一種人親和素蛋白在製備抗肝癌藥物中的應用的製作方法

2023-10-17 14:03:59

專利名稱：：一種人親和素蛋白在製備抗肝癌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因和醫藥領域，具體的說，本發明提供了一種親和素蛋白的用途。
背景技術：
：親和素蛋白(Cycl叩hilins，CyPs)是一類高度保守、普遍存在肽基——脯氨醯順反異構酶活性(PPIase)的家族，它與FK560結合蛋白和parvulins共同組成了親免素超家族(Biotechnologia(InPolish)3,135-152;ActaPharm.45，413-420;#0丄Zi/eSc丄55，423-436)。儘管這三種蛋白質在序列上互不關聯，在結構上也不相同，但他們都具有PPIase活性，都可以催化單肽或蛋白質中脯氨酸醯亞胺肽鍵的順反異構化，從而加速細胞周期蛋白質合成過程中蛋白質的摺疊。已有報導，一種人的CyP蛋白可結合HIV-1中的一種蛋白質，具有潛在的引起HIV感染的作用。CyPs廣泛分布於從微生物到乳動物的各類物種中。Cycl叩hilinA(CyPA)是首先從牛的胸腺細胞中發現的CyP家族中第一個成員，並驗證它具有PPIase活性(Scie"ce,226，544-547;7fe"/re337，473-478)。重組人T細胞的cyclophilinA(hCyPA)的三維結構及它與CsA、四肽及一些二肽形成的複合物的三維結構已有報導(屍roc.yVaf.^cad5"c丄〃.5".A88，9483-9487;/.飾丄5io丄228，539—550;/.vl/o丄234,1119—1130.;7Vat〃re，353,276—279;Wat丄^cad5"c丄〃.A88,3324—3328;^z'oc/e歷j'sz^r,35，7362-7368)。CyPA與HIV相關蛋白質的複合物的結構也已報導(CW人87，1285-1294;5Yr"cti/re5，139-146)。CyP家族的其他成員與CyPA具有序列同源性及三維結構類似的特性(屍roc.船t丄Jcac/.Sci.〃.5".A90，11850-11854;屍roc.船t丄^cad5b丄"5".A91，5183—5186;/.Az'o丄331,45—56)。CyPJ是CyP家族的新成員，CYP-JcDNA長1.25Kb，編碼161個胺基酸，已從人的胎腦cDNA文庫中分離並鑑定(Ge/7et.92,231-236)。在胺基酸序列上與線蟲(C.e7ega/7s.)10具有72%的同源性。其具體核苷酸和胺基酸序列詳見NCBI網站上基因登陸號為AF146799的基因報告。
發明內容本發明要解決的問題是人親和素蛋白在製備抗肝癌藥物中的應用。本發明提供了親和素蛋白CYPJ(NCBI網站上基因登陸號為AF146799)的一種應用，即其在製備抗肝癌藥物中的應用。本發明中，所述的藥物可以是片劑或者針劑。研究表明，轉染有本發明的CYPJ基因的細胞與空白對照相比，能促進細胞的克隆形成率；轉染後的293T、C0S7和Hela細胞都可以引起GO-Gl期細胞減少，S期細胞增多，G2/M期無明顯變化，儘管程度有差別，但是趨勢是一致的。S期是細胞物質合成周期，S期增多，說明CYPJ可以促進細胞物質的複製增殖。從而認為本發明的CYPJ蛋白有促進細胞增長的作用。表達有CYPJ蛋白的細胞及其對照注射在裸鼠的左右腋下，裸鼠的皮下移植瘤成功率為100%，潛伏期為14天，瘤體表面光滑或者呈結節狀，直徑大於2cm時有潰破和乾涸。60天後比較左右兩側腫瘤的重量，結果注射有表達CYPJ蛋白的細胞的一側的腫瘤明顯大於對照，統計結果有顯著性差異。用不同的單克隆重複三次，結果都有顯著性差異，因而認為該基因有促進腫瘤細胞生長的功能。肝癌病理樣本分析表明，CYPJ蛋白在癌旁組織中表達要普遍低於在肝癌組織中的表達量，而且表達量的差異與肝癌的分級有密切關係。因此，本發明的CYPJ可以作為靶標，篩選抗肝癌物質。能夠抑制cypj的活性或者表達量，既可以用於製備抗肝癌藥物。本發明的CYPJ可以作為靶標，篩選抑制CYPJ活力的物質或者方法。篩選方法包括以下步驟A選擇候選化合物；B提供檢測CYPJ表達或者活性的體系；C用CYPJ的檢測體系選擇候選化合物；D確定CYPJ表達量或者活性在候選化合物的影響下的改變。作為靶標的除了CYPJ蛋白，還可以是CYPJ基因、CYPJ的mRNA、CYPJ的表達產物及其前述三者的特異性片斷。所述"特異性片斷"是指可以區別本發明的CYPJ與其它基因的片斷。利用本發明的CYPJ，通過各種常規篩選方法，可篩選出與其發生相互作用的物質，如受體、抑制劑或拮抗劑等。這些與CYPJ發生相互作用或者抑制其活性的物質可以是核酸、胺基酸、化合物等。本發明的CYPJ，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。配製好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)肌內、腹膜內、皮下、皮內、或局部給藥。以本發明的人CYPJ蛋白為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的人CYPJ可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的CYPJ還可與其他治療劑一起使用。當本發明的人CYPJ蛋白被用作藥物時，可將治療有效劑量的該蛋白施用於哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。本發明中，所述的促細胞增長藥物是由含有效治療量的CYPJ蛋白和藥學上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。本發明的CYPJ蛋白抑制劑可以製成試劑盒，用於抑制或者減緩肝癌病情的發展，或者與其它藥物聯用，減低藥物用量或者改善使用效果。本發明的CYPJ蛋白能促進細胞的克隆形成率，可以促進細胞物質的複製增殖，並且能促進腫瘤細胞生長，因此，可以作為篩選抗腫瘤藥劑的靶標。將CYPJ的抗體或者抑制劑與適當的藥學載體聯用，可以製成抗肝癌藥物，用於抑制或者減緩腫瘤病情的發展，降低患者的痛苦。具體實施例方式實施例一對克隆形成率的影響預先做L02細胞對G418的細胞藥敏實驗，按梯度濃度獲得半數致死量約為600M/ml。按5X104的密度接種細胞於60mm細胞培養皿，按照上述操作轉染帶有Neor選擇標記的pcDNA3.IB-CYPJ和pcDNA3.1，48-72小時後消化細胞，移入60cm皿，次日加入G418，連續培養15-20天時間，中間酌情換液。G418篩選培養15-20天時間之後，去掉培養基，用室溫1XPBS洗一次，力n2ml預冷的甲醇4'C固定10min.棄去固定用的甲醇，用預冷的1XPBS洗一次，加GIMESA染色劑，室溫染色10min，清水洗3遍，去浮色，拍照、計數。用構建好的pcDNA3.1-CYPJ重組子與pcDNA3.1空載體轉染L02細胞株。經過20天G418篩選之後，根據細胞數目確定克隆大小，大於200個細胞的稱為大克隆，100-200個細胞之間的稱為中克隆，50-100個細胞之間的稱為小克隆。比較大中克隆之間的差異，重複2次每次三皿取平均值，轉染pcDNA3.l-CYPJ重組子後L02所形成的克隆數顯著大於轉染pcDNA3.1空載體後所形成的克隆數。t檢驗結果示差異有顯著性P〈0.01。這些結果提示，CYPJ能促進細胞克隆形成。表l宿主細胞L02經G418穩定篩選後的大中克隆數tableseeoriginaldocumentpage7實施例二穩定表達株的裸鼠致瘤實驗BALB/C-nn/nu裸鼠在無特定病原體(SPF)條件下飼養，4周-6周的裸鼠9隻，對數生長期的上述單克隆細胞株L02-CYPJ-pcDNA3.1和L02-pcDNA3.l細胞分別取3X10e懸浮於PBS200ul中，用6號針頭的注射器分別注射在裸鼠的左右腋下。裸鼠的皮下移植瘤成功率為100%，潛伏期為14天，瘤體表面光滑或者呈結節狀，直徑大於2cm時有潰破和乾涸。60天後比較左右兩側腫瘤的重量，結果L02-CYPJ-pcDNA3.1—側的腫瘤明顯大於L02-pcDNA3.1，統計結果有顯著性差異。用不同的單克隆重複三次，結果都有顯著性差異，認為該基因有促進L02等腫瘤細胞生長的功能。實施例三在肝癌組織中的表達結果以e-MG作為cDNA上樣量參照，先用P-MG和CYPJ引物進行PCR擴增，確定最佳循環數，取30個循環作為最佳循環數。然後用e-MG引物將40對肝癌及癌旁組織總RNA反轉錄cDNA模板調至相對一致，用CYPJ引物對調整好的模板進行PCR擴增。將作為參照的e-MGPCR產物與CYPJPCR產物混合上樣電泳，經凝膠成像拍攝得到電泳結果。結果顯示，肝癌組織大多比癌旁組織上調表達。對上述電泳結果條帶做掃描定量分析。每一個病理樣品得到4個掃描值，即C7屍/的肝癌及癌旁掃描值，P-MG的肝癌及癌旁掃描值。最後我們按照(C7屍/肝癌/e-MG肝癌)/(07y癌旁/e-MG癌旁)的計算公式得到一個反映CT/y基因表達情況的DR值。我們規定DR值大於l.5表示該基因上調表達，DR值小於O.75表示下調表達，0.75〈DR〈1.5表示表達無顯著變化。結果顯示，26/40肝癌組織中比癌旁組織上調表達。經過進一步統計分析表明，CYPJ的表達與肝癌分級(Edmondson，s分級)有顯著相關，P〈0.01。權利要求1.一種親和素蛋白CYPJ在製備抗肝癌藥物中的應用。2.如權利要求l所述的應用，其特徵在於，該藥物是片劑或者針劑。全文摘要本發明涉及基因和醫藥領域，具體的說，本發明提供了一種親和素蛋白的用途。親和素蛋白(Cyclophilins，CyPs)是一類高度保守、普遍存在肽基——脯氨醯順反異構酶活性(PPIase)的家族，CYP-JcDNA長1.25Kb，編碼161個胺基酸，已從人的胎腦cDNA文庫中分離並鑑定(Cytogenet.CellGenet.92，231-236)。本發明提供了CYPJ在製備抗肝癌藥物中的應用。本發明的CYPJ蛋白能促進腫瘤細胞生長，可以作為篩選抗腫瘤藥劑的靶標，用於抑制或者減緩腫瘤病情的發展，降低患者的痛苦。文檔編號A61K38/17GK101181627SQ20071017080公開日2008年5月21日申請日期2007年11月22日優先權日2007年11月22日發明者龍餘,張明君,帥陳申請人:復旦大學