一種測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法
2023-10-18 00:29:04 1
一種測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法
【專利摘要】本發明公開一種測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，所述常用殺菌劑為霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈，包括以下步驟：提取菸草中的目標物、N-丙基乙二胺純化、標準儲備液和標準工作液的配製、超高效液相色譜-串聯質譜測定。本發明針對菸草中常施用的6種殺菌劑，利用超高效液相色譜-串聯質譜儀，同位素內標定量法，建立UPLC–MS/MS同時快速分析菸草中6種殺菌劑殘留的方法，與標準方法相比，合併了兩個標準方法的檢測指標，並加入了霜黴威，提高了方法的靈敏度，縮短了分析時間和檢測成本。
【專利說明】一種測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於農藥殘留檢測領域，涉及菸草中農藥殘留量檢測技術，特別涉及菸草 中常用殺菌劑殘留量的測定方法，具體是檢測菸草中霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟 靈和甲基硫菌靈的殘留量。
【背景技術】
[0002] 霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈都為是菸草生產上常用的 殺菌劑，能防治菸草葉、莖、根多種真菌病害，具有對高效、低毒，兼有保護和治療作用等特 點。除多菌靈外，其它5個指標均被列入《中國菸葉公司2013年度菸草上推薦使用農藥名 單》，在各個煙區都有施用。由於施用廣泛，殺菌劑在菸葉中較大殘留量會對吸菸者產生健 康風險，因此，這6個指標均被列入國際菸草科學研究合作中心（Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco，C0RESTA)2008 年提出對菸草中的 118 種農藥 指導性殘留限量名單。鑑於這些殺菌劑的施用廣泛性和潛在影響菸葉的安全性，快速、準確 的對其定量分析顯得較為重要。
[0003] 菸草常施用低毒類農藥有可能會超出指導限量，因此監測菸草常施用農藥的殘留 量尤為重要。菸葉農藥殘留量的分析方法主要有氣相色譜法（GC)、氣相色譜-串聯質譜法 (GC - MS/MS)和液相色譜-質譜法（LC - MS/MS)。2012年，楊飛等利用LC-MS/MS同時檢測 了菸草及菸草製品中6種殺菌劑，此方法選取基質分散固相萃取處理樣樣品。陳曉水等利 用GC-MS/MS同時測定了菸草中的氟節胺等132種農藥殘留，此方法適合於有機磷、有機氯 和菊酯類農藥的檢測。2011年，菸草行業制定一系列多農殘檢測標準，而這6種常用農藥分 列於兩個檢測標準，三種不同的檢測方法，這使得檢測過程較為複雜、繁瑣。
【發明內容】
[0004] 鑑於此，本發明目的在於提供一種快速、準確的菸草中常用殺菌劑殘留量的測定 方法，該方法可同時測定菸草中霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈的殘 留量。
[0005] 為解決以上技術問題，本發明提供的技術方案是，提供一種測定菸草中常用殺菌 劑殘留量的方法，所述常用殺菌劑為霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌 靈，包括以下步驟： (1) 提取菸草中的目標物： 稱取烘乾磨好的菸葉樣品，加入純水浸潤，依次加入氘代內標和乙腈，渦漩混合振蕩； 放入冰箱冷凍後取出，依次加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，渦旋振蕩 後離心； (2) N-丙基乙二胺（PSA)純化： 移取上清液於新的離心管中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑，於漩渦振蕩混合，然後高 速離心；吸取上清液經有機相濾膜過濾，移取濾液，並用超純水稀釋後待測； (3) 標準儲備液和標準工作液的配製： 用乙腈配製霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈標準儲備液，儲存於 棕色玻璃瓶中，-20°C保存；取一定量的各化合物儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，製得 5 μ g/mL混合標準儲備液； 用乙腈準確配製多菌靈-d4和甲基硫菌靈-d6氘帶內標標準儲備液，儲存於棕色玻璃 瓶中，-20°C保存；取一定量的各內標儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，製得10 μ g/mL混 合內標標準儲備液；所有的儲備液於_2〇°C保存，使用前將其恢復到室溫； 用空白菸葉的萃取基質配製不同濃度的霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲 基硫菌靈標準工作溶液； (4) 超高效液相色譜-串聯質譜測定： 吸取空白菸葉溶液和配製好的不同濃度的霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和 甲基硫菌靈標準工作溶液，注入串聯質譜檢測器，按內標法以峰面積計算出樣品待測液中 霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻癌靈和甲基硫菌靈含量； 選取90%流動相A和10%流動相B為初始流動相體系，分析時間為12min，進樣量為 10 μ L ;所述流動相A是體積分數為0. 1%的甲酸水，流動相B是體積分數為0. 1%的甲酸甲 醇； 前述串聯質譜檢測器採用UPLC-MS/MS系統，選取的色譜柱為UPLC色譜柱：UPLCHSST3， 規格為IOOmmX 2. 1mm、1.8 μ m，柱溫35° C，進樣量1〇μ?;串聯質譜檢測的條件為：電噴霧 離子源，噴霧電壓（IS):2.6kV ;離子化溫度350°C;霧化氣流量：1000L/Hr;錐孔氣流量50L/ Hr ;碰撞氣流量為0. 15ml/min ;碰撞氣為氦氣，其餘氣體為氮氣；駐留時間為30msec，正離 子MRM模式採集。
[0006] 優選地，步驟（1)中，提取過程依次加入的超純水、10 μ g/mL的氘代內標，乙腈的 體積分別為10mL、20yL、10mL。
[0007] 優選地，步驟（1)中，速率渦旋振蕩時長lmin，振蕩的速率為2000rpm。
[0008] 優選地，步驟（1)中，離心管在-KTC條件下保持lOmin。
[0009] 優選地，步驟（1)中，依次加入的無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉的 質量分別為4g、lg、lg和0.5g。
[0010] 優選地，步驟（1)中，漩渦混合振蕩的速率為2000rpm，振蕩時間為2min，離心 IOmiru離心速率為4000rpm。
[0011] 優選地，步驟（2)中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑的質量為150mg和25mg。
[0012] 優選地，步驟（2)中，移取濾液體積為200 μ L，加入超純水定容到lmL。
[0013] 優選地，步驟（4)中，色譜柱採用梯度洗脫，條件為：(T2min，90%A?50%A ; 2?2.4min，50%A?30%Α ;2·4?4.Omin，30%A?20%Α ;4·0?6·Omin，20%A?5%Α，6· 0?9· 8min， 5%A?5%A ;9· 8?10. 0min，5%A?90%A，10. 0?12· 0min，90%A?90%A ;流動相流速為 0· 3mL/min。
[0014] 優選地，所述步驟（4)中，測定菸草中霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲 基硫菌靈含量的具體操作為：吸取標準空白菸草和配製好的不同濃度的霜黴威、多菌靈、惡 霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈標準工作溶液，注入UPLC-MS/MS系統，繪製霜黴威、多 菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈的線性回歸方程，對純化稀釋後的樣品待測液 進行測定，測得分析物與內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分 析物的含量。
[0015] 本發明克服了現有技術樣品處理方法的不足，針對菸草樣本優化了提取、淨化條 件，選擇了 UPLC-MS/MS，並對UPLC-MS/MS的相關檢測條件進行了優化，主要優化了離子源 條件，色譜柱以及流動相體系。與現有技術相比，上述技術方案中的一個技術方案具有如下 優點： 1、本發明針對菸草中常施用的6種殺菌劑，利用超高效液相色譜-串聯質譜儀，同位素 內標定量法，建立UPLC - MS/MS同時快速分析菸草中霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟 靈和甲基硫菌靈等農藥殘留的方法，與標準方法相比，合併了兩個標準方法的檢測指標，並 加入了霜黴威，提高了方法的靈敏度，縮短了分析時間和檢測成本。與報導的LC-MS/MS方 法相比，應用氘代內標定量，有效降低基質效應，提高了檢測準確性；應用了小粒徑UPLC色 譜柱，提高分離能力，節省分析時間。
[0016] 2、與傳統的氣相色譜比較，採用基質分散固相萃取法來檢測霜黴威、多菌靈、惡霜 靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈。簡化了前處理過程，提高了分析靈敏度。
[0017] 3、由於選取了超高效液相色譜柱，使得柱子的分離度明顯提高，分析時間顯著縮 短。串聯質譜的使用使得方法的選擇性和靈敏度提高，更有利於低含量的殺菌劑殘留的測 定。
[0018] 4、選取了 2個化合物的氣代標準品對霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻癌靈和 甲基硫菌靈進行定量，使得方法的準確性更高，有效消除基質幹擾和前處理過程中引起的 誤差。
[0019] 5、本方法具有操作簡便、快速、準確、靈敏度及重複性好的優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為霜黴威的選擇離子流色譜圖。
[0021] 圖2為多菌靈的選擇離子流色譜圖。
[0022] 圖3為多菌靈氘代內標的選擇離子流色譜圖。
[0023] 圖4為惡霜靈的選擇離子流色譜圖。
[0024] 圖5為甲霜靈的選擇離子流色譜圖。
[0025] 圖6為稻瘟靈的選擇離子流色譜圖。
[0026] 圖7為甲基硫菌靈的選擇離子流色譜圖。
[0027] 圖8為甲基硫菌靈氘代內標的選擇離子流色譜圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合一個具體實施例進行說明。
[0029] 本發明依次採用超純水浸潤樣品，乙腈萃取分析物，N-丙基乙二胺（PSA)淨化樣 品，超高效液相色譜-串聯質譜儀等步驟進行測定，可快速、準確、同時檢測出菸草中霜黴 威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻癌靈和甲基硫菌靈的殘留含量。
[0030] 實驗例1 1.儀器與試劑：Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯質譜儀（美國Waters公司）， 配備電噴霧電離源（ESI);VtexMixer 230VeU振蕩器(美國Labnet公司）；Sigma3K15離 心機（德國Sigma公司）。
[0031] 甲酸為HPLC級（濃度為49-51%，德國Sigma公司）；乙腈、甲醇均為色譜純(美國 Thermo-Fisher公司）;霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻癌靈和甲基硫菌靈標準品來自於 Labor Dr. Ehrenstorfer-Schafers(化學純度：98· 5%，Augsburg，德國），內標多菌靈 _d4 來 自於加拿大TRC (化學純度：98%，同位素純度：98. 9%和99. 2%，多倫多，加拿大)，甲基硫菌 靈 _d6 購自⑶N Isotopes Inc.(化學純度：98%，同位素純度：99· 9%，Quebec Canada)。試 齊抱和N-丙基乙二胺（PSA)購自安捷倫公司（美國），水為超純水。N-丙基乙二胺（PSA)吸 附劑、末尾封端碳18 (C18E)吸附劑，水為超純水。
[0032] 2.提取菸草中的分析物 準確稱取2. OOg樣品於50mL具蓋離心管中，加入IOmL水，振蕩直至樣品被水充分浸 潤。冷凍IOmin後移取IOmL乙腈至離心管中，然後將離心管置於渦漩混合振蕩儀上，以 2000rpm速率振蕩lmin。將離心管置於0°C條件下保持lOmin，然後向離心管中加入4g無 水硫酸鎂和Ig氯化鈉，Ig檸檬酸鈉和〇. 5g檸檬酸二氫鈉，立即於漩渦混合振蕩儀上，以 2000rpm速率振蕩2min，然後以4000rpm速率離心lOmin。
[0033] 3. PSA 純化 移取上清液I. OmL於I. 5mL離心管中，加入150mg無水硫酸鎂及25mgPSA吸附劑，於 漩渦混合振蕩儀上以2000rpm速率振蕩2min，以6000rpm速率離心2min。吸取上清液經 0. 22 μ m有機相濾膜過濾，移取200 μ L，用超純水稀釋至I. OmL，待測。
[0034] 4液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS)測定 (I) UPLC-MS/MS 條件： 色譜條件：Atiantis UPLC HSS T3 (IOOmmX 2. 1mm，1.8 μ m，美國 Waters 公司）；流動 相A :0. 1%甲酸水溶液(體積分數)，流動相B :0. 1%甲酸甲醇溶液(體積分數）；流速0. 3mL/ min ;柱溫 35° C ;進樣量 1〇μ?。梯度洗脫條件：(T2min，90%A?50%A ;2?2. 4min，50%A?30%A ; 2· 4?4. Omin，30%A?20%Α ;4· 0?6· Omin，20%A?5%Α ;6· (T9. 8min，5%A?5%Α ;9· 8?10. Omin， 5%A?90%A ;10· 0?12· 0min，90%A?90%A。
[0035] 質譜條件；電噴霧離子源，噴霧電壓（IS) :2. 6kV ;離子化溫度350°C ;霧化氣流量： 1000L/Hr;錐孔氣（cone)流量50L/Hr;碰撞氣流量為0. 15ml/min;碰撞氣為氬氣，其餘 氣體為氮氣；駐留時間為30msec，正離子MRM模式採集，監測離子對及其相應的碰撞能量 (CE)見表1。圖1至圖8是各殺菌劑的離子流色譜圖。
[0036] 表1多反應監測模式下6種殺菌劑及其氘代內標的部分質譜參數
【權利要求】
1. 一種測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，所述常用殺菌劑為霜黴威、多菌靈、惡霜 靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈，其特徵在於，包括以下步驟： (1) 提取菸草中的目標物： 稱取烘乾磨好的菸葉樣品，加入純水浸潤，依次加入氘代內標和乙腈，渦漩混合振蕩； 放入冰箱冷凍後取出，依次加入無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉，渦旋振蕩 後離心； (2) N-丙基乙二胺純化： 移取上清液於新的離心管中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑，於漩渦振蕩混合，然後高 速離心；吸取上清液經有機相濾膜過濾，移取濾液，並用超純水稀釋後待測； (3) 標準儲備液和標準工作液的配製： 用乙腈配製霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈標準儲備液，儲存於 棕色玻璃瓶中，-20°C保存；取一定量的各化合物儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，製得 5 ii g/mL混合標準儲備液； 用乙腈準確配製多菌靈-d4和甲基硫菌靈-d6氘帶內標標準儲備液，儲存於棕色玻璃瓶 中，-20°C保存；取一定量的各內標儲備液進行混合，用乙腈稀釋定容，製得10y g/mL混合 內標標準儲備液；所有的儲備液於-20°C保持，使用前將其恢復到室溫； 用空白菸葉的萃取基質配製不同濃度的霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲 基硫菌靈標準工作溶液； (4) 超高效液相色譜-串聯質譜測定： 吸取空白菸葉溶液和配製好的不同濃度的霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和 甲基硫菌靈標準工作溶液，注入串聯質譜檢測器，按內標法以峰面積計算出樣品待測液中 霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻癌靈和甲基硫菌靈含量； 選取90%流動相A和10%流動相B為初始流動相體系，分析時間為12min，進樣量為 10 U L ;所述流動相A是體積分數為0. 1%的甲酸水，流動相B是體積分數為0. 1%的甲酸甲 醇； 前述串聯質譜檢測器採用UPLC-MS/MS系統，選取的色譜柱為UPLC色譜柱：UPLCHSST3， 規格為1〇〇_1\2.1111111、1.811111，柱溫35°(：，進樣量10此；串聯質譜檢測的條件為 ：電噴霧 離子源，噴霧電壓（IS):2. 6kV ;離子化溫度350°C;霧化氣流量：1000L/Hr;錐孔氣流量50L/ Hr ;碰撞氣流量為0. 15ml/min ;碰撞氣為氦氣，其餘氣體為氮氣；駐留時間為30msec，正離 子MRM模式採集。
2. 根據權利要求1所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（1) 中，提取過程依次加入的超純水、10U g/mL的氘代內標，乙腈的體積分別為10mL、20ii L、 10mL〇
3. 根據權利要求2所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（1) 中，速率渦旋振蕩時長lmin，振蕩的速率為2000rpm。
4. 根據權利要求3所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（1) 中，離心管在-l〇°C條件下保持lOmin。
5. 根據權利要求4所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（1) 中，依次加入的無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸二氫鈉的質量分別為4g、lg、lg和 0? 5g〇
6. 根據權利要求5所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（1) 中，漩渦混合振蕩的速率為2000rpm，振蕩時間為2min，離心lOmin、離心速率為4000rpm。
7. 根據權利要求1所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（2) 中，加入無水硫酸鎂及PSA吸附劑的質量分別為150mg和25mg。
8. 根據權利要求7所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（2) 中，移取濾液體積為200 ii L，加入超純水定容到lmL。
9. 根據權利要求1所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，步驟（4) 中，色譜柱採用梯度洗脫，條件為：〇?2min，90%A?50%A ;2?2. 4min，50%A?30%A ;2. 4?4. Omin， 30%A?20%A ;4.0?6.Omin，20%A?5%A，6. 0?9. 8min，5%A?5%A ;9.8?10.Omin，5%A?90%A， 10. 0?12. 0min，90%A?90%A ;流動相流速為 0? 3mL/min。
10. 根據權利要求1所述的測定菸草中常用殺菌劑殘留量的方法，其特徵在於，所述步 驟（4)中，測定菸草中霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和甲基硫菌靈含量的具體操 作為：吸取標準空白菸草和配製好的不同濃度的霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻瘟靈和 甲基硫菌靈標準工作溶液，注入UPLC-MS/MS系統，繪製霜黴威、多菌靈、惡霜靈、甲霜靈、稻 瘟靈和甲基硫菌靈的線性回歸方程，對純化稀釋後的樣品待測液進行測定，測得分析物與 內標峰面積的比值，代入一元線性回歸方程，求得樣品待測液中分析物的含量。
【文檔編號】G01N30/06GK104391068SQ201410612516
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月5日 優先權日:2014年11月5日
【發明者】陶曉秋, 熊巍, 龐夙, 韶濟民, 黃玫 申請人:中國菸草總公司四川省公司