ 1
模板5. 0μ 1
DEPC-H2O7. 0μ 1
70°C水浴5min，冰上放置5min，依次加入
RNasin1. 0μ 1
5XM-MLVRT buffer5. 0μ 1
dNTPs5. 0μ 1
M-MLVRT1. 0μ 1
37°C水浴2h，70°C水浴15min，取2μ 1用於PCR擴增反應。增mFGF-21成熟多肽cDNA, PCR反應(50 μ 1體系)如下
10XPCR butfer5. 0μ 1
dNTPs4. 0μ 1
模板2. 0μ I(IOng)
Pl1. 0μ I(IOpmol)
P21. 0μ I(IOpmol)
rTaq 酶0. 5μ 1
ddH2036. 5μ 1
其中，引物Pl和P2的具體序列如下
Pl ccgctcgagaaaagacaccccatccctgactccagt ；
P2 gaagatcttcaggaagcgtagctggggcttcgg
混勻後進行PCR擴增。循環參數為:941預變性51^11，941Imin的順序，25個循環後，72°C再延伸lOmin。最終得到全長的hFGF_21基因。實施例2 hmFGF-21基因的克隆1. hmFGF-21基因的構建設計設計六條引物，運用重疊PCR方法構建hmFGF-21蛋白基因(如圖3_1)。六條引物 設計如下
權利要求
一種突變的人源成纖維細胞生長因子 21，其特徵在於其胺基酸序列為SEQ ID NO2所示。
2.編碼權利要求1所述的突變的人源成纖維細胞生長因子-21基因，其特徵在於其 核苷酸序列為SEQ ID NO 1所示。
3.含有權利要求2所述突變的人源成纖維細胞生長因子-21基因的表達載體。
4.含有權利要求3所述表達載體的宿主細胞。
5.一種製備權利要求1所述的人源成纖維細胞生長因子_2的方法，包括將編碼該突 變的人成纖維細胞生長因子-21核苷酸序列與分子伴侶相融合，得到融合基因；將融合基 因可操作的與表達載體相連接，得到重組表達載體；將該重組表達載體轉化至宿主細胞中； 誘導表達成纖維細胞生長因子-21，分離純化成纖維細胞生長因子-21，利用蛋白酶切除與 其融合表達的分子伴侶部分，純化，即得。
6.按照權利要求5所述的方法，其特徵在於所述的分子伴侶為小分子泛素樣修飾蛋白。
7.按照權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述的純化包括將酶切後的蛋白進行樹 脂親和層析，依次經過洗滌、洗脫、脫鹽。
8.一種治療內分泌疾病的藥物組合物，包括治療上有效量的權利要求1所述的突變 的人源成纖維細胞生長因子-21和藥學上可接受的載體或輔料。
9.權利要求1所述的突變的人源成纖維細胞生長因子-21在製備治療內分泌疾病藥物 中的用途。
10.按照權利要求9所述的用途，其特徵在於，所述的內分泌疾病包括糖尿病，代謝綜 合症或脂代謝紊亂。
全文摘要
本發明公開了突變的人源成纖維生長因子及其在治療內分泌疾病中的用途。本發明突變的人源成纖維細胞生長因子-21的胺基酸序列為SEQ ID NO2所示，其編碼基因序列為SEQ ID NO1所示。本發明以人血細胞核酸為模板，依賴天然基因庫大量克隆正常人體中FGF-21基因，建立天然人FGF-21樣本庫，通過高通量的篩選方法，篩選得到FGF-21的天然突變體。動物學試驗結果表明，本發明突變的FGF-21能夠更加有效降低動物體內的血糖水平，此外，本發明突變體在降低血糖水平方面還具有起效快、藥效持續時間長等優點。本發明突變的FGF-21可作為藥物治療糖尿病，代謝綜合症或脂代謝紊亂等內分泌疾病。
文檔編號C12N1/15GK101935346SQ201010261030
公開日2011年1月5日 申請日期2010年8月24日 優先權日2010年8月24日
發明者任桂萍, 劉銘瑤, 李德山, 王文飛, 高華山 申請人:哈爾濱市哈科隆生物製藥研究所