雙靶向的製作方法

2023-10-18 03:37:44 3

雙靶向的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於抗體的雙靶向分子，且涉及用於生成這類雙靶向分子的方法，包括基於文庫的方法。
【專利說明】雙靶向
【技術領域】
[0001]本發明涉及基於抗體的雙靶向分子，且涉及生成這種雙靶向分子的方法，包括基於文庫的方法。
[0002]發明背景
[0003]本發明涉及雙特異性抗體或其功能片段的新型設計。
[0004]在文獻中已報導了多種生成雙特異性抗體分子的方法。這些方法可以分為兩類:I)生成雙特異性抗體形式，其中識別兩個靶標或兩個表位的兩個互補位都位於由一個互補VH-VL配對形成的一個異源二聚抗體可變區內，並且都包含屬於該互補VH-VL配對的⑶R殘基，和2)生成其它雙特異性抗體形式，其中識別兩個靶標或表位的兩個互補位並不都位於由一個互補VH-VL配對形成的異源二聚抗體可變區內，並且並不都包含屬於該同一互補VH-VL配對的CDR殘基。
[0005]在第一類方法內，在文獻中只描述了兩種可預見地設計雙特異性抗體分子的方法，並且在下面的[0014]至[0015]段中進行了詳細的論述。然而要介紹本方法，首先要概述第二類方法。
[0006]第二類方法(其中識別兩個靶標或表位的兩個互補位並不都位於由一個互補VH-VL配對形成的一個異源質二聚抗體可變區內，並且並不都包含屬於該同一互補VH-VL配對的CDR殘基)構成多個前人工作的大部分內容，並且已描述了這種雙特異性抗體的多種不同的實例。
[0007]在屬於第二類方法的第一組實例中，通過化學連接或通過基因融合由一個或多個肽連接體結合有不同特異性的兩個或多個抗體片段(包括Fab片段、單鏈Fv或單一抗體結構域)。在這組實例中公開的雙特異性抗體形式包括以下:
[0008]a.雙抗體(Perisic et al., Structure.1994Decl5 ; 2 (12): 1217-26 ; Kontermann,Acta Pharmacol Sin.2005Jan;26(I):1-9;Kontermann,Curr Opin MolTher.20IOApr;12(2):176—83.)
[0009]b.串聯雙抗體(TandAb)等(Cochlovius et al., CancerRes.2000Augl5;60(16):4336-41.)
[0010]c.對由肽連接體基因融合的不同祀標有特異性的單一結構域(e.g.Domantis:W02008/096158;Ablynx:W02007/112940)
[0011]d.其它(供參閱，參見:Enever et a 1., Curr OpinBiotechnol.2009Aug ; 20 (4):405-1 1.Epub2009Aug24.;Carter,Nat.Rev.Tmmunol.6,343 (2006);P.Kufer et al., Trends Biotechnol.22, 238(2004)).[0012]為了改善其在醫學應用中的潛在的可用性，可以用多種技術延長上述雙特異性抗體形式的體內血清半衰期，包括以下:
[0013]a.加入血清白蛋白或血清白蛋白結合體
[0014]b.聚乙二醇化(PEGylation)
[0015]c.通過基因融合如 HAPylation (Schlapschy et al., Protein Eng DesSe 1.2007Jun;20 (6):273-84.Epub2007Jun26)或 XTEN(Sche11enberger,Nat.Biotechnologyl2 (2009) 1186)加入蛋白聚合物。
[0016]在這組實例中，包含抗體片段的雙特異性抗體缺少Fe區，並因此通常不顯示與初生Fe受體FcRn的天然結合，不表現全IgG抗體的天然效應子功能(ADCC和⑶C，參考)，並且通常不會被超抗原衍生的親和樹脂、如以對IgG抗體同樣的方式對Fe區有特異性的蛋白A樹脂純化。缺少Fe區的結果是會限制可達到的血清半衰期、作為活性藥物成分的可行性應用以及這種雙特異性抗體的經濟生產。
[0017]在屬於第二類方法的第二組實例中，雙特異性抗體包含類IgG分子和一個或幾個額外附加的結合結構域或實體。這些抗體包括IgG-scFv融合蛋白，其中單鏈Fv已融合至重鏈或輕鏈的一端(加利福尼亞大學，Biogen Idee, CAT/Medlmmune),和雙可變結構域(dvd-1gG)分子，其中額外的VH結構域和連接體融合至重鏈的N末端，且額外的VL結構域和連接體融合至輕鏈的N端(Abbott)。通常，這些方法在構建體的生產、可及性和穩定性方面存在不足。
[0018]在屬於第二類方法的第三組實例中，雙特異性抗體包含以這樣的方式生成或修飾的類IgG抗體,使得其在不加入進一步的結合結構域或實體的情況下表現兩種特異性。這些抗體包括IgG分子，其中已修飾天然同型二聚體CH3結構域使其變成異源二聚體，例如使用設計的突起(Ridgway et al., Protein Eng.1996Jul; 9 (7): 617-21)、使用鏈交換(Daviset al., Protein Eng Des Sel.2010Apr; 23 (4): 195-202.Epub2010Feb4)或使用設計的相反變化(Novo Nordisk),從而潛在地使兩半的類IgG分子通過加到Fe區、通常是N-末端Fab區的結合實體而結合兩個不同的靶標。該第三組實例中的抗體還包括IgG分子，其中修飾不天然參與抗原接觸的一些結構環以結合另一靶標，除了通過可變區CDR環天然結合的一個以外，例如通過Fe區中的點突變(例如Xencor Fe結合FcgRIIb)或通過結構環的多樣化(例如具有多樣化的CH3結構域的f-star Mab2)。這些方法在穩定性、生產、化合價以及有限的親和力/應用方面存在不足。
[0019]與第二類中雙特異性抗體的所有上述實例相反，第一類中的雙特異性抗體具有對兩個靶標有特異性的兩個互補位，這兩個靶標都包含位於同一異源質二聚VH-VL抗體可變結構域內的CDR殘基。本領域中僅描述了歸於第一類的四種抗體分子。這四種類型中，第一種抗體不是真的雙特異性抗體，因為其不能特異性識別兩個不相關的靶標；第二種抗體是天然產生的，但由於還沒有公開這類研究的實例，因此是否可以可預見地設計尚不可知，；以及根據出版物，只有第三類和第四類抗體可以被設計為對兩個不相關靶標有特異性。歸於第一類的四種抗體分子如下:
[0020]可交叉反應抗體具有與兩個或多個結構相關的抗原或表位相對應的單一廣譜特異性。對於這類抗體，這兩種抗原在序列和結構上是相關的。例如，抗體可以與來自不同物種的相關靶標如雞蛋清溶菌酶和火雞溶菌酶交叉反應(W092/01047)，或與處於不同狀態或形式的相同祀標如半抗原和與載體共軛的半抗原交叉反應(Griffiths AD et a 1.EMBOJ199413:14 3245-60)。可以有目的地設計用於交叉反應的抗體。例如，已設計抗體以識別來自不同物種的兩個相關的抗原(example Genentech:antibody binding humanLFAlengineered to also bind rhesus LFA1, resulting in successful drug Raptiva/Efalizumab)。同樣地，W002/02773描述了有「雙特異性」的抗體分子。提及的抗體分子是針對多個結構相關的抗原培養或篩選的抗體，其具有可以適應兩個或多個結構相關的靶標的單一結合特異性。然而如上所述，這些可交叉反應的抗體並不都真的雙特異性抗體，且其並未都被設計(engineered)為特異性識別兩種不相關靶標。
[0021]此外，有天然產生的多反應性自身抗體(Casal i&Notkins, Ann.Rev.1mmunol.7，515-531)。這些多反應性自身抗體具有識別不結構上不相關的至少兩個(一般更多)不同抗原或表位的能力。還示出，在單克隆抗體上使用噬菌體展示技術對隨機肽組分的選擇將識別一些適合抗原結合位點的肽序列。一些序列高度相關，具有共有序列，然而其它的序列很不相同，並且已被稱為模擬表位(Lane&Stephen, Current Opinion inImmunology, 1993，5，268-271)。因此，很清楚一些異源二聚VH-VL抗體的結合位點具有與不同的且有時不相關的抗原結合的潛力。然而如上所述，這些多反應性抗體可以被發現但還不能使用本領域描述的可預見的方法有意地設計。
[0022]本領域中描述的一種方法涉及「二合一」抗體，其允許有意設計這樣的雙特異性抗體，，即通過都位於一個互補異質源二聚VH-VL配對內且都包含屬於該互補VH-VL配對的CDR殘基的互補位，其能夠結合兩個結構無關的靶標的兩個雙特異性抗體。使用有與以前的交叉反應設計法所不同的方法設計這些「二合一」抗體，以包含兩個重疊互補位。W02008/027236 和 Bostrom 等(Bostrom et al., Science.2009Mar20;323(5921):1610-4)已經描述了這些內容。在公開實例中，分離對一個靶標(HER2)有特異性的異源二聚VH-VL抗體可變區，並於其後重新多樣化輕鏈以實現對第二靶標(VEGF或死亡受體5)的額外特異性。對於生成的抗體之一，結合的特徵在於結構解析度，並且發現與一個抗體-抗原絡合物中的HER2接觸的VH和VL⑶R殘基有11/13，還與替代的抗體-抗原絡合物中的VEGF接觸。當公開的「二合一」抗體保留了對HER2的納米摩爾級親和力時，由Bostrom等公布的克隆中只有一個對額外靶標VEGF有300nM的納米摩爾級親和力，而四個其它克隆對額外靶標有微摩爾級親和力。顯然，當這種方法已實現與兩個結構不相關的靶標的結合時，需要該兩個靶標之間的表面相容性達到一定程度以啟用兩個重疊互補位的特異性。還沒有詳細描述這種「二合一」抗體對僅有的兩個靶標有多高的特異性，以及是否能觀察到可能由對位於兩個互補位的重疊部分之間的側鏈的構象柔性的需求引起的這些抗體的一般非特異性結合或「粘貼」。
[0023] 本領域中描述的第二個方法涉及包含單結構域抗體互補對的抗體，其允許有意設計雙特異性抗體，即通過都位於一個互補異源二聚VH-VL配對內且都包含屬於該互補VH-VL配對的CDR殘基的互補位，使其能夠與兩個結構無關的靶標結合。W02003/002609和US2007/026482已描述異源質二聚VH-VL抗體，其中重鏈可變結構域識別一個靶標，且輕鏈可變結構域識別第二結構不相關的靶標，且其中具有不同特異性的兩個單結構域結合到一個結合異源二聚VH-VL可變區中。在這些抗體的公開實例中，首先將單結構域分別篩選為不成對VH結構域或不成對VL結構域，以結合兩個不相關的靶標，然後結合到對該兩個靶標有特異性的結合異源二聚VH-VL可變結構域。
[0024]對於屬於第一類雙特異性抗體(能夠通過都位於一個互補異源VH-VL配對內且都包含屬於該互補VH-VL配對的CDR殘基的兩個互補位與兩個靶標結合)的所有分子，不需要將額外的結構域或實體融合至IgG分子，不需要使IgG分子的結構環多樣化，且不需要利用有限的異質雙特異性Fe區以實現雙特異性。這有幾個潛在的優點:[0025]減小了蛋白質穩定性降低的風險，因為不必使結構環多樣化，且不必修飾恆定結構域界面，從而潛在地極大地改善了抗體的生物物理特性。
[0026]不需要潛在地易於蛋白水解或潛在地致免疫性的連接體，從而改善了抗體作為活性藥物成分的可開發性。
[0027]不會出現不期望的VH和VL結構域配對，避免了表達期間包含錯配的異源二聚VH-VL可變區的潛在副產物，因為只需要一個唯一的VH區和一個唯一的VL區。
[0028]不會降低不尋常的共價凝集體表達或生成，因為與傳統的單特異性抗體相比，不需要額外的二硫鍵。
[0029]可以將在互補異源二聚VH-VL配對內包含兩個互補位的雙特異性異源二聚可變區與包括Fe區的不同的恆定結構域結合。這具有幾個優點:
[0030]a.使用完全確立的方法，例如與傳統的單特異性IgG的製備中使用的那些相同的方法，潛在地改善了製備。
[0031]b.在患者和動物模型中調節FcRn介導的血清半衰期。
[0032]c.自由選擇與不同同種型有關的效應子功能，範圍從本質上細胞無毒性惰性行為(例如在設計用於受體封 阻的抗體中)到侵略性細胞毒性行為(例如在設計以殺死腫瘤細胞的抗體中)。
[0033]由與交叉反應設計相關的方法得到的「二合一」抗體的上述第三個實例的醫學應用性，潛在地極大地受到對於CDR環內重疊的、至少部分共享的結合殘基的兩個不相關的靶標的競爭的限制。此外，首先實現對一個靶標有特異性的「二合一」抗體的固有順序選擇方法，隨後重新多樣化，然後發現對額外靶標有特異性的克隆，這是耗時且不可預測的，因為只有有限量的對第一靶標有特異性的抗體可以被重新多樣化進可選擇文庫中，但不知道該第一特異性克隆中的哪個是最經得起檢驗以設計額外期望的特異性。最後，因為為了增加與一個靶標的結合對可變結構域序列的任何改進會潛在地引起對另一靶標的親和力降低，這一事實使得「二合一」抗體的分離和親和性成熟變得極為複雜。
[0034]因為一些負責與第一靶標結合的潛在的重要輕鏈⑶R殘基與一些負責與在最後的且緊密的雙特異性異源二聚抗體可變區中的第二靶標結合的潛在重要重鏈CDR殘基直接相鄰，這一事實使得上述通過輕鏈⑶R環殘基結合一個靶標和通過重鏈⑶R環殘基結合另一靶標的上述四個實例變得極為複雜。這意味著在其結合狀態，由於位阻，由這些抗體識別的第一靶標可以與由這些抗體識別的第二靶標競爭，因而潛在地限制了這些抗體的醫學應用性。此外，如果這些抗體的輕鏈和重鏈通過US2007026482 (Abbott Laboratories)的歷史實例中描述的選擇和篩選方法單獨地分離，由於重鏈和輕鏈配對可能出現CDR中的構象變化，因此將它們結合到雙特異性抗體可能會潛在地影響本來獨立的結構域對結合的雙特異性分子中的單個靶標的親和力。最後，將預分離的VH和VL可變結構域與各種⑶R環結合,可能會導致不可預料的抗體穩定性，因為'Wdrn和Pliickthun (1998)以及Rdthlisberger等(2005)已描述了 VH和VL結構域之間存在抗體重鏈和輕鏈的重要的相互作用和相互穩定。
[0035]相反，互補異源二聚VH-VL配對內包含兩個互補位的雙特異性異二聚源可變區可以用作抗體片段，如Fab片段或單鏈Fv，且不需要存在Fe區以實現其雙特異性，這允許在沒有哺乳類N-糖基化機制的情況下選擇微生物生產，以及其在需要低分子量或短血清半衰期的治療或診斷應用中的用途。
[0036]因此，儘管在互補異源二聚VH-VL配對中有兩個互補位的方法有如此多的優點，但是到目前為止，以上描述的嘗試的成功有限。
[0037]因此，仍然未滿足提供用於包括在互補異源二聚VH-VL配對中有兩個互補位的優點同時避免了現有技術構建體的問題的雙特異性抗體的改進形式的需要。
[0038]本發明已提供了該問題的解決方案，即設計用於每個互補異源二聚VH-VL配對的兩個互補位，其中每個互補位使用來自VH和VL結構域的⑶R區的殘基，到目前為止，這尚未被現有技術實現或暗示。
[0039]發明概述
[0040]本發明涉及雙特異性抗體，其特徵在於，每一互補異源二聚VH-VL配對具有兩個互補位，其中每一互補位使用來自VH和VL結構域的CDR區的殘基。
[0041]因而，在第一方面，本發明涉及抗體或其功能片段，其包含由重鏈可變(VH)結構域和輕鏈可變(VL)結構域組成的至少一個可變結合結構域，其中所述結合結構域包含兩個不相關表位的兩個互補位，其中(i)每一互補位與其表位的結合併不阻止其他互補位與其各自表位同時結合，且其中(ii)兩個互補位均包含來自至少一個VH⑶R的至少一個殘基和來自至少一個VL⑶R的至少一個殘基。
[0042]在第二方面，本發明涉及編碼本發明的抗體或其功能片段的核酸序列。
[0043]在第三方面，本發明涉及包含本發明的核酸序列的載體。
[0044]在第四方面，本發明涉及包含本發明的核酸序列或本發明的載體的宿主細胞。
[0045]在第五方面，本發明涉及產生本發明的抗體或其功能片段的方法，包括以下步驟:在體外或由合適的宿主細胞表達本發明的核酸序列或本發明的載體，所述宿主細胞包括本發明的宿主細胞。
[0046]在第六方面，本發明涉及抗體或其功能片段的集合，其中所述集合包括抗體可變結構域序列的多樣化集合，其中(i)使來自Libl位置的至少3個CDR殘基多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內，且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，且其中來自Lib2位置的殘基沒有被多樣化；或(ii)使來自Lib2位置的至少3個⑶R殘基多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內，且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，且其中來自Libl位置的殘基沒有被多樣化。
[0047]在第七方面，本發明涉及產生雙特異性抗體分子或其功能片段的方法，包括以下步驟:
[0048]a.產生抗體分子或其功能片段的第一集合，每一抗體分子或其功能片段都包含異源二聚VH-VL可變結構域，其中在選自Libl組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，並且其中來自Lib2的殘基沒有被多樣化；
[0049]b.從所述第一集合中篩選對第一靶標或表位有特異性的第一抗體分子或其功能片段；
[0050]c.產生抗體分子或其功能片段的第二集合，每一抗體分子或其功能片段都包含異源二聚VH-VL可變結構域，其中在選自Lib2組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，並且其中來自Libl的殘基沒有被多樣化；
[0051]d.從所述第二集合中篩選對第二靶標或表位有特異性的第二抗體分子或其功能片段；以及
[0052]e.產生編碼包含異源二聚VH-VL可變區的第三抗體分子或其功能片段的核酸序列，其中所述第三抗體分子或其功能片段包含第一抗體分子或其功能片段中Libl位置的組中存在的至少3個殘基，其中至少一個殘基位於VH結構域內且至少一個殘基位於VL結構域內，並且其中所述第三抗體分子或其功能片段還包含第二抗體分子或其功能片段中Lib2位置的組中存在的至少3個殘基，其中至少一個殘基位於VH結構域內且至少一個殘基位於VL結構域內。
[0053]在第八方面，本發明涉及產生雙特異性抗體分子或其功能片段的方法，包括以下步驟:
[0054]a.產生抗體分子或其功能片段的第一集合，每一包含異源二聚VH-VL可變區，其中在選自Libl組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的殘基位於VL結構域內，並且其中來自Lib2位置的殘基沒有被多樣化；
[0055]b.從所述第一次集合中篩選對第一靶標或表位有特異性的第一抗體分子或其功能片段；
[0056]c.產生抗體分子或其功能片段的第二集合，每一抗體分子或其功能片段都包含異源二聚VH-VL可變區，其通過以下方式進行:在選自Lib2的組的至少3個⑶R位置引入多樣性，使得所述第一抗體分子或其功能片段多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的殘基位於VL結構域內，並且其中來自Libl的殘基沒有被多樣化；
[0057]d.從所述第二集合中篩選對第二靶標或表位有特異性的第二抗體分子或其功能片段；以及
[0058]e.可選地，在具有以下修飾的情況下，實施步驟a至d，通過使選自Lib2組的至少3個⑶R位置多樣化來產生步驟a的第一集合，並在步驟c中，在選自Libl組的至少3個CDR位置使所述第一抗體分子或其抗體片段多樣化。
[0059]在第九方面，本發明涉及包含抗體分子或其功能片段的藥物組合物，並任選地包含藥學上可接受的載體和/或賦形劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]下面的圖1示出優選CDR位置的列表，其中在本發明的一些實施方案中的抗體文庫中的所有位置或子集應多樣化(A);框架區中優選的可選的增強位置的列表，其在本發明的一些實施方案中的抗體文庫中也可以被多樣化(B);以及優選CDR位置的列表，其中在本發明的所有文庫中，所有位置或子集優選保持不變，即都位於Libl殘基被多樣化的文庫中和Lib2殘基被多樣化的文庫中。
[0061] 下面的圖2以示意圖的方式示出該新型雙特異性抗體的發現過程，使用俯視(空中)圖示出首先在代表Libl和Lib2CDR殘基的兩個區中分別是如何使異源二聚VH-VL抗體支架多樣化的；這產生了分別篩選以獲得兩個抗體克隆的兩個文庫，其中第一克隆通過第一互補位結合第一靶標或表位，且第二克隆通過第二互補位結合第二靶標或表位；根據本發明，然後通過將在第一抗體克隆中的Libl位置中篩選的靶標-特異性殘基引入到第二抗體克隆，或通過將在第二抗體克隆中的Lib2位置中篩選的靶標-特異性殘基引入到第一抗體克隆，將這些克隆結合進雙特異性抗體。圖2還以示意圖的方式示出從俯視(空中)圖中可見的框架區中的本發明的那些潛在的增強殘基的位置。
[0062]圖3示出我們已測試的四種優選的文庫設計(文庫Lib DlLULib DlL2、Lib DlHl和Lib D1H2)。我們生成這四種文庫中的每一個，作為編碼具有示出的VH3-VK1配對作為異源二聚VH-VL支架的人Fab片段的合成基因的庫。每個文庫中的合成基因在以單一字母代碼顯示特定胺基酸的位置中是不變的，且在標記為「X」的位置是多樣化的。該四個文庫每一個都生成為噬菌體展示庫，並使用本領域中已知的標準方法針對幾種抗原分類。從這四個文庫中選擇的抗體克隆已結合進如圖4詳述的雙特異性抗體中。圖3進一步示出了三種額外優選的文庫設計(Lib DlH3、Lib D2L1和Lib D2H1)。
[0063]圖4給出根據本發明生成的雙特異性抗體序列的實例。
[0064]圖5示出圖4公開的抗體的特異性，通過抗MBP抗GST雙靶向克隆HM2LG1的ELISA分析證明。
[0065]圖6示出闡明本發明的雙特異性構建體的高特異性的Biacore?數據。
[0066]圖7示出針對VEGF和IL6的親本抗體和雙特異性抗體的Biacore?分析。
[0067]圖8示出闡明兩個靶標獨立共結合本發明的雙特異性構建體的Biacore?信息:A:GMCSF+抗體+IL6的共結合；B:抗LC+抗體+IL6的共結合
[0068]發明詳述
[0069]與以前的方法相比，迄今為止本發明用於構建雙特異性抗體的特殊性尚不為人所知，其可能在於對於每一互補異源二聚VH-VL配對具有兩個互補位，其中每一互補位使用來自VH和VL結構域的CDR區的殘基。
[0070]因而，在第一方面，本發明涉及抗體或其功能片段，其包含由重鏈可變(VH)結構域和輕鏈可變(VL)結構域組成的至少一個可變結合結構域，其中所述結合結構域包含對於兩個不相關的表位的兩個互補位，其中(i)每一互補位與其表位的結合併不阻止其他互補位與其各自表位同時結合，且其中(ii)兩個互補位均包含來自至少一個VH⑶R的至少一個殘基和來自至少一個VL⑶R的至少一個殘基。
[0071]本文使用的術語「抗體」指免疫球蛋白(Ig)分子，其被定義為屬於IgG、IgM、IgE、IgA或IgD類(或其任何子類)的蛋白，其包括所有常規上已知的抗體及其功能片段。抗體/免疫球蛋白分子的「功能片段」在此被定義為保留抗原結合區的抗體/免疫球蛋白分子的片段(例如IgG的可變區)。抗體的「抗原結合區」通常存在於抗體分子的一個或多個高變區(或互補決定區，「⑶R」)中，即⑶R-1、⑶R-2和/或⑶R-3區；然而，可變「框架」區在抗原結合中還起著重要作用，例如為⑶R提供支架。優選地，「抗原結合區」至少包含可變輕鏈(VL)的4-103的胺基酸殘基和可變重鏈(VH)的5-109的胺基酸殘基，更優選為VL的3-107的胺基酸殘基和VH的4-111的胺基酸殘基，且特別優選的是完整的VL和VH鏈(VL的胺基酸位置1-109和VH的胺基酸位置1-113 ;根據W097/08320編號)。用於本發明的優選的抗體分子的種類是IgG。
[0072]本發明的「功能片段」包括F (ab』)2片段、Fab片段、scFv或包含單一免疫球蛋白可變結構域或單一結構域抗體多肽的構建體，例如單一重鏈可變結構域或單一輕鏈可變結構域。可以將F(ab』)2或Fab工程化為使CHl和CL結構域之間發生的分子間二硫化物相互作用最小化或完全去除。
[0073]可以通過免疫動物或者由重組抗體文庫衍生抗體，重組抗體文庫包括基於已經經由電腦模擬(in silicon)設計的且由合成產生的核酸編碼的胺基酸序列的抗體文庫。例如通過分析人類序列的資料庫並利用從其中獲得的數據設計多肽序列，來實現經由電腦模擬設計抗體序列。用於設計和獲得經由電腦模擬產生的序列的方法，例如描述於Knappiket al., J.Mol.Biol.(2000) 296:57 ；Krebs et al., J.1mmunol.Methods.(2001) 254:67 ;和Knappik等人發表的美國專利N0.6300064。
[0074]在本發明的上下文中，術語「雙特異性抗體分子」指包括抗體分子的功能片段的抗體分子，其包含針對兩個不同的靶生物分子或者存在於一個靶生物分子或存在於兩個不同的分子上(例如在靶生物分子和第二生物分子上)的兩個不同的表位的特異性結合位點。
[0075]當結合分子能夠區別靶生物分子和一個或多個對照分子時，由於結合特異性是相對的特性而不是絕對的，因此本文使用的結合分子對靶標例如靶生物分子(或這類生物分子的表位)有「特異性」、「特異性識別」或「特異性結合」。在最普遍的方式中(且沒有提及確定的對照下)， 「特異性結合」指結合分子區別目標靶生物分子和不相關的生物分子的能力，如同例如根據本領域已知的特異性測定法確定的。這樣的方法包括但不限於蛋白質印跡、ELISA、RIA、ECL、IRMA試驗和肽掃描。例如，可以進行標準ELISA試驗。可以通過標準的彩色顯影(例如用第二抗體與辣根過氧化物和四甲基聯苯胺與過氧化氫)(e.g.secondary antibody with horseradish peroxide and tetramethyl benzidinewith hydrogenperoxide)進行評分。通過光密度，例如在450nm下的光密度對某些孔內的反應評分。典型背景(=陰性反應)可以為約0.10D ;典型的陽性反應可以為約10D。這意味著陽性評分和陰性評分之間的比為10倍或更高。通常，不是使用單一對照生物分子而是一組約3-5個不相關的生物分子，例如奶粉、BSA、轉鐵蛋白等，來進行結合特異性的確定。
[0076]在本發明的背景下,術語「約(about)」或「大約(approximately) 」意指給定值或範圍的90%和110%之間。
[0077]然而，「特異性結合」還可以指結合分子區別靶生物分子和用作對照點的一個或多個密切相關的生物分子的能力。此外，「特異性結合」可以涉及結合分子區別它的靶抗原的不同部分的能力，例如靶生物分子的不同結構域、區或表位，或者區別靶生物分子的一個或多個關鍵胺基酸殘基或胺基酸殘基片段的能力。
[0078]在本發明的上下文中，術語「互補位」指給定抗體分子的靶和抗體分子之間的特異性結合所必需的部分。互補位可以是連續的，即由抗體分子中存在的相鄰的胺基酸殘基形成；或者可以是不連續的，即由胺基酸殘基的基本序列諸如位於胺基酸殘基的CDR的胺基酸序列中的不同位置的、但在抗體分子採用的三維結構中極為貼近的胺基酸殘基形成。
[0079]在本發明的背景下，術語「表位」指給定靶的靶和抗體之間的特異性結合所必需的部分。表位可以是連續的，即由靶中存在的相鄰的結構要素形成；或者是不連續的，即由靶的基本序列諸如作為靶的蛋白的胺基酸序列中的不同位置的、但在天然環境例如體液中靶所採用的三維結構中處於極為貼近的結構要素形成。
[0080]在一個實施方案中，抗體或其功能片段是雙特異性抗體。[0081]在本發明的抗體或其功能片段的另外的實施方案中，其他條件相同，在同時存在兩個表位的情況下每一互補位與其各自表位的結合量是在缺少另一表位的情況下達到的結合量的至少25%。
[0082]在本發明的抗體或其功能片段的另外的實施方案中，結合量是至少50%，特別是至少75%，更特別是至少90%。
[0083]在本發明的抗體或其功能片段的另外的實施方案中，第一互補位包含來自VL結構域的⑶Rl和⑶R3的殘基和來自VH結構域的⑶R2的殘基，且第二互補位包含來自VH結構域的⑶Rl和⑶R3的殘基和來自VL結構域的⑶R2的殘基。
[0084]在具體的實施方案中，抗體或其功能片段是人抗體或其功能片段。
[0085]在其他實施方案中，本發明的抗體或其功能片段是基於人VH3家族重鏈序列和人Vk I族輕鏈序列。
[0086]在其他實施方案中，本發明的抗體或其功能片段是基於人VH3家族重鏈序列和人VAl族輕鏈。
[0087]在其他實施方案中，本發明的抗體或其功能片段選自單鏈Fv片段、Fab片段和IgG0
[0088]在本發明的抗體或其功能片段的另外的實施方案中，可以通過使Libl或Lib2位置的其中之一發生突變來打破與一個表位的結合，同時保持與另一表位的結合完整。
[0089]在該背景下,短語「打破結合(binding..[is]..knocked out)」指與表位的親和力降低至少10倍(例如從InM至IOnM)的情況,且短語「保持結合完整(binding..1s keptintact) 」指與表位的親和力最多降低3倍(例如從InM至3nM)的情況。
[0090]在具體的這類實施方案中，可以通過使VL位置27或VH位置61的其中之一發生突變或者通過使Lib2位置的VL位置56或VH位置28的其中之一發生突變，來打破與表位的結合。
[0091]在具體的這類實施方案中，當殘基選自D、N、E和Q時，可以通過使[0066]部分列出的殘基的其中之一突變為R，來打破與表位的結合；當殘基不同於D、N、E或Q時，可以通過使這類殘基突變為D來打破與表位的結合。
[0092]在另一方面，本發明涉及包含含有一條可變輕鏈和一條可變重鏈的至少一個抗體可變結構域的結合分子，其中所述抗體可變結構域至少與第一靶標和第二靶標結合，其中所述抗體可變結構域與所述第一靶標的結合獨立於所述抗體可變結構域與所述第二靶標的結合，反之亦然，並且其中所述第一祀標和第二祀標既不是抗獨特型(ant1-1diotypic)抗體，也不是非生理型多肽，例如用於表位作圖的多肽類。
[0093]在本發明的背景下，抗體可變結構域與一個靶標的結合「獨立於」與另一靶標的結合，其他條件相同時，在同時存在兩個靶標的情況下第一互補位與其相應表位(第一靶標)的結合量是在缺少另一靶標的情況下達到的結合量的至少25%。特別的是，結合量是至少50%，特別是至少75%，更特別是至少90%。
[0094]在具體的實施方案中，所述第一靶標和第二靶標均是生理上相關的靶標和/或其表位，包括疾病相關的祀標，例如癌相關的抗原、細胞表面受體、細胞因子和/或其他信號分子。
[0095]在第二方面，本發明涉及編碼本發明的抗體或其功能片段的核酸序列。[0096]在第三方面，本發明涉及包含本發明的核酸序列的載體。
[0097]在第四方面，本發明涉及包含本發明的核酸序列或本發明的載體的宿主細胞。
[0098]在第五方面，本發明涉及用於產生本發明的抗體或其功能片段的方法，包括以下步驟:在體外或從合適的宿主細胞表達本發明的核酸序列或本發明的載體，所述宿主細胞包括本發明的宿主細胞。
[0099]在第六方面，本發明涉及抗體或其功能片段的集合，其中所述集合包括抗體可變結構域序列的多樣化集合，其中(i)使來自Libl位置的至少3個CDR殘基多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內，且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，且其中來自Lib2位置的殘基沒有被多樣化；或(ii)使來自Lib2位置的至少3個⑶R殘基多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內，且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，且其中來自Libl位置的殘基沒有被多樣化。
[0100]在第六方面的實施方案中，本發明涉及抗體或其功能片段的集合，其中在α)的情況下，使VL結構域的⑶Rl和⑶R3和VH的⑶R2中的每一個至少一個殘基多樣化，或者在(ii)的情況下，使VH結構域的⑶Rl和⑶R3和VL的⑶R2中的每一個至少一個殘基多樣化。
[0101]在第六方面的另一實施方案中，本發明涉及抗體或其功能片段的集合，其中在α)的情況下，額外地使所述可變結合結構域中的LiblE位置的至少一個殘基多樣化，和/或在
(ii)的情況下，額外地使所述可變結合結構域中的Lib2E位置的至少一個殘基多樣化。
[0102]在第七方面，本發明涉及產生雙特異性抗體分子或其功能片段的方法，包括以下步驟:
[0103]a.產生抗體分子或其功能片段的第一集合，每個抗體分子或其功能片段均包含異源二聚VH-VL可變結構域，其在選自Libl組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，並且其中來自Lib2位置的殘基沒有被多樣化；
[0104]b.從所述第一集合中篩選對第一靶標或表位有特異性的第一抗體分子或其功能片段；
[0105]c.產生抗體分子或其功能片段的第二集合，每個抗體分子或其功能片段均包含異源二聚VH-VL可變區，其在選自Lib2組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，並且來自Libl位置的殘基沒有被多樣化；
[0106]d.從所述第二集合中篩選對第二靶標或表位有特異性的第二抗體分子或其功能片段；以及
[0107]e.產生編碼包含異源二聚VH-VL可變區的第三抗體分子或其功能片段的核酸序列，其中所述第三抗體分子或其功能片段包含第一抗體分子或其功能片段中Libl位置的組中存在的至少3個殘基，其中至少一個殘基位於VH結構域內且至少一個殘基位於VL結構域內，並且所述第三抗體分子或其功能片段還包含第二抗體分子或其功能片段中Lib2位置的組中存在的至少3個殘基，其中至少一個殘基位於VH結構域內且至少一個殘基位於VL結構域內。
[0108]在第八方面，本發明涉及產生雙特異性抗體分子或其功能片段的方法，包括以下步驟:
[0109]a.產生抗體分子或其功能片段的第一集合，每個抗體分子或其功能片段均包含異源二聚VH-VL可變區，其在選自Libl組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的殘基位於VL結構域內，並且其中來自Lib2位置的殘基沒有被多樣化；
[0110]b.從所述第一次集合中篩選對第一靶標或表位有特異性的第一抗體分子或其功能片段；
[0111]c.產生抗體分子或其功能片段的第二集合，每個抗體分子或其功能片段均包含異源二聚VH-VL可變結構域，其通過以下方式進行:在選自Lib2組的至少3個⑶R位置引入多樣性使得所述第一抗體分子或其功能片段多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，並且其中來自Libl位置的殘基沒有被多樣化；
[0112]d.從所述第二集合中篩選對第二靶標或表位有特異性的第二抗體分子或其功能片段；以及
[0113]e.可選地，在具有以下變化的情況下實施步驟a至d，通過使選自Lib2組的至少3個⑶R位置多樣化來產生步驟a的第一集合，並且在選自Libl組的至少3個⑶R位置中使步驟c中的所述第一抗體分子或其抗體片段多樣化。
[0114]在第七方面和第八方面的某些實施方案中，本發明涉及方法，其還包括以下步驟:
[0115]f.在宿主細胞中表達步驟a至e中產生的核酸序列或者將核酸翻譯成代表所述第三抗體分子或其功能片段的蛋白質。
[0116]在某些這類實施方案中，本發明涉及方法，其中具有選自Libl組的多樣性的任何所述集合，包括在選自LiblE組的至少一個增強位置的額外的多樣性，和/或其中具有選自Libl組的多樣性的任何所述集合,包括在選自Lib2E組的至少一個增強(enhancing)位置的額外的多樣性。
[0117]在某些這類實施方案中，本發明涉及方法，其中所述第一集合與選自Lib DIL1、Lib D1L2和Lib D2L1的文庫相同，或者所述第一集合來源於具有在Lib DlLULib D1L2或Lib D2L1存在多樣化位置且在框架區具有90%以上序列同一性、特別是95%以上序列同一性的這類文庫；並且其中所述第一集合與選自Lib DlHULib DlH2、Lib D1H3和Lib D2H1的文庫相同，或者所述第一集合來源於具有在Lib DlHULib DlH2、Lib D1H3或Lib D2H1存在多樣化位置且在框架區具有90%以上序列同一性、特別是95%以上序列同一性的這類文庫。
[0118]在某些這類實施方案中，所述抗體分子或其功能片段選自單鏈Fv片段、Fab片段和 IgG。
[0119]在第九方面，本發明涉及包含抗體分子或其功能片段的藥物組合物，並任選地包含藥學上可接受的載體和/或賦形劑。所述組合物可以配製成例如一日一次給藥、一日兩次給藥或者一日三次給藥。
[0120]就本發明的組合物所使用的短語「藥物上可接受的」指這類組合物的分子實體和其他成分，當施用至哺乳動物(例如人)時，其是生理上可容許的且通常不產生不良反應。術語「藥學上可接受的」也可以意味著由聯邦或國家政府的管理機構所認同的，或者在用於哺乳動物、更具體是用於人類的美國藥典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍認可的藥典中所列出的。
[0121]在本發明的背景下,術語「約(about)」或「大約(approximately) 」意指給定值或範圍的90%和110%之間。
[0122]適用於本發明的藥物組合物的術語「載體」指稀釋劑、賦形劑或介質，其與活性化合物(例如雙特異性抗體片段)一起施用。這樣的藥學上的載體可以是無菌液體，例如水、鹽溶液、葡萄糖水溶液、水性甘油溶液，和油類，其包括石油、動物、植物或合成來源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。合適的藥學上的載體描述於A.R.Gennaro的「Remington，s Pharmaceutical Sciences」 (雷明頓藥物學)第 20 版。
[0123]本發明的活性成分(例如雙特異性抗體片段)或者組合物可以用於治療至少一種疾病或紊亂，其中所述治療適合於或者合適地製備成用於本文公開的特定給藥方式(例如一日一次、一日兩次或一日三次給藥)。為此，包裝說明書和/或病患信息含有相應的信息。
[0124]本發明的活性成分(例如雙特異性抗體分子或其片段)或組合物可以用於製備治療至少一種疾病或紊亂的藥物，其中所述藥物適合於或合適地製備為用於本文公開的特定給藥方式(例如一日一次、一日兩次或一日三次給藥)。為此，包裝說明書和/或病患信息含有相應的信息。
實施例
[0125]以下實施例說明本發明但不限制其範圍。
[0126] 雖然以上描述的第一類雙特異性抗體分子(具有對兩個靶標有特異性的兩個互補位，所述的兩個靶標均包含位於同一異源二聚VH-VL抗體可變區內的CDR殘基)提供了如上所述的一些可能的益處，但我們假設可以產生完全新穎的抗體分子種類，其屬於第一類抗體分子，但是完全不同於以上所述的文獻中已報導的四個實例。我們假設通過尋找完全新穎的方法，能夠在對屬於第一類抗體的有意工程化方面相比以上所述的實例取得一些顯著的改進。該假設考慮如上所述的之前的方法在抗體作為活性藥物成分的發展中存在一些重要的潛在局限性的事實。
[0127]根據本發明，我們描述了一類完全新穎的雙特異性抗體，其解決了這些問題並具有意想不到的且顯著的優勢。我們推斷，可以在異源二聚抗體的VH-VL可變區內設計兩個不同的互補位，每一個都包含來自重鏈和輕鏈的⑶R殘基，但是並不重疊且優選相互之間不緊密相鄰，從而避免一個結合位點的突變引起的另一結合位點的構形改變，並且從而降低兩個靶標之間在結合抗體方面的競爭的可能性(通過使處於它們的結合態時兩個靶標之間可能的空間位阻最小)。我們還推斷，通過首先建立兩個合成抗體庫，其中每一個都處於緊密的(packed)異源二聚VH-VL配對的背景下，可以設計這類新的抗體分子，其中在一個抗體庫中可以使第一組(Libl)重鏈和輕鏈⑶R位置多樣化,並且在另一抗體庫中可以使不同的、不重疊的組(Lib2)的重鏈和輕鏈⑶R位置多樣化。我們得出，如果可以建立這樣的文庫，且針對兩個不相關的靶標成功地進行平行篩選，那麼通過將篩選過程中在Libl位置篩選出的針對第一靶標的特定殘基引入具有篩選過程中在Lib2位置篩選出的針對第二靶標的特定殘基的抗體克隆，可以潛在地快速產生雙特異性抗體。反之亦然，我們還得出，如果可以建立這樣的文庫，且針對兩個不同的靶標成功地進行篩選，那麼通過將篩選過程中在Lib2位置篩選出的針對第二靶標的特定殘基引入具有篩選過程中在Libl位置篩選出的針對第一靶標的特定殘基的抗體克隆，可以潛在地產生雙特異性抗體。我們推斷，通過在限定緊密的VH-VL配對的相同或高度相似的支架內建立這兩種文庫，會非常有助於將來自限定第一特異性的第一抗體的一組殘基引入第二特異性的第二抗體中。
[0128]在本發明中，我們證明我們已經成功地實施了本發明，產生了針對兩個完全不相關的靶標的幾種雙特異性異源二聚VH-VL抗體。重要的是，快速產生了該抗體且該抗體僅對兩個靶標具有高度特異性，這表明其並不與額外的不相關的靶標結合。驚人的是，所產生的雙特異性抗體不僅顯示高生物物理穩定性(其並沒有被通過輕鏈CDR環殘基與一個靶標結合且通過重鏈⑶R環殘基與另一靶標結合的抗體所證明)，而且，即使相比於產生的「二合一」抗體所使用的支架和相比於確立的作為市售藥物中活性成分的單特異性抗體克隆，也顯示出極其高的生物物理穩定性。最後，仍出人意料地，使用針對GM-CSF和TNF- α的雙特異性抗體的實例，我們能夠證明，提供參與TNF- α的結合的推定的互補位的Lib I結合區內CDR位置中的單一保守型點突變基本上廢除了與TNF-α的結合，同時保持與GM-CSF的結合完整；並且提供參與GM-CSF的結合的推定的互補位的Lib2結合區內⑶R位置中不同的單一保守型點突變基本上廢除了與GM-CSF的結合，同時保持與TNF-α的結合完整。這表明本發明的抗體的確可以高特異性結合兩個不相關的靶標，而不是通過一般的「粘貼」，並且與本領域已知的上述雙特異性抗體相反，設計為不重疊的互補位的兩個結合位點基本上獨立地起作用，儘管它們都位於一個異源二聚VH-VL可變區中且儘管它們都包含屬於同一異源二聚可變區的CDR殘基。因此本發明的抗體相比現有技術的雙特異性抗體具有主要優勢。
[0129]在本發明的優選實施方案中，優選的發現方法包括以下步驟:(1)基於相同或高度相似的異源二聚VH-VL抗體支架，通過使第一文庫和第二文庫中不同的CDR位置多樣化，來產生一對文庫；(2)任選地還包括使這兩個文庫的一個或兩個中的VH-VL支架中所選的框架位置多樣化，以潛在地提高從這兩個文庫篩選的克隆的結合特性；(3)針對兩個靶標分子或表位獨立地篩選這兩個文庫，並且表徵結合體以鑑定具有期望特性的靶標特異性抗體克隆或表位特異性抗體克隆；(4)將從一個文庫篩選的且對第一靶標或表位有特異性的抗體克隆中多樣化位置中篩選的所有殘基或殘基的子集(優選大多數殘基但不少於3個殘基)引入從另一文庫篩選的且對第二靶標或表位有特異性的靶標特異性抗體克隆中。為了以最佳方式實施該方法，一些關鍵殘基組起重要作用。
[0130]通過檢查計算模擬的異源二聚VH-VL抗體的分子模型且通過對沒有特異性的未經篩選的異源二聚VH-VL抗體「模擬物」進行誘變(數據未顯示)，我們得到可以潛在地被多樣化以形成針對第一靶標(Libl殘基)的第一潛在結合位點的一列CDR殘基，以及可以潛在地被多樣化以形成針對第二靶標(Lib2殘基)的第二潛在結合位點的一列CDR殘基。我們還得到，位於抗體框架區中的一列潛在的優化殘基，其在摺疊的抗體分子中非常靠近Libl或Lib2⑶R殘基，並且其可以潛在地被多樣化以改變特性且提高包含Libl⑶R殘基的第一互補位與第一靶標(LiblE優化殘基)的結合和提高包含Lib2CDR殘基的第二互補位與第二靶標(Lib2E優化殘基)的結合。最後，我們得到，優選將在兩個文庫中的保持相同或非常相似的一列CDR殘基，以維持兩個文庫中抗體分子的中央核心區緊密性不變(invariantpacking)，其還將存在於所有組合的雙特異性抗體克隆中，其包含一組靶標-1-特異性Libl與任選地包含LiblE殘基，以及一組靶標-2-特異性Lib2與任選地包含Lib2E殘基。我們得出，該緊密地不變的核心區將相互遮蔽兩個結合位點，使得針對第一靶標的第一互補位一定程度上免受由針對第二靶標的第二互補位的變化所引起的不利的構象影響。確實，我們已經能夠證明，通過來源於親本克隆的結合的雙特異性抗體克隆，使親本抗體克隆的親和力和結合動力學通常密切匹配。實施例8示出使用示例的抗原VEGF和IL6，其中具有38nM親和力的親本抗體IL6P與具有IlnM親和力的親本抗體VEGFP結合，以產生對IL6具有40nM親和力和對VEGF有7.8nM親和力的雙特異性抗體VH6L。這兩個結合位點的這種出奇高的獨立性水平使得對它們親和性成熟成為可能，並且同時在某種程度上對「二合一」抗體(以上的第三個以前的實例)或雙特異性配對單結構域異源二聚體(以上的第四個以前的實例)親和性成熟是不可能的。我們還得出，不變的核心區可以獲得兩個結合位點之間的間隔，這潛在地使它們能夠獨立地結合兩個靶標，而沒有由重疊互補位或由第一結合靶標和第二結合靶標之間的空間位阻引起的競爭。確實，使用示例的抗原GMCSF和IL6，我們已經能夠證明，對於本發明的新種類的雙特異性抗體分子，針對一些結合的克隆，兩個抗原與單個VH-VL可變區的共結合是可能的。而且，實施例9示出第二抗原與可變區共結合的親和力可以不依賴於第一抗原的存在或缺乏。對於其他類型的以前的雙特異性抗體而言，實現與同一 VH-VL可變區共結合的可能性和可能獨立的共結合親和力尚未得到證明，這代表了本發明的新抗體的獨特優勢。在一些新的雙特異性抗體中，可以通過實施例10列出的那些類似突變來進一步證明獨立的結合行為。在這樣的抗體中，可以通過在Libl位置進行點突變來打破或極大地降低對第一靶標的親和性，同時保持對第二靶標的親和性完整，反之亦然，通過在Lib2位置進行點突變打破或極大地降低對第二靶標的親和性，同時保持對第一靶標的親和性完整。
[0131]實施例1:文庫的構建
[0132]從GeneArt購得用於LiblDlLl和Lib DlHl文庫的合成基因庫，而從SloningBiotechnology購得用於D1L2和D1H2文庫的合成基因庫。將全部的四個文庫克隆到新構建的噬菌體展示載體，其是通以下方式由主幹PUC19構建的:將M13源、驅動抗體重鏈和輕鍊表達的兩個合成的核糖體結合位點以及編碼將驅動抗體多肽分泌的兩個信號肽的合成基因添加到大腸桿菌周質、人CHl和CK恆定結構域以及與人CHl恆定結構域C-末端融合的M13蛋白III的截短的C-末端部分。將文庫轉化至TGl大腸桿菌細胞以產生4個文庫，每一文庫都具有轉化的109種多樣性。通過(Barbas et al., Phage Display:ALaboratory Manual (卩遼菌體顯不:實驗室手冊),Cold Spring Harbour LaboratoryPress, 1st ed., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊),Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001)描述的使用 M13K07輔助噬菌體和標準的分子生物學方法，從轉化的TGl大腸桿菌細胞來產生作為噬菌體展示多樣化的Fab片段的文庫的四個文庫。
[0133]實施例2:淘選(Panning)
[0134] 按照標準的淘選過程(Barbaset al., Phage Display:A LaboratoryManual (卩遼菌體展不，實驗室手冊),Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1sted., 2001; Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:實驗室手冊)，Cold Spring Harbour Laboratory Press, 3rd ed.，2001),可以從卩遼菌體上-Fab 顆粒(Fab-on-phage particles)的文庫篩選針對固定的祀標MBP和GST的結合體。
[0135]實施例3:篩選
[0136]可以通過感染細菌宿主細胞來救援(rescued)實施例2淘選的噬菌體顆粒(Barbas et al., Phage Display:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour LaboratoryPress, 1st ed., 2001;Sambrook, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbour Laboratory Press, 3rd ed., 2001)。從各自的克隆中表達Fab蛋白，並測試其針對革巴標MPB和GST的特異性結合。下一步驟中使用陽性命中樣品(positive hits)來克隆雙特異性構建體。
[0137]實施例4:雙特異性抗體的克隆
[0138]基於所需的胺基酸序列設計抗體基因，並從GeneArt或DNA2.0購得合成基因或和合成基因片段。根據製造商的說明，通過PCR或重疊PCR使用聚合酶Pwo Master(從Roche購得)和編碼所需的點突變的合成寡核苷酸(從Thermo Fisher Scientific購得),來產生編碼具有點突變的抗體變體的基因。通過修飾從New England Biolabs購得的質粒pUC19來產生大腸桿菌Fab表達載體。通過將驅動抗體重鏈和輕鍊表達的兩個合成的核糖體結合位點、驅動抗體鏈分泌的兩個合成的信號肽序列添加到大腸桿菌周質和潛在地能產生單鏈的一個M13噬菌體來源中 ，來修飾pUC19主幹。根據製造商的說明，通過限制性酶切使用限制性內切酶(從Roche購得)將合成的抗體基因、合成的抗體基因片段和編碼點突變的PCR生成的抗體基因的變體克隆入該大腸桿菌Fab表達載體,之後使用LigaFast (從Promega購得)連接。將連接反應轉化至購自Stratagene或Zymoresearch的感受態TGl大腸桿菌細胞中。
[0139]實施例5:抗體的表達和純化
[0140]在補充有羧苄青黴素和葡萄糖(從VWR購得)的LB和TB固體和液體培養基(從CarlRoth購得)中生長具有Fab表達構建體的TGl大腸桿菌克隆。在震蕩培養箱中的錐形燒瓶中，使液體培養物進行抗體表達，過夜，並且通過向生長培養基中加入異丙基_β -D-硫代半乳糖苷(IPTG，從Carl Roth)進行誘導。通過對表達培養物的離心分離來澄清含有分泌的Fab片段的培養物上清液。為澄清的培養物上清液補充1%體積的鏈黴素/青黴素溶液(從PAA Laboratories購得)、2%體積的IM pH為8.0的三羥甲基氨基甲烷(從VWR購得)和0.4%體積的STREAMLINE r蛋白A樹脂(從GE Healthcare購得)。將補充後的培養物上清液在滾動培養箱中孵化3小時或過夜，以達到Fab片段與蛋白A樹脂的結合。然後將樹脂轉移到重力流柱，使用30柱床體積pH為7.4的2x PBS (從Invitrogen購得)洗滌一次，使用5柱床體積含有IOmM pH為6.8的三羥甲基氨基甲烷和IOOmM的NaCl的緩衝液(從VWR購得)洗滌一次，並使用含有IOmM pH為3的檸檬酸和IOOmM NaCl的緩衝液(從VffR購得)洗脫。通過加入8%體積的IM pH為8.0的三羥甲基氨基甲烷來中和洗脫的Fab片段。根據製造商的說明，使用NAP-5脫鹽柱(illustra NAP_5desalting columns,從GEHealthcare購得)將中和的純化Fab片段的緩衝液更換為純的Ix PBS pH7.4(含有1.06mMKH2PO4,2.97mM Na2HP04_7H20、155.17mM NaCl 且沒有其他的補充劑；Invitrogen catalogueN0.10010056)。
[0141]實施例6:抗體穩定性測定[0142]使用差示掃描量熱法(DSC)確定純化的緩衝液更換的Fab片段在pH為7.4的IxPBS(Invitrogen catalogue N0.10010056)中的生物物理穩定性。對於所有的測定，使用配備有自動進樣器且由VPViewer2000CapDSC軟體(來自MicroCal)控制的毛細管細胞微熱量計。掃描針對不含抗體的純緩衝液(lx PBS pH7.4; Invitrogen catalogue N0.10010056)的所有Fab片段。設定掃描參數以分析從32°C至105°C和115°C之間的溫度窗口，預掃描恆溫器2分鐘、後掃描恆溫器O分鐘，沒有收穫。將掃描率設定為250°C/h (小時)用於篩選應用，設定為60°C/h (小時)用於重新分析最穩定的結合突變體。採用篩選模式(掃描率為2500C /h(小時))比採用重新分析模式(掃描率為60°C /h(小時))確定的Fab片段的絕對的解鏈溫度高3.7V至4.5°C，但是採用兩種模式時克隆的排列是相同的。使用0rigin7.0軟體(來自MicroCal)在PBS基準減法(PBS reference subtraction)後確定Fab片段的解鏈溫度。
[0143]實施例7:抗體特異性測定
[0144]為了測定從Libl和Lib2文庫篩選的抗體針對一個靶標的特異性和所設計的雙特異性抗體與兩個靶標結合的特異性，使用標準化方法進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。簡言之，通過塗覆溶解在Ix PBS中的鏈黴親和素、結合PBS-T(0.3%TWeen-20溶解在Ix PBS中)中的20nM的生物素化的靶標(GST、MBP、HEL或VEGF)和用PBS-T中的5%的脫脂奶粉封阻，來製備Nunc Maxisorp孔板。在微量滴定板中加入作為可溶的Fab片段的表達抗體克隆的50 μ I大腸桿菌TGl培養物上清液，之後使用山羊抗-人K輕鏈多克隆抗體(σ)或對與可溶的Fab表達構建體中重鏈的C-末端融合的鏈球菌-1I標籤有特異性的小鼠抗鏈球菌標籤抗體(IBA)來檢測結合的Fab片段。使用HRP-標記的第三代抗體檢測第二抗體。使用TMB基質(KPL)進行ELISA,並且使用Victor板讀數器(Victor plate reader,從PerkinElmer購得)設定為450nm來量化信號。發現分泌到大腸桿菌培養物上清液的模擬物IFab沒有結合四個靶標中的任何一個，Fab LGl (已經從Lib DlLl篩選)僅結合GST，Fab HM2 (已經從Lib DlHl篩選)僅結合MBP，以及Fab DT3 (其組合存在於Fab LGl和HM2中的所有靶標特異性殘基)僅結合GST和MBP。沒有克隆結合對照靶標HEL或VEGF (圖5)。使用用於每一 Fab的兩個獨立的克隆加倍進行試驗。
[0145]實施例8:親本抗體和雙特異性抗體的親和力
[0146]篩選針對人VEGF(P^rotech產品目錄編號100-20)和人IL6 (P印rotech產品目錄編號200-06)的抗體文庫。在分離的親本抗體克隆中，將IL6P和VEGFP結合到雙特異性抗體克隆VH6L。圖4示出VH6L的序列，其示出在輕鏈的胺基酸4位的額外的點突變。為了評價親本抗體和雙特異性抗體的親和力，進行BiacoreTM分析從而分析IL6P、VH6L和VEGFP的結合行為。為此，使用胺結合將抗-輕鏈捕獲抗體固定在CM5晶片上，結果是12000RU。捕獲Fab片段至400-500RU的水平，並且使從O至450nM濃度系列的IL6和VEGF經過晶片。如圖7所示，克隆IL6P與IL6結合，但不與VEGF結合；克隆VEGFP與VEGF結合，但不與IL6結合，並且組合的克隆VH6L與IL6和VEGF都結合。如表1所示，親本抗體和雙特異性抗體對靶標的親和力類似。IL6P和VH6L的離解常數KD分別是38nM和40nM，並且VEGFP和VH6L的離解常數分別是IlnM和7.8nM。
[0147]表1.親和力測定
[0148]
【權利要求】
1.抗體或其功能片段，其包含由重鏈可變(VH)結構域和輕鏈可變(VL)結構域組成的至少一個可變結合結構域，其中所述結合結構域包含兩個不相關表位的兩個互補位，其中(i)每一所述互補位與其表位的結合併不阻止其他互補位與其各自表位同時結合，且其中(ii)兩個互補位均對包含來自至少一個VH⑶R的至少一個殘基和來自至少一個VL⑶R的至少一個殘基。
2.如權利要求1所述的抗體或其功能片段，其是雙特異性抗體。
3.如權利要求1或2所述的抗體或其功能片段，其中，其他條件相同時，同時存在兩個表位時每個互補位與其各自表位的結合量是缺少另一表位時達到的結合量的至少25%。
4.如權利要求3所述的抗體或其功能片段，其中所述結合量為至少50%，特別是至少75%，更特別是至少90%。
5.如權利要求1-4中任一項所述的抗體或其功能片段，其中所述第一互補位包含來自VL結構域的⑶Rl和⑶R3以及VH結構域的⑶2的殘基，且所述第二互補位包含來自VH結構域的⑶Rl和⑶R3以及VL結構域的⑶2的殘基。
6.如權利要求1-5中任一項所述的抗體或其功能片段，其是人的抗體或其功能片段。
7.如權利要求6所述的抗體或其功能片段，其基於人VH3家族重鏈序列和人VK 1族輕鏈序列。
8.如權利要求6所述的抗體或其功能片段，其基於人VH3家族重鏈序列和人Vλ 1族輕鏈。
9.如權利要求1-8中任一項所述的抗體或其功能片段，其中所述抗體或其功能片段選自單鏈Fv片段、Fab片段和IgG。
10.核酸序列，其編碼權利要求1-9任一項所述的抗體或其功能片段。
11.載體，其包含權利要求10所述的核酸序列。
12.宿主細胞，其包含權利要求10所述的核酸序列或權利要求11所述的載體。
13.產生權利要求1-9任一項所述的抗體或其功能片段的方法，包括以下步驟:在體外或由合適的宿主細胞表達權利要求10所述的核酸序列或權利要求11所述的載體，所述宿主細胞包括權利要求12所述的宿主細胞。
14.抗體或其功能片段的集合，其中所述集合包括抗體可變結構域序列的多樣化集合，其中(i)使來自Libl位置的至少3個⑶R殘基多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內，且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，且其中來自Lib2位置的殘基沒有被多樣化；或(ii)使來自Lib2位置的至少3個⑶R殘基多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內，且至少一個多樣化的位置位於VL結構域內，且其中來自Libl位置的殘基沒有被多樣化。
15.如權利要求14所述的抗體或其功能片段的集合，其中在情況(i)中，使所述VL結構域的CDRl和CDR2的和所述VH的CDR2中的每個的至少一個殘基多樣化，或者在情況(ii)中，使所述VH結構域的⑶Rl和⑶R2和所述VL的⑶R2中每個的至少一個殘基多樣化。
16.如權利要求14所述的抗體或其功能片段的集合，其中在情況(i)中，使所述可變結合結構域中的LiblE位置的至少一個殘基額外地多樣化，和/或其中在情況(ii)中，使所述可變結合結構域中的Lib2E位置的至少一個殘基額外地多樣化。
17.產生雙特異性抗體分子或其功能片段的方法，包括以下步驟:a.產生抗體分子或其功能片段的第一集合，每一所述抗體分子或其功能結合片段都包含異源二聚VH-VL可變區，其中在選自Libl組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化的殘基位於所述VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於所述VL結構域內，並且其中來自Lib2的殘基沒有被多樣化； b.從所述第一集合中篩選對第一靶標或表位有特異性的第一抗體分子或其功能片段； c.產生抗體分子或其功能片段的第二集合，每一所述抗體分子或其功能片段都包含異源二聚VH-VL可變結構域，其中在選自Lib2組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化的殘基位於所述VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於所述VL結構域內，並且其中來自Libl的殘基沒有被多樣化； d.從所述第二集合中篩選對第二靶標或表位有特異性的第二抗體分子或其功能片段；以及 e.產生編碼包含異源二聚VH-VL可變區的第三抗體分子或其功能片段的核酸序列，其中所述第三抗體分子或其功能片段包含所述第一抗體分子或其功能片段中Libl位置的組中存在的至少3個殘基， 其中至少一個殘基位於所述VH結構域內且至少一個殘基位於所述VL結構域內，並且其中所述第三抗體分子或其功能片段還包含所述第二抗體分子或其功能片段中Lib2位置的組中存在的至少3個殘基，其中至少一個殘基位於所述VH結構域內且至少一個殘基位於所述VL結構域內。
18.產生雙特異性抗體分子或其功能片段的方法，包括以下步驟: a.產生抗體分子或其功能片段的第一集合，每一所述抗體分子或其功能片段都包含異源二聚VH-VL可變區，其中在選自Libl組的至少3個⑶R位置具有多樣性，條件是至少一個多樣化的殘基位於所述VH結構域內且至少一個多樣化的位置位於所述VL結構域內，並且其中來自Lib2的殘基沒有被多樣化； b.從所述第一集合中篩選對第一靶標或表位有特異性的第一抗體分子或其功能片段； c.產生抗體分子或其功能片段的第二集合，每一所述抗體分子或其功能片段包含異源二聚VH-VL可變區，這通過以下方式進行:在選自Lib2組的至少3個⑶R位置引入多樣性使得所述第一抗體分子或其功能片段多樣化，條件是至少一個多樣化的殘基位於VH結構域內且至少一個多樣化的殘基位於VL結構域內，並且其中來自Libl的殘基沒有被多樣化； d.從所述第二集合中篩選對第二靶標或表位有特異性的第二抗體分子或其功能片段；以及 e.可選地，在具有以下修飾的情況下，實施步驟a至d，通過使選自Lib2組的至少3個⑶R位置多樣化來產生步驟a的所述第一集合，並在步驟c中，在選自Libl組的至少3個CDR位置使所述第一抗體分子或其抗體片段多樣化。
19.如權利要求17或18所述的方法，還包括以下步驟: f.在宿主細胞中表達步驟a至e中產生的所述核酸序列，或者將所述核酸翻譯成代表所述第三抗體分子或其功能片段的蛋白質。
20.如權利要求17-19任一項所述的方法，其中具有選自組Libl的多樣性的任何所述集合包括選自LiblE組的至少一個增強位置的額外的多樣性，和/或其中具有選自組Libl的多樣性的任何所述集合包括選自Lib2E組的至少一個增強位置的額外的多樣性。
21.根據權利要求17-20中任一項所述的方法，其中所述第一集合與選自LibDIL1、Lib D1L2和Lib D2L1的文庫相同，或者來源於具有Lib DlLULib D1L2或Lib D2L1中存在的多樣化位置且在框架區具有90%以上序列同一性、特別是95%以上序列同一性的這類文庫；並且其中所述第一集合與選自Lib DlHULib DlH2、Lib D1H3和Lib D2H1的文庫相同，或者來源於具有Lib DlHULib DlH2、Lib D1H3或Lib D2H1中存在多樣化位置且在框架區具有90%以上序列同一性、特別是95%以上序列同一性的這類文庫。
22.如權利要求17-21中任一項所述的方法，其中所述抗體分子或其功能片段選自單鏈Fv片段、Fab片段和IgG。
【文檔編號】C07K16/46GK103930445SQ201280037640
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年5月29日 優先權日:2011年5月27日
【發明者】羅蘭·貝克曼 申請人:杜塔裡公司