編碼殺蟲蛋白基因Cry1Ab-Ma、其表達載體及應用的製作方法

2023-10-17 08:36:29 1

專利名稱：編碼殺蟲蛋白基因Cry1Ab-Ma、其表達載體及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程和生物防治領域，具體地說，涉及抗蟲基因CrylAb-Ma、其表 達載體及應用。
背景技術：
Bt基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇雲金芽孢桿菌(BacillusthuringHansis)。它 在芽孢形成過程中產生S -內毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白，這些蛋白具有很高的殺蟲活性。 其作用原理為這種抗蟲蛋白能被鹼性腸液溶解，水解為更小的活性毒素片段-核心片段 (Hofte和Whiteley，1989)。該活性片段能抗蛋白酶的進一步水解，被激活的蛋白質結合在 昆蟲腸道上的刷狀小泡上，引起穿孔從而影響滲透平衡，細胞膨脹並溶解，靶標生物停止取 食並最後死亡。研究表明許多靶標害蟲的腸道上皮細胞都具有Bt蛋白高親和性的結合位 點(Hofte和Whiteley，1989)。在過去的幾十年裡，已確定數十種蘇雲金芽孢桿菌菌系及 130多種它們編碼的殺蟲晶體蛋白。1986年，首批轉基因植物(抗蟲、抗除草劑)被批准進入田間試驗。1987年，比 利時Vaeck等人首次獲得轉Bt殺蟲蛋白的抗蟲菸草，但只能檢測到微弱的抗蟲性，其表達 蛋白幾乎檢測不到，只佔可溶性蛋白的0. 001%。同年又有兩次獲得Bt轉基因植株的報導 (Barton等，1987 ；Fischhoff等，1987)。1989年哺乳動物抗體重鏈和輕鏈基因在菸草中成 功表達並正確組裝成有功能的抗體。到1990年，至少有7個研究小組獲得Bt轉基因植物 並應用於大田試驗(Estruch J等，1996)。Adang等(1993)改造了 Cry3A基因，該基因在 馬鈴薯中高效表達。1993年，Michael等人對CrylAb基因進行改造，獲得Bt轉基因植株， 對玉米螟有很好的抗性。KozHal (199 等培育出了抗蟲轉基因玉米，轉基因植株能高水平 表達CryIA(b)抗蟲基因。1996年，Joachim W等人將CrylAb進行截短修飾，轉化水稻，獲 得轉Bt水稻，靶標害蟲死亡率達100%。1998年，Cheng等人根據植物所偏愛的密碼子，改 造了 CrylAb和CrylAc基因用農桿菌轉化法轉化水稻獲得轉基因植株，R2代蟲試，5天內有 100%致死率。Bohotova等Q001)人工改造合成CrylB基因，轉化熱帶玉米得到轉基因玉 米能有效防治玉米螟。我國對Bt殺蟲蛋白基因的研究主要是1992年，郭三堆等人採用植物優化密碼子 方法首先在國內人工合成全長ISMbp的GFMCrylA殺蟲基因，獲得了中國第一代單價抗蟲 棉。丁群星等(199 和王國英等(19卯)分別用子房注射法和基因槍法將pB48. 415質粒 轉入玉米愈傷組織中獲得轉基因植株，抗蟲性測定表明其具有一定抗蟲性。1994年，中國農 業大學在國內外首次用子房注射的方法把抗蟲基因Bt轉入玉米並獲得轉基因植株，以自 主智慧財產權基因Bt為代表的抗蟲玉米已展示了良好的開發前景。1998年，中國農業科學院 將GFM殺蟲基因構建到pMG6質粒上，導入到玉米中(周逢勇等，1998)，後代檢測表明Bt基 因以孟德爾遺傳方式遺傳到下一代(Liu YJ等，2003)。我國在轉基因技術研究方面，已經 建立了比較成熟的玉米轉基因技術體系。CrylAb蛋白是一類由蘇雲金芽孢桿菌產生的對鱗翅目害蟲具有毒殺作用的伴胞晶體，其在生物防治領域具有重要的應用前景。蘇雲金桿菌S-內毒素基因CrylAb來源於 微生物，但其轉基因植物存在表達量低、表達產物不穩定、抗蟲性效果差等問題。通過改造 鹼基序列提高GC含量能提高其在轉基因植物中的表達量，達到殺蟲目的(Koziel，1993)。 通過比較蘇雲金芽孢桿菌和玉米的密碼子使用情況，可以發現兩者在密碼子偏好上存在很 大差異，利用植物的偏好密碼子，重新設計和改造CrylAb並獲得新型抗蟲基因CrylAb-Ma， 以實現轉新基因作物具有較好的抗蟲性。玉米是重要的糧食作物，又是重要的飼料和工業原料，當前玉米蟲害(以玉米螟 為主)嚴重，造成玉米大量減產，因此採取有效措施控制其危害對提高玉米產量、增加農民 收入具有重要的意義。由於缺乏合適的抗蟲品種，目前解決蟲害的主要方法是在生長過程 中噴施化學殺蟲劑；但是化學殺蟲劑同時殺死害蟲及其天敵，造成生態不平衡和環境汙染。 通過轉基因技術，可以將抗蟲基因導入玉米品種中，進而提高轉基因玉米的抗蟲性，降低農 藥的使用量，節省人力、物力及社會資源。因此，應用新的抗蟲基因、提高殺蟲蛋白的表達量 以及培育新型抗蟲轉基因玉米是解決上述問題的最有效途徑之一。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠在植物中穩定高效表達的抗蟲基因CrylAb-Ma及 其表達載體。本發明的另一目的是提供抗蟲基因CrylAb-Ma在提高轉基因植物抗蟲性中的應用。為了實現本發明目的，本發明的一種抗蟲基因CrylAb-Ma，其具有SEQ ID No. 1所 示的核苷酸序列，或該序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸形成的編碼同等功 能蛋白的由SEQ ID No. 1衍生的核苷酸序列。上述抗蟲基因CrylAb-Ma編碼蛋白的胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。含有抗蟲基因CrylAb-Ma的載體，優選雙價載體。含有上述載體的宿主細胞，優選EHA105。含有抗蟲基因CrylAb-Ma的轉化植物細胞。抗蟲基因CryIAb-Ma在提高轉基因植物抗蟲性中的應用。優選，所述植物為農作 物、果樹或蔬菜，如玉米、水稻、馬鈴薯、棉花等。本發明的目的還可以採用以下的技術措施來進一步實現去掉原始Bt基因CrylAb 3』端1623bp的一段鹼基序列，只留下部分缺失的5』端 1845bp的一段鹼基序列；在保持序列CrylAb N端蛋白的胺基酸組成總體不變的情況下，用 植物偏愛的密碼子進行鹼基置換，初步獲得一個改造的DNA序列；排除DNA序列中存在的造 成植物轉錄不穩定的富含AT序列以及常用限制性酶切位點(McI)，然後通過置換密碼子 的方法進行改正消除；並在3』端加上終止密碼子TAG ；確定並化學合成改造的Bt基因，其 核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；根據克隆需要在序列兩端加上限制性內切酶識別位點序 列並構建到相應的表達載體上。將本發明基因CrylAb-Ma與原核表達載體可操作地連接，能夠快速初步檢測本發 明合成的Bt基因表達產物對玉米螟的毒性。將本發明基因CrylAb-Ma與植物表達載體可 操作地連接，並將表達載體導入相應的農桿菌中，進而通過農桿菌介導法進行遺傳轉化，培育抗蟲轉基因玉米。也可以對其它農作物或者果樹等進行遺傳轉化，使其具備抗蟲活性。本領域技術人員還可以將本發明基因轉化細菌或真菌，通過大規模發酵生產Bt 蛋白，並將其製備成殺蟲劑，用於農作物害蟲的防治。本發明至少具有下列優點及有益效果本發明人工合成的抗蟲基因CrylAb-Ma序列與原始CrylAb序列相比，大大增強了 其在植物中的表達。使用植物偏愛性密碼子，減少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在 的反向重複序列以及不明確的真核DNA內含子序列，改造後的CrylAb-Ma基因G+C含量為 63. 04%,與原始DNA序列的同源性為66%。本發明的抗蟲基因CrylAb-Ma可在植物細胞中 高效穩定的表達。將抗蟲基因CrylAb-Ma導入玉米後，可以得到穩定遺傳的CrylAb-Ma轉化體。此 外，該基因也可以轉化棉花、水稻、蔬菜等農作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農藥 的使用量，以減少環境汙染，具有重要的經濟價值和廣闊的應用前景。


圖IA 圖ID為本發明CrylAb基因與合成的CrylAb-Ma基因編碼序列分析圖。圖 2 為 CPB(pCAMBIA1300-35S-MCS-Bar)質粒圖譜。圖3為採用農桿菌介導法獲得的轉CrylAb基因玉米；其中，愈傷組織的篩選 (左)、再生(中)以及轉基因植株移栽到大田(右)。圖4為Ttl代轉化體中目的基因CrylAb-Ma的PCR檢測結果，其中，M為 M:DL2000plus ；CKl為陽性質粒對照；CK2為未轉基因陰性對照；空白為雙蒸水對照；1_8是 Ab-Mal 至Ij Ab-Ma8。圖5為Ttl代轉化體選擇標記基因Bar的PCR檢測結果，其中，M為M:DL2000plus ； CKl為陽性質粒對照；CK2為未轉基因陰性對照；空白為雙蒸水對照；1-8是Ab-Mal到 Ab-Ma8。圖6為Ttl代轉化體目的蛋白CrylAb-Ma的免疫學檢測，其中CKl為未轉基因苗陰 性對照；1-8 % Ab-Mal 到 Ab_Ma8。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。以下實施例中的試驗方法，如無特別說明，均為常規方法。以下實施例中所用的試 驗材料及試劑，如無特別說明，均購自常規生化試劑公司。實施例ICrylAb-Ma基因的合成根據Bt基因CrylAb的原始核苷酸序列，去掉3』端1623bp的一段鹼基序列，只留 下部分缺失的5』端1845bp的一段鹼基序列；在保持序列CrylAb N端蛋白的胺基酸組成總 體不變的情況下，用植物偏愛的密碼子進行鹼基置換，初步獲得一個改造的DNA序列；排除 DNA序列中存在的造成植物轉錄不穩定的富含AT序列(如ATTTA、AATGAA等)以及常用限 制性酶切位點(McI)，然後通過置換密碼子的方法進行改正消除；並在3』端加上終止密碼 子TAG;確定並化學合成改造的Bt基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；根據克隆需要 在序列兩端加上限制性內切酶識別位點序列並構建到相應的表達載體上。
將原始Bt基因CrylAb與合成的CrylAb-Ma基因編碼序列進行比對分析(圖1)， 兩個序列的同源性為66%。鹼基組成的統計結果為原始基因的G+C%為37. 34%，新合成 基因的6+(%為63.04(%。編碼的胺基酸序列的比對分析顯示，兩者編碼的胺基酸序列(其 胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示)一致。新Bt基因CrylAb-Ma的合成工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。實施例2CryIAb-Ma基因在原核系統中的表達和產物的毒性檢測為了檢測改造的CrylAb-Ma基因體外表達及對玉米螟的毒性情況，我們構建了 Bt 原核表達載體。根據克隆Bt基因需要，在引物序列的5』端添加NdeI內切酶識別位點序 列CATATG，3』端添加HindIII內切酶識別位點序列AAGCTT。設計引物序列(上遊引物Fl 5 「-CATATGGACAACAACCCGAACATC-3，；下遊引物 Rl :5，-AAGCTTCTAGTACTCCGCCTCG-3，)。以pUCAb-Ma質粒為模板，以Fl和Rl為引物，擴增CrylAb-Ma基因，用限制性內切 酶NdeI和HindIII進行酶切，凝膠回收試劑盒回收純化CrylAb-Ma基因片段。用限制性內 切酶NdeI和HindIII酶切pET28b+，凝膠回收試劑盒回收純化5. 3kb片段。兩個片段進行 連接反應，構建所得原核表達質粒命名為pETAb-Ma。用不同限制性內切酶進行酶切鑑定，表 明載體構建正確。用pETAb-Ma轉化BL21(DE3)感受態細胞。用含有pETAb-Ma的大腸桿菌BL21菌液經IPTG誘導後，提取Bt蛋白，以清水和含 空載體pET28b+大腸桿菌BL21菌液為對照，用玉米螟進行蟲試。具體步驟如下①接種大腸桿菌BL21單菌落於5ml LB (含卡那黴素)液體培養基中，37°C過夜培養。②將菌液接種到500ml LB(含卡那黴素)液體培養基中，培養至OD ^ 0. 5。③加入IPTG至終濃度0. 5mM繼續搖動誘導4小時。④4000rpm離心lOmin，收集菌體。⑤加入36ml裂解緩衝液QmM Tris-HCl ；0. 2mM CaCl2 ；PH = 8.0),重新懸浮菌體， 加入溶菌酶至終濃度lmg/ml，冰上放置30min。⑥超聲波破碎菌體(破碎參數工作10s，間隔5s，40次，冰浴破碎)，4000rpm離 心lOmin，收集上清。⑦將收集的上清加入到飼養玉米螟的飼料中。以含空載體pET28b大腸桿菌BL21 菌液為陰性對照。⑧在每個試管中放入一條飼料，並接入10頭初孵未進食玉米螟，各接10個試管。 放入溫度沈 觀度，相對溼度70%左右的環境中培養，8天後進行毒性鑑定結果表明，分 泌表達的CrylAb-Ma基因編碼的Bt蛋白有較好的殺蟲效果，玉米螟的死亡率達到90. 67%, 而且對玉米螟的生長有明顯的抑制作用(表1)。表ICrylAb-Ma基因原核表達產物的毒性檢測結果
權利要求
1.抗蟲基因CrylAb-Ma，其具有SEQID No. 1所示的核苷酸序列，或該序列經取代、缺 失和/或添加一個或幾個核苷酸形成的編碼同等功能蛋白的由SEQ ID No. 1衍生的核苷酸 序列。
2.含有權利要求1所述基因的載體。
3.如權利要求2所述的載體，其為雙價載體。
4.含有權利要求3所述載體的宿主細胞。
5.如權利要求4所述的宿主細胞，其為EHA105。
6.含有權利要求1所述基因的轉化植物細胞。
7.權利要求1所述的基因在提高轉基因植物抗蟲性中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，所述植物為農作物、果樹或蔬菜。
9.如權利要求8所述的應用，所述植物為玉米、水稻、馬鈴薯、棉花。
10.如權利要求9所述的應用，所述植物為玉米。
全文摘要
本發明提供了一種抗蟲基因Cry1Ab-Ma，其是在依據原始蘇雲金芽胞桿菌Bt蛋白(Cry1Ab)N端胺基酸序列，使用單子葉植物(玉米)偏愛密碼子，通過人工改造合成新的Cry1Ab DNA序列，以及進行原核表達載體和植物表達載體的構建，並進行相應宿主細胞的轉化。體外實驗證明改造合成的Bt基因產毒蛋白對玉米螟有顯著的殺蟲效果，本發明的抗蟲基因Cry1Ab-Ma能夠在單子葉植物中穩定高效表達，進而用於生產抗蟲轉基因植物。
文檔編號C12N15/82GK102094030SQ201010574708
公開日2011年6月15日 申請日期2010年11月30日 優先權日2010年11月30日
發明者嶽潤清, 李新海, 翁建峰, 謝傳曉, 郝轉芳, 鐵雙貴 申請人:中國農業科學院作物科學研究所, 河南省農業科學院