重組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8）在製備治療慢性心力衰竭藥物中的應用的製作方法

2023-10-17 14:13:59 1

重組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8）在製備治療慢性心力衰竭藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及重組靈芝免疫調節蛋白（rLZ-8）在製備治療慢性心力衰竭藥物中的應用。本發明採用由阿黴素（ADR）腹腔注射建立大鼠心力衰竭模型研究rLZ-8對慢性心力衰竭的治療作用，實驗研究結果表明，rLZ-8可明顯改善大鼠慢性心力衰竭模型的心功能，降低心肌細胞凋亡率，並減少心肌細胞中相關凋亡蛋白（caspase3、caspase9）的表達，以及增加慢性心衰大鼠的存活率。
【專利說明】重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在製備治療慢性心力衰竭藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在製備治療慢性心力衰竭藥物中的應用，具體涉及大鼠慢性心力衰竭模型的建立，治療程序的設計以及治療結果的統計分析，涉及大鼠心肌細胞以及相關蛋白的檢測，重點涉及重組靈芝免疫調節蛋白在治療大鼠慢性心力衰竭模型中的應用。
【背景技術】
[0002]慢性心力衰竭(CHF)是心力衰竭中最常見的形式，是冠心病、心肌病、高血壓病、心臟瓣膜病等多種心血管疾病發展的終末階段，也是最主要的死亡原因。隨著人口老齡化，以及急性心肌梗死診治系統的完善使許多病人從急性期存活下來，CHF發病率逐漸升高，已成為常見公共衛生問題。2010年美國心臟學會報導，美國的心衰患者人數已經超過580萬，並且仍以67萬/年的速度不斷增加，心衰死亡率為28萬/年。我國慢性心衰的患病率為
0.9%~1.6%，女性高於男性，隨年齡增加心衰的患病率增加。
[0003]2005年美國慢性心力衰竭指南的最大特點之一是將心衰分期從心衰的危險因素、易患人群到難治性心衰，分為A、B、C、D 4個階段，全面涵蓋了從防到治的全新概念，強調了對心衰早期幹預，與既往NYHA1、Π、ΠΙ、IV分級概念有所不同。
[0004]A期:指具有明確發生心衰危險因素的易患人群，如高血壓、冠心病、糖尿病、代謝症候群等患者，但尚無左心功能受損和心臟器質性改變，更無心衰症狀，即屬於心衰前期。
[0005]B期:指患者已有心臟結構性改變，但無心衰症狀和(或)體徵，相當於無症狀心衰或NYHA I級。
[0006]C期:指現在或過去曾有過心`衰症狀且有器質性心臟病者，相當於NYHAI1、III和部分IV級患者。
[0007]D期:指需要特殊幹預的頑固性心衰，相當於NYHA IV級中最嚴重的階段。70%患者I年內死亡。患者反覆住院，常需長期靜脈輸注或滴注血管擴張藥和正性肌力藥，需釆用心臟機械性輔助裝置、心臟同步起搏、心臟移植等治療。
[0008]慢性心力衰竭的藥物治療在西藥方面主要有以下幾種:1)血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)，適用於所有左心室射血分數減少(小於0.40)的心衰患者，以改善患者的生存質量、症狀及心臟功能，並減少住院時間。ACE I治療CHF現存在不同類型血管緊張素抑制劑的差異、目標劑量與常用劑量差距、經濟承受能力、不良反應、發生率較高等問題。2)利尿藥，利尿劑通過利尿作用減輕心衰病人的液體儲留、改善心功能、症狀和運動耐量，單一利尿劑是不夠的。聯合應用ACE 1、β受體阻滯劑、洋地黃類藥物可減少臨床失代償的危險。利尿藥可出現低血鈉、酸鹼平衡紊亂、高尿酸血症，低血鎂等不良反應，噻嗪類可出現低血鉀、低血鎂、低血鈉、高酸尿血症、糖耐量異常、酸鹼平衡紊亂等不良反應，因此患者需經常檢測血清肌酐和電解質水平。3) β受體阻斷藥，β受體阻滯劑治療CHF病理生理基礎一降低心肌耗氧量，改善心臟功能:但是，對於心衰病人不同的β受體阻斷藥可能出現不同的臨床效應。受體阻斷藥不適用於急性心力衰竭，只能在穩定狀態下使用。4)血管緊張素II受體阻斷藥，對不能耐受ACE I的症狀性心衰患者，血管緊張素II受體阻斷藥可替代ACE I使用，以減少病死率和併發症。血管緊張素II受體阻斷藥和ACE I對於慢性心衰的病死率和發病率降低似乎具有類似的效果。血管緊張素受體阻斷藥亦能引起低血壓、高血鉀及腎功能惡化，應用時應注意血壓、血電解質及腎功能。4)醛固酮抑制劑，醛固酮有獨立於血管緊張素II對心臟結構和功能的不良作用，促進心肌纖維化，易導致室性心律失常及碎死。目前FDA批准依普利酮僅用於急性心梗後心衰患者的治療，醛固酮抑制劑應用過程中應檢測患者血鉀和血清肌酐水平。
[0009]慢性心力衰竭的藥物治療在中藥方面主要有以下幾種:1)單味藥研究，常用的治療心衰的藥物有茯苓、車前子、黃芪、人參皂苷、丹參、附子、葛根、葶藶子等，現代藥理研究和動物實驗證明中藥在治療心衰方面確有治療依據。黃芪是一種非洋地黃正性肌力藥物，可增加心臟收縮力和搏出量，對中毒或疲勞衰竭心臟更為明顯，還有顯著抗心肌缺血作用，能顯著降低急性壞死心肌的血清肌酸激酶，對壞死的心肌細胞有十分明顯的保護作用；人參皂苷可以清除氧自由基，減輕缺血對心肌的損害，改善微循環，還能抑制心肌細胞膜Na+-K+-ATP酶，提高心肌細胞內Ca2+濃度，提高心肌收縮力；葶藶子有強心作用，能使心肌收縮力增強，心率減慢，對衰弱的心臟可增加心搏出量，降低靜脈壓；附子能降低心衰模型大鼠血清腦利鈉肽(BNP)及白介素-6水平，減輕心肌細胞損傷，從而改善心功能、減輕心衰症狀、降低死亡率，附子與乾薑配伍可以加快心裳大鼠的心率、升聞左心室內壓、提聞左心室內壓最大上升和下降速率，改善心衰大鼠血流動力學的變化；丹參對冠狀動脈具有明顯的擴張作用，並且具有抗凝作用，改善血液的高凝狀態，丹參中的丹參酮成分能夠抑制心肌細胞的鈣超載，發揮對心肌細胞的保護作用，同時能減少心肌組織缺氧時的氧化損傷及炎症反應引起的損傷；茯苓、車前子通過其利水作用減輕心臟前負荷，且利尿作用時間長，較少引起電解質紊亂；葛根能擴張血管，降低外周阻力、擴張冠狀動脈，增加冠脈流量，改善微循環，並能抑制血小板聚集，增加內源性纖溶系統活性，降低血液粘度，增加紅細胞變形能力，減輕血管平滑肌增殖和遷移，減少氧自由基對心肌的損傷。2)複方製劑研究，生脈注射液源自古方「生脈散」，主要成分為人參和麥冬，五味子。中醫認為具有益氣固脫養陰生津的作用，藥理研究顯示其具有強壯抗疲勞、抗放射、促進造血功能、保護心肌細胞抗休克以及增加機體免疫功能、抗腫瘤等作用。臨床主要用於治療冠心病，心肌梗死，心功能衰竭，各種休克及腫瘤患者化療的輔助治療。研究顯示參附註射液、參麥注射液、丹參注射液、丹紅注射液、丹參酮注射液、黃芪注射液等對慢性心衰均有較好療效。
[0010]阿黴素(ADR)是一種高效的廣譜抗腫瘤抗生素，臨床上廣泛用於治療多種惡性腫瘤。ADR在機體內易產生大量自由基，引起細胞損傷氧化反應，並且它還能通過線粒體途徑、Fas蛋白/ Fas配體信號系統、神經醯胺信號系統等誘導細胞凋亡，出現劑量依賴的不可逆轉的CHF15ADR誘導的大鼠CHF模型與人的心肌病CHF相似，適合研究衰竭心臟心肌超微結構改變、神經內分泌異常及血流動力學變化。所以，本發明採用ADR腹腔注射建立大鼠心力衰竭模型，探討重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)對大鼠慢性心力衰竭的治療作用。
[0011]靈芝免疫調節蛋白(FungalImmunomodulatory Protein of Ganodermalucidium, LZ_8)是1989年Kino等從靈芝菌絲體提取物中分離到第一個真菌免疫調節蛋白。本發明採用重組技術手段，以畢赤酵母作為表達載體，經過高密度深層次發酵得到與天然靈芝免疫調節蛋白(LZ-8)具有相同的胺基酸序列和空間結構重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)，活性實驗表明兩者具有一致的生物學活性。研究表明，rLZ-8具有抑制小鼠系統性過敏反應，刺激人類外周血淋巴細胞增殖和IL-2、TNF-a和IFN-Y等細胞因子產生的免疫學活性。

【發明內容】

[0012]本發明目的是提供重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在製備治療慢性心力衰竭藥物中的應用，重點考察了大鼠慢性心力衰竭模型在不同給藥劑量條件下對治療效果的影響，採用數學統計軟體對數據進行檢驗處理，得出rLZ-8在治療心力衰竭過程中具有顯著療效。具體
【發明內容】
如下:
心力衰竭模型建立:選用健康靈活Wistar大鼠，雌性，體重200~240g，SPF級，參照Teraoka的方法，除空白組之外其餘各組大鼠給予鹽酸阿黴素(用生理鹽水稀釋)腹腔注射，注射劑量為2mg/kg，前7次每3天注射一次，後3次則每2天注射一次，共注射3周，累計注射用量20mg/kg。
[0013]實驗分組與給藥方法=Wistar大鼠80隻，按照體重隨機分為6組，其中模型組(A組)20隻，空白組(K組)、陽性藥組(Y組)、rLZ-8 (B組)小、中(C組)、大劑量組(D )各12隻。模型組與空白對照組均給予溶劑(生理鹽水);rLZ-8大、中、小劑量組劑量分別為50μ g/kg/天、10 μ g/kg/天、5 μ g/kg/天；陽性藥物選用生脈注射液(4ml/kg)。各組均在第4周開始腹腔注射給藥，連續注射4周。
[0014]檢測內容與方法:本發明主要從血流動力學、生化指標、形態學、心臟組織細胞凋亡、凋亡調控基因等方面進行檢測，全面的檢測了大鼠心力衰竭治療過程的各項指標，具體的檢測方法如下:
I)血流動力學:大鼠麻醉後於右頸總動脈插管，連接Pc-1ab生物醫學信號採集處理系統記錄心率(HR)、外周收縮壓(SBP)和外周舒張壓(DBP);將插管逆行進入左心室後記錄左心室收縮末壓(LVSP)、左心室舒張末`壓(LVDEP)、左心室內壓上升最大速率(+dp/dtmax)和左心室內壓下降最大速率(-dp/dtmax)。
[0015]2)生化指標檢測:大鼠腹主動脈採血，分離血清，-20°C保存，用於檢測血清中BNP、MDA、Ang I1、Ca2+濃度，評價rLZ_8對慢性心力衰竭的治療作用。
[0016]3)形態學檢測:切取心尖部分心肌組織，投入2.5%戊二醛中固定，標本送吉林大學基礎醫學院電鏡室進行超微結構的觀察，分析各組心肌細胞的損傷程度；另取心肌組織置於10%甲醛中固定，標本送吉林大學基礎醫學院病理教研室進行包埋切片，經HE染色後，比較各組形態學差異。
[0017]4)心臟組織細胞凋亡:採用TUNEL法檢測細胞凋亡，具體方法詳見實施例2:
5)凋亡調控基因的檢測:採用SABC法進行免疫組化染色，檢測心臟組織中心肌細胞中Caspase 3> Caspase 9、Fas等凋亡相關蛋白的表達。具體方法詳見實施例2。
[0018]實驗結果部分:本發明實驗數據採用SPSS10.0統計軟體處理，以均值土標準差
G±幻表示，採用組間差異比較t檢驗進行統計分析。具體實驗結果如下:
O大鼠生長情況:κ組大鼠均生長良好，飲食正常，精神狀態好。A組存活的大鼠均存在飲食減少，精神萎靡的表現。死亡率33%，屍檢發現心臟明顯擴大，肝臟淤血並有大量腹水形成，考慮死亡原因為心率失常或嚴重心衰。B組存活9隻(死亡率25%)，C組存活7隻(死亡率41%)，D組存活5隻(死亡率58%)，Y組存活7隻(死亡率41%)。
[0019]2)血流動力學方面:與K組相比，A組的LVEDP明顯增加(Ρ〈0.05)，HR, SBP，DBP，LVSP，+dp/dtmax及-dp/dtmax均明顯降低(P〈0.05~Ρ〈0.01 )，表明慢性心力衰竭大鼠心肌收縮和舒張功能受損；與A組相比，rLZ-8各組能明顯升高SBP、DBP、HR及_dp/dtmax(Ρ〈0.05~Ρ〈0.01)，rLZ-8 組降低 LVDEP (Ρ〈0.05)同時能升高 LVSP、+dp/dt.，(Ρ〈0.05)。
[0020]3)生化指標方面:大鼠腹主動脈插管取血，收集血清，ELISA法測定血清腦利鈉肽(BNP)、血管緊張素II (Ang II )、丙二醛(MDA)含量，微板法測定血清Ca2+濃度。與K組相比，A組的血清BNP、Ang I1、MDA、Ca2+含量量明顯增加(P〈0.05~P〈0.001 )，表明慢性心力衰竭大鼠存在心肌過氧化損傷、鈣超載等問題；與A組相比，rLZ-8各組能明顯降低血清BNP、Ang 11、]\0^、0&2+含量(？〈0.05 ~Ρ〈0.01)。
[0021]4)形態學方面:ΗΕ染色後各組組織學分析結果如下:K組:心肌細胞排列整齊有序，心肌纖維間隙甚小，無炎細胞滲出及間質水腫改變4組:心肌細胞排列紊亂，扭曲變形粗細不均，部分心肌細胞胞質深染，心肌細胞核固縮深染，心肌纖維間隙明顯增寬，間質水腫，心肌細胞間充滿大量紅細胞，少量淋巴細胞浸潤出組:心肌細胞排列略整齊，個別心肌細胞胞質深染，心肌細胞核固縮深染，心肌纖維間隙無明顯增寬，少量淋巴細胞浸潤；(:組:心肌細胞排列略整齊，部分心肌細胞胞質深染，心肌細胞核固縮深染，心肌纖維間隙略增寬，少量淋巴細胞浸潤；D組:心肌細胞排列紊亂，部分心肌細胞胞質深染，心肌細胞核固縮深染，心肌纖維間隙略增寬，部分心肌纖維變性壞死，少量淋巴細胞浸潤；￥組:心肌細胞排列略整齊，部分心肌細胞胞質深染，心肌細胞核固縮深染，心肌纖維間隙略增寬，間質水腫及少量淋巴細胞浸潤。電鏡下微觀結構觀察結果如下:K組:心肌結構無明顯病理改變，肌絲形態完好，排列整齊，Z線清晰，肌節結構完好，閏盤完整；肌絲間線粒體如隔板樣排列整齊，其形態正常，界膜完整，嵴清晰；細胞核形態規則，核膜完整，核仁清晰可見；胞質內糖原豐富；間質膠原纖維含量正常。A組:心肌細胞肌節結構排列紊亂，肌節上肌絲減少；閏盤紊亂、分離；肌絲溶解消失，排列鬆散，肌結構消失；肌絲間線粒體明顯增生、腫脹、出現髓樣小體、嵴斷裂，呈空泡化改變；細胞核形態不規則，核基質緻密，染色質固縮；胞質內偶可見脂褐素顆粒。B組肌絲輕微收縮，局部`紊`亂，肌絲輕度溶解、斷裂；線粒體腫脹及嵴斷裂減少，仍存在線粒體增生，嵴輕度緻密；細胞核染色質固縮情況減輕，核膜完整，形態較規則。C組肌絲輕度溶解、斷裂；線粒體增生、腫脹；閏盤分離、紊亂；細胞核空化。D組肌節結構模糊，肌絲輕度收縮、肌絲溶解；線粒體代償性增生、腫脹，閏盤分離或橫位；細胞核形態不規則。
[0022]5)心肌細胞凋亡率方面=TUNEL法檢測各組心肌細胞凋亡率，結果顯示，A組心肌細胞凋亡率顯著高於K組(/X0.001)，經不同劑量rLZ-8治療後，治療組心肌細胞凋亡率顯著下降 0°〈0.01><0.001)。
[0023]6)凋亡調控基因方面:採用SABC法進行免疫組化染色，檢測心臟組織中心肌細胞中Caspase 3、Caspase 9、Fas等凋亡相關蛋白的表達,免疫組化染色結果採用MoticImages Advanced 3.2圖像分析軟體測灰度值,灰度值越大陽性表達越低,灰度值越小陽性表達越高。結果顯示，A組心肌細胞Caspase 3、Caspase 9、Fas表達量顯著低於K組0°〈0.001)，經不同劑量rLZ-8後，治療組心肌細胞Caspase 3、Caspase 9、Fas表達量顯著下降 0°〈0.01><0.001)。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1 HE染色後各組組織學分析圖；
圖2 rLZ-8對大鼠心力衰竭模型心臟組織細胞線粒體和肌絲的修復作用；
注:K為空白組、A為模型組、B為rLZ-8低劑量組、C為rLZ_8中劑量組、D為rLZ_8高劑量組。
[0025]圖3 rLZ-8對大鼠心力衰竭模型心臟組織細胞閏盤的影響；
注:K為空白組、A為模型組、B為rLZ-8低劑量組、C為rLZ_8中劑量組、D為rLZ_8高劑量組。
[0026]圖4 rLZ-8對大鼠心力衰竭模型心臟組織細胞細胞核的保護作用；
注:K為空白組、A為模型組、B為rLZ-8低劑量組、C為rLZ_8中劑量組、D為rLZ_8高劑量組。
【具體實施方式】
[0027]實施例1:心力衰竭動物模型的建立
1.1實驗方法:
1.1.1實驗材料與試劑
rLZ-8、鹽酸阿黴素、生理鹽水、一次`性ImL注射器、生脈注射液、大鼠飼料、墊料。
[0028]1.1.2儀器設備
白熾燈、大鼠飼養籠、電子天平、4°C冰箱、雙人超淨工作檯、普光學倒置顯微鏡。
[0029]1.1.3實驗動物
Wistar大鼠，雌性，體重200~240g，吉林大學實驗動物中心提供(合格證號:醫動字第 10-5112)。
[0030]1.2大鼠心力衰竭模型的建立
選用健康靈活Wistar大鼠,雌性,體重200~240g , SPF級,參照Teraoka的方法,除空白組之外其餘各組大鼠給予鹽酸阿黴素(用生理鹽水稀釋)腹腔注射，注射劑量為2mg/kg,前7次每3天注射一次，後3次則每2天注射一次，共注射3周，累計注射用量20mg/kg。[0031 ] 實施例2:rLZ-8對大鼠慢性心力衰竭模型的治療作用
實驗分組=Wistar大鼠80隻，按照體重隨機分為6組，其中模型組(A組)20隻，空白組(K組)、陽性藥組(Y組)、rLZ-8 (B組)小、中(C組)、大劑量組(D )各12隻。
[0032]治療程序:模型組與空白對照組均給予溶劑(生理鹽水);rLZ_8大、中、小劑量組劑量分別為50 μ g/kg/天、10 μ g/kg/天、5 μ g/kg/天；陽性藥物選用生脈注射液(4ml/kg)。各組均在第4周開始腹腔注射給藥，連續注射4周。
[0033]實驗結果:為了真實反映出rLZ-8對大鼠慢性心力衰竭模型的治療作用，本發明主要從血流動力學、生化指標、形態學、心臟組織細胞凋亡、凋亡調控基因等方面進行檢測，全面的檢測了大鼠心力衰竭治療過程的各項指標，具體的檢測方法與結果如下:
I)大鼠生長情況:K組大鼠均生長良好，飲食正常，精神狀態好。A組存活的大鼠均存在飲食減少，精神萎靡的表現。死亡率33%，屍檢發現心臟明顯擴大，肝臟淤血並有大量腹水形成，考慮死亡原因為心率失常或嚴重心衰。B組存活9隻(死亡率25%)，C組存活7隻(死亡率41%)，D組存活5隻(死亡率58%)，Y組存活7隻(死亡率41%)。
[0034]2)血流動力學方面:
實驗方法:大鼠麻醉後於右頸總動脈插管，連接Pc-1ab生物醫學信號採集處理系統記錄心率(HR)、外周收縮壓(SBP)和外周舒張壓(DBP);將插管逆行進入左心室後記錄左心室收縮末壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVDEP)、左心室內壓上升最大速率(+dp/dtmax)和左心室內壓下降最大速率(-dp/dtmax)。
[0035]實驗結果:實驗結果表明(見表1)，與K組相比，A組的LVEDP明顯增加(P〈0.05)，HR, SBP，DBP，LVSP, +dp/dtmax 及-dp/dtmax 均明顯降低(P〈0.05~Ρ〈0.01 )，表明慢性心力衰竭大鼠心肌收縮和舒張功能受損；與A組相比，rLZ-8各組能明顯升高SBP、DBP、HR及-dp/dtmax(P<0.05X0.01)，rLZ-8 組降低 LVDEPCP<0.05)同時能升高 LVSP、+dp/dt_，(Ρ〈0.05)。
[0036]表1 rLZ- 8對慢性心力衰竭大鼠血流動力學方面的影響(x±s)
【權利要求】
1.重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)在製備治療慢性心力衰竭藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於有效改善心功能。
3.如權利要求2所述的改善心功能，包括增強心肌收縮和舒張，減少心肌過氧化損傷與鈣超載，降低心肌細胞凋亡率以及心肌細胞中相關凋亡蛋白的表達。
4.如權利要求1所述藥物，其特徵在於該藥物製劑核心成分是由權利要求1所述的重組靈芝免疫調節蛋白(rLZ-8)和任選的藥學可接受的輔劑組成。
5.如權利要求1、4所述的藥物製劑給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括口服液，片劑，丸劑和膠囊；非腸道 給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號】A61K38/16GK103816532SQ201410098980
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月18日 優先權日:2014年3月18日
【發明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非