一種採用微流控晶片構建三維神經網絡的裝置及其製備和使用方法
2023-10-18 01:25:34 1
一種採用微流控晶片構建三維神經網絡的裝置及其製備和使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種採用微流控晶片構建三維神經網絡的裝置及其製備和使用方法。所述裝置包括微流控晶片、用於黏附神經細胞的微球和基底，其中所述微流控晶片包括一層或多層PDMS彈性層並具有通孔，所述PDMS彈性層具有供神經細胞突起延伸的微流管道，所述通孔與基底形成用於容納微球的小室。本發明的裝置製備簡單，使用其形成的神經網絡具有多級結構、高度有序且相互連通的特徵，較現有方法更接近體內真實情況，且細胞觀察方便。
【專利說明】一種採用微流控晶片構建三維神經網絡的裝置及其製備和使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫學領域，更具體地涉及在體外構建三維神經網絡模型的方法。
【背景技術】
[0002]在具有神經系統的生物體內，各器官、系統的功能和各種生理過程都在神經系統的直接或間接調節控制下，互相聯繫、相互影響、密切配合成為一個完整統一的有機體，實現和維持正常的生命活動。此外，神經系統還要對體內各種功能不斷進行迅速而完善的調整從而使生物體適應體內外環境的變化。因此，神經系統是生物體內起主導作用的重要功能調節系統。在高等動物，尤其是在哺乳動物中，神經系統是一個由成千上萬個神經細胞相互連接形成的多級三維網絡，對其組織結構和工作原理的研究對於生物學、醫學、藥學、組織工程學等來說都非常重要。目前存在的體外神經網絡的構建方法包括神經細胞的有序圖案化和神經突的可控誘導。
[0003]微流控技術已發展為研究細胞生物學的有用工具，其可以精確的控制、監控和操縱細胞外微環境，從而實現神經細胞在二維平面上的圖案化以及神經突的誘導。
[0004]中國發明專利(CN101748061A)公開了一種建立神經細胞之間單細胞水平連接的裝置和生長連接方法，在覆有促神經細胞黏附的蛋白質條帶的基底上放置具有微凹槽單元的聚二甲基矽氧烷(PDMS)印章，將神經細胞送入微凹槽單元並黏附在蛋白質條帶上，其突起則沿蛋白條帶定向生長而不發生分支，從而獲得神經細胞單細胞水平的單線連接。
[0005]Nature Methods (NATURE METHODS, AUGUST2005, VOL.2N0.8，599)曾報導過利用微流控裝置長期培養和局限原代中樞神經細胞。所用的微流控裝置由PDMS晶片和玻璃片基底組成，構建了兩個細胞培養區域以及連接它們的微槽。將神經細胞種在其中一個區域後，由於微槽的局限性，只有神經軸突會伸展到另一個區域中，這種裝置可以用於構建中樞神經軸突損傷和再生模型。這項技術可以在二維的平面可控誘導神經突的連接，但這並不能真實反應體內神經網絡的組織和功能。因為真實的神經網絡不可能是二維的，而是在三維空間存在的。
[0006]目前已有的在體外構建三維神經網絡的方法有利用direct-write assembly技術製備的光聚合水凝膠三維支架，神經細胞在這種支架內形成分支網絡(Adv.Funct.Mater.2011，21，47 - 54)。還有使用矽硼玻璃微球自組裝的基底支持神經細胞生長的技術(Ehud Y Isacoff, NATURE METHODS，AUGUST2008，VOL.5N0.8，735)，可形成三維的毫米級神經網絡，為了提高神經細胞在矽硼玻璃微球上的黏附性，在其表面包覆了一層多聚賴氨酸。雖然這樣可以在一定程度上模擬體內三維神經網絡的構成，但這只是低級別的神經網絡，網絡結構不可控且細胞類型分布相對雜亂，而體內真實的神經網絡是多級別的，且不同級別的網絡上具有特定的細胞亞型，由低級別的神經網絡按照高度有序的模式相互連接組成，並且具有標誌性的軸突樹突極化、興奮性抑制性分化以及突觸發生，同時不同級別的網絡上都可測得明顯的神經活動。
[0007]因此，本領域中需要可以在體外構建具有多級結構的、高度有序且相互連通的三維神經網絡的裝置，其可實現體外神經網絡結構與功能的高度統一，最大可能的模擬體內神經網絡的真實組織構成。
【發明內容】
[0008]本發明提供一種體外培養三維神經網絡的裝置及其製備方法，並利用這種裝置構建具有良好的結構和功能發育的三維神經網絡，可以檢測到神經網絡中具有標誌性的軸突樹突極化、興奮性抑制性分化以及突觸發生，而且可在不同級別的網絡上都測得明顯的神經活動，同時提出了在神經組織工程、腦機接口、藥物篩選平臺構建上的可能應用。
[0009]本發明的技術方案如下:
[0010]在本發明的第一方面，提供了一種體外培養三維神經網絡的裝置，所述裝置包括微流控晶片、用於黏附神經細胞的微球和基底，其中所述微流控晶片包括一層或多層PDMS彈性層並具有通孔，所述PDMS彈性層具有供神經細胞突起延伸的微流管道，所述通孔與基底形成用於容納微球的小室；所述微球優選為均一直徑；所述小室優選為圓形、長方形或串珠形；以及所述基底優選為玻璃基底、PDMS基底或聚苯乙烯基底。
[0011]在本發明的裝置中，所述微球的直徑可以為30-140微米，優選為40-100微米，更優選為40-70微米。
[0012]在本發明的裝置中，所述微球是矽硼玻璃微球和水凝膠微球中的任意一種。
[0013]在本發明的裝置中，所述通孔橫截面的邊長或直徑為微球直徑的100-102倍，優選20-80倍，更優選40-60倍；
[0014]在本發明的裝置中，所述微流管道高度可以為3微米-10微米，優選為4-8微米，最優選為5微米。
[0015]在本發明的裝置中，所述微流管道寬度優選為5-50微米，更優選為10-40微米，最優選為20-30微米。
[0016]在本發明的裝置中，當採用多層PDMS彈性層時，下層PDMS彈性層的厚度為40-80微米，優選50-70微米，更優選60微米，且總厚度為200微米至3毫米，優選為500微米至2.5毫米，更優選為I毫米至1.5毫米；在一些實施方案中，總厚度可以為500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、I毫米、1.1毫米、1.2毫米、1.3毫米、1.4毫米、1.5毫米、
1.6毫米、1.7毫米、1.8毫米、1.9毫米、2.0毫米、2.1毫米、2.2毫米、2.3毫米、2.4毫米、
2.5暈米、2.6暈米、2.7暈米、2.8暈米、2.9暈米或3.0暈米。
[0017]在本發明的裝置中，當採用單層PDMS彈性層時，厚度為150微米至3毫米，優選為500微米至2.5毫米，更優選為I毫米至1.5毫米；在一些實施方案中，厚度可以為150微米、200微米、250微米、300微米、350微米、400微米、450微米、500微米、600微米、700微米、800微米、900微米、I毫米、1.1毫米、1.2毫米、1.3毫米、1.4毫米、1.5毫米、1.6毫米、
1.7暈米、1.8暈米、1.9暈米、2.0暈米、2.1暈米、2.2暈米、2.3暈米、2.4暈米、2.5暈米、
2.6毫米、2.7毫米、2.8毫米、2.9毫米或3.0毫米
[0018]在第二方面，本發明提供了根據第一方面所述的裝置的製備方法，其特徵在於，所述方法包括(a)經光刻方法得到模板，用PDMS對模板上的圖案進行翻模，得到具有微流管道的所述PDMS彈性層；(b)任選地，將多層所述PDMS彈性層同向疊合，通過氧等離子體處理使相鄰兩層之間鍵合，並使相鄰兩層中所述微流管道的方向成30?90度夾角，優選為90度夾角；(c)在所述PDMS彈性層上打通孔；和((1)將所述PDMS彈性層有圖案的一面與基底貼合，通孔與基底形成所述小室。
[0019]其中同向是指每層PDMS彈性層上有圖案的一面均朝向同一方向。
[0020]在第三方面，本發明提供了根據第一方面所述的裝置的使用方法，其特徵在於，所述方法包括微球的自組裝、將神經細胞種植在所述微球的表面和將黏附有神經細胞的微球放入小室中進行培養。
[0021]優選地，為了保證微球和神經細胞組成的結構的穩定性，在種植神經細胞之前先種植膠質細胞，提高神經細胞的黏附性。
[0022]優選地，種植在所述微球的表面的神經細胞為原代神經細胞
[0023]在第四方面，本發明提供了根據第一方面所述的裝置在神經細胞和分子生物學、神經組織工程、腦機接口和藥物篩選中的應用。
[0024]有益效果:
[0025](I)本發明的裝置製備和使用方法都簡單易行，便於推廣應用。
[0026](2)採用本發明的裝置形成的三維神經網絡具有多級結構、高度有序且相互連通的特徵，並且形成了標誌性的軸突樹突極化、興奮性抑制性分化以及突觸發生，並且在較低級別的自組裝三維網絡中和有序連接的高級別神經網絡中均測得明顯的神經活動。
[0027](3)採用本發明的裝置形成的神經網絡較現有方法更接近體內真實情況，且細胞觀察方便。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1顯示矽硼玻璃微球的自組裝以及神經細胞在矽硼玻璃上生長。圖1A是矽硼玻璃微球自組裝過程的示意圖。圖1B-1E是神經細胞在矽硼玻璃微球上粘附並生長的掃描電鏡照片。
[0029]圖2顯示在自組裝的矽硼玻璃微球支架上形成三維神經網絡及三維神經網絡中的功能分化。圖2A是支架上生長的三維神經網絡的螢光照片。圖2B是三維神經網絡中神經細胞興奮性和抑制性功能分化的統計圖。
[0030]圖3顯示膠質細胞包裹的水凝膠微球自組裝支架上，生成三維神經網絡。
[0031]圖4顯示本發明的裝置中微流控小室的幾何限制幫助矽硼玻璃微球支架的組裝，以及微流控晶片引導下的兩個小室中三維神經網絡間的有序連接以及多級別神經網絡在晶片中生長。圖4A是微流控晶片引導下，兩個小室中分別組裝成有序三維神經網絡，並在兩者間生成有序連接的示意圖。圖4B是在微流控晶片中生成的多級別三維神經網絡的螢光照片。圖4C是一個小室中的三維神經網絡向另一個小室中伸出突起以形成連接的螢光照片。
[0032]圖5顯示本發明的裝置的製備過程以及採用本發明的裝置所製備的多級三維神經網絡中多層、多方向的相互連接。圖5A是多層微流控晶片製備過程的示意圖。圖5B是在本發明裝置中多級三維神經網絡多層、多方向連接的螢光照片。
[0033]圖6顯示本發明的裝置中，微流控晶片兩個小室內三維支架上生長的神經網絡可進行鈣信號測量的實例。圖6A是鈣信號螢光序列中的一幀照片。圖6B是圖6A中9號和12號神經細胞鈣信號的序列。圖6C是圖6A中所有神經細胞兩兩之間在時域上的相關係數矩陣。圖6D是圖6A中所有神經細胞兩兩之間的歸一化距離矩陣。
【具體實施方式】
[0034]下面結合附圖並通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。
[0035]實施例1原代神經細胞和膠質細胞的獲取和培養
[0036](一)原代神經細胞
[0037]1.分離全腦。取懷孕16-18天的SD大鼠的胚胎。用眼科鑷剝除胎鼠頭部皮膚和頭蓋軟骨，取出全腦，置於解剖液中。解剖液為無I丐、鎂的hanks緩衝液,提前置於冰上預冷。
[0038]2.分離特定組織，如大腦皮層或海馬組織。於解剖鏡下用尖頭鑷劃斷大腦兩個半球間的胼胝體，去除蛛網膜。若需分離大腦皮層，則將兩個大腦半球的皮層部分剝離，置於冰上的解剖液中。若需分離取海馬組織，則在去除蛛網膜後，將兩個大腦半球內的海馬分別剝離，置於冰上的解剖液中。
[0039]3.消化。用眼科剪將取出的步驟2中取出的組織剪碎，加入不含酚紅的胰蛋白酶，在37°C水浴消化15分鐘，以破壞細胞之間的連接。胰蛋白酶溶液工作濃度為0.25%。
[0040]4.製備細胞懸液。消化結束後,用預熱的含血清的種植液終止消化。種植液為DMEM/F12培養基混合10%胎牛血清。用種植液洗2_3遍，以徹底去除胰酶。用移液器吹打，使細胞成為較為均勻的懸液。
[0041]5.離心。將細胞懸液靜置約2分鐘，使未能消化完全的細小組織塊沉澱。取上層細胞懸液離心3分鐘，轉速為1300轉/分鐘。
[0042]6.重懸。棄上清液，加入適量種植液，用移液器吹打均勻，得到的細胞懸液可用於原代神經細胞培養。
[0043]7.培養。置於37°C, 5% 二氧化碳的無菌培養箱中培養。在顯微鏡下觀察,待細胞貼壁後，將種植液置換為預熱的培養液。培養液為neurobasal培養基混合2%B27因子和l%GlutaMAX-l。長期培養時，每3天用預熱的培養液半量換液一次。
[0044](二)原代星形膠質細胞
[0045]1.細胞懸液製備。取出生第二天的SD大鼠，參照「原代神經細胞」1-4步。得到較為均勻的細胞懸液。其中第2步中分離的組織為大腦皮層。
[0046]2.過濾、離心。將細胞懸液靜置約2分鐘，使未能消化完全的細小組織塊沉澱。取上層細胞懸液，用200目的濾網過濾，過濾後得到的細胞懸液離心2分鐘，轉速為1100轉/分鐘。
[0047]3.重懸。棄上清液，加入適量種植液，用移液器吹打均勻，得到的細胞懸液加入六孔板中，置於37°C, 5% 二氧化碳的無菌培養箱中培養。
[0048]4.梯度貼壁。將六孔板中的細胞懸液移入另一個六孔板中,六孔板提前用多聚賴氨酸孵育兩小時以上。注意避免絮狀物。
[0049]5.純化。24小時後，給六孔板中的細胞換液。之後每3天換一次液。待細胞在六孔板底面基本鋪滿後，將胰酶加入孔板，然後迅速吸出，以除去部分混雜的神經細胞。待細胞重新貼壁後，將六孔板置於37°C搖床震蕩10小時，轉速為220轉/分鐘，之後迅速換液，可除去神經細胞和少突膠質細胞。重複搖床處理步驟至六孔板中只剩下星形膠質細胞。
[0050]6.種植。純化後的細胞，需使用時，用預熱的磷酸鹽緩衝液洗一遍，加入預熱的胰酶於37°C下消化5分鐘，加入種植液終止消化。用移液器將孔板中的細胞吹打均勻，將細胞懸液收集至離心管中離心2分鐘，轉速為1100轉/分鐘。棄上清，加入適量種植液吹打均勻，所得細胞懸液即可用於原代星形膠質細胞種植。
[0051]7.培養。純化後的細胞或種植後的細胞需長期培養時，每3天用預熱的種植液換一次液。
[0052]實施例2玻璃微球的自組裝以及細胞的種植
[0053]微球的自組裝
[0054]將微球的懸浮液滴在玻璃片的表面，微球在重力驅動下從基底開始組裝，組裝滿底層後再逐層組裝上層，通過對基底大小和微球總體積的計算，可以調控組裝的層數(見圖1A)。
[0055]具體為:
[0056]I玻璃微球的前處理:將63微米矽硼玻璃微球(MO-SCI Specialty Products)放到75%的乙醇溶液中過夜滅菌，並用蒸餾水洗滌三次除去乙醇。然後將微球放入多聚賴氨酸(PDL)溶液中孵育過夜，用蒸餾水洗滌三次備用。
[0057]其中，上述矽硼玻璃微球的直徑也可以是45微米、90微米、125微米。
[0058]2用吸管將玻璃微球的PDL懸浮液滴在玻璃片上，微球在重力驅動下從基底開始組裝，成為緊緻的單層結構。將原代星形膠質細胞或神經細胞懸液種植於微球的單層組裝結構上。
[0059]3.粘附細胞的微球的組裝。待細胞貼壁後將粘附了細胞的微球收集，重新撒在具有幾何限制的微流控晶片的小室中，使微球攜帶細胞形成三維自組裝結構。通過調控微球的數量來控制三維結構的層數。
[0060]其中，上述幾何限制的微流控晶片的小室形狀可以是圓形、長方形、串珠形其中任意一種。幾何限制的邊長或直徑應在微球直徑的100-102倍之間，對於微球形成規則的組裝結構最為有效，若該尺寸恰為微球直徑的整數倍，則理論上可實現完美組裝。
[0061]4.載有細胞的三維結構的長期培養。根據細胞的不同種類，參照原代細胞培養的條件選擇培養基和換液。
[0062]實施例3水凝膠微球的自組裝及細胞的種植(見圖3 )
[0063]實驗步驟參照實施例2。水凝膠微球可購買商品化產品。也可由微流控晶片製備，具體方法可參照[Lab on a Chip, 2008, 8, 2, 198-220.] 0其尺寸範圍參照實施例2。區別在於第一步:滅菌的酒精劑量需增大，防止在水凝膠微球中含水量較高的影響下，低於有效滅菌濃度範圍。酒精滅菌後水洗時間每遍延長至I小時以上，保證水凝膠內的酒精充分擴散出來。多聚賴氨酸孵育後種植細胞前，用種植液孵育5小時以上並更換一次種植液,保證水凝膠內的液體為適於細胞生存的滲透壓。
[0064]圖3顯示水凝膠微球支架上形成的三維神經網絡的螢光照片。水凝膠微球自組裝形成三維支架後，在支架表面種植一層原代膠質細胞，待膠質細胞生長至包裹大部分支架表面後，種植神經細胞，並培養至形成三維神經網絡。GFAP為膠質細胞特異性抗體，Tujl為神經細胞特異性抗體。
[0065]實施例4
[0066]單層微通道連接的神經網絡
[0067]I微流控晶片的製備
[0068]I)聚二甲基矽氧烷晶片模板的製備，主要過程為光刻，即利用光刻膠在紫外線照射下可改變性質的特點製作與設計好的掩模上的圖案完全一致的光刻膠矽片模板，具體製備方法可參照[Y.Xia, G.Whitesides, Annual Review of Materials Science,1998，28，15]，在商用晶面為〈111〉的單晶矽片上製備具有一個微凸型結構；
[0069]2)聚二甲基矽氧烷晶片的製備，方法為軟刻蝕技術，製備材料為聚二甲基矽氧烷(PDMS, polydimethylsiloxane, 184silicone elastomer,購自 Dow Corning),其在普通狀態下是透明而粘稠的液體，經與固化劑反應(184silicone elastomer curing agent,購自Dow Corning)並加熱後可固化。利用F1DMS可以將娃片模板上的突起圖形轉換為對應的凹型圖形，從而得到一與所述凸型條微結構相對應的聚二甲基矽氧烷晶片，其下表面的微凹槽的高度為5微米，寬度在5-50微米範圍內選取，間距在30-50微米範圍內選取。
[0070]3)在PDMS晶片上打通孔，其中通孔的數目為2個或以上，通孔直徑為微球直徑的10-1O2倍之間，通孔邊緣的最近距離可在500-2000微米之間調節。之後將晶片有圖案的一面貼合在玻璃片上，通孔與玻璃基底形成小室。
[0071]其中，通孔的形狀可以是圓形、長方形、串珠形其中的任意一種。
[0072]2細胞培養
[0073]在神經細胞黏附在微球上後，我們小心的收集黏附有神經細胞的微球，並把它們加入微流晶片的小室內(見圖4A)。用含2%B27和l%Glutamax-l的Neurobasal神經培養基(GIBC0)，每四天替換一半。
[0074]實施例5
[0075]多層微通道連接神經網絡(見圖5)
[0076]I多層微通道晶片的製備
[0077]I)通過光刻的方法獲得翻模模板，模板基底為矽片，凸起圖案由光刻膠構成；
[0078]2)將模板放到勻膠機上，倒入液態的PDMS，轉速為1200-2000轉/分鐘，之後將載有PDMS的模板放入烘箱中，加熱固化後得到相應厚度為80-40微米的PDMS薄膜，薄膜的一面具有微流通道，其中通道的高度可以在5-10微米範圍內選擇，寬度可在5-50微米範圍內選擇，每片晶片上通道數量在12-1O3數量級。
[0079]3)將兩片上述PDMS薄膜經過氧等離子體處理後鍵合成一個多層微通道晶片，一片有圖案的一面與另一片無圖案的一面貼合，並且上下兩層通道方向相互垂直；
[0080]4)在PDMS晶片上打通孔，其中通孔的數目為2個以上，通孔直徑為微球直徑的10-1O2倍之間，通孔邊緣的最近距離可在500-2000微米之間調節。之後將晶片有圖案的一面貼合在玻璃片上，通孔與玻璃基底形成小室。
[0081]其中，通孔的形狀可以是圓形、長方形、串珠形其中的任意一種。
[0082]2細胞培養
[0083]在神經細胞黏附在微球上後，我們小心的收集黏附有神經細胞的微球，並把它們加入微流晶片的小室內。用含2%B27和l%Glutamax-l的Neurobasal神經培養基(GIBC0)，
每四天替換一半。
[0084]實施例6
[0085]微通道晶片上多級別神經網絡模擬不同腦區間相互作用
[0086]在晶片內不同小室種植不同亞型的神經細胞(如海馬區中的椎體神經細胞和大腦皮層中的神經細胞等)，誘導各小室的低級神經網絡之間形成連接，構建含不同細胞類型的高級別三維神經網絡，從而模擬生理和病理狀態下不同腦區之間的神經細胞的連接和相互作用。
[0087]具體為:
[0088]I微通道晶片的製備
[0089]參照實施例4和實施例5中微流控晶片製備和多層微通道晶片製備的步驟。根據需要選擇晶片層數。
[0090]2細胞培養
[0091]I)細胞選取和分離。根據具體研究內容選定腦區，分離細胞的步驟參照實施例1中原代神經細胞部分。
[0092]2)在神經細胞黏附在微球上後，我們小心的收集黏附有神經細胞的微球，並把它們加入微流晶片的小室內。用含2%B27和l%Glutamax_l的Neurobasal神經培養基(GIBC0)，每四天替換一半。
[0093]實施例7
[0094]掃描電子顯微鏡表徵實施例2中神經細胞在自組裝結構單元上生長情況
[0095]具體步驟:
[0096]在37°C將黏附著神經細胞的微球用D-PBS洗滌一次，之後用2.5%戊二醛水溶液在室溫條件下固定4小時。樣品依次在25%，50%, 70%, 85%, 95%和100%酒精中梯度脫水，每個濃度30分鐘。經過臨界點乾燥(CPD030Critical Point Dryer, Bal-Tec),通過掃描電子顯微鏡(FEI quanta200)觀察單個和多個微球上神經細胞的粘附和生長情況(見圖1B-1E)。
[0097]實施例8
[0098]雷射共聚焦顯微鏡觀察實施例2中幾何限制微球自組裝體上形成的三維神經網絡
[0099]具體步驟:
[0100]在37°C將樣品用D-PBS洗滌一次，之後用4%多聚甲醛固定30分鐘。細胞膜用0.3%Triton X-100滲透15分鐘。在用10%山羊血清進行非特異性封閉I小時後，用神經細胞和膠質細胞特異性抗體(作用於神經細胞的抗體有Tujl (Sigma)，sm1-312 (Covance)，MAP2 (Millipore), CaMKII (Invitrogen), GABA (Sigma),膠質細胞抗體有 GFAP (Sigma))在 4。。下孵育過夜，之後用相應的二抗染色用於觀察(Alexa Fluor488, 633或555 (sigma))。
[0101]圖2A中，用神經細胞特異性抗體Tujl標記了形成的三維神經網絡，顯示了自組裝多層支架上神經網絡的生長情況。
[0102]本發明還表徵了神經網絡中神經細胞的功能分化情況。圖2B給出了四批細胞的統計結果，每批60-110個神經細胞。結果顯示興奮性和抑制性神經細胞佔總體的比例大約分別為70%和30%，與體內神經網絡和體外二維神經網絡研究文獻報導相符，說明三維神經網絡形成了很好的功能性分化和興奮-抑制平衡。
[0103]實施例9
[0104]雷射共聚焦顯微鏡觀察實施例4中三維神經網絡的結構
[0105]以不同的螢光染料標記不同小室中的三維神經網絡，從而觀察各低級別神經網絡之間的連接形成高級別神經網絡的方式和各神經網絡之間的相互作用。
[0106]圖4B 為綠色突光活細胞染料 Tubulin tracker Green (Molecular Probes),標記活的神經細胞的細胞骨架中的微管。具體實驗步驟如下:
[0107]1.將樣品用預熱的無鈣鎂的hanks緩衝溶液洗一次；
[0108]2.用DMSO溶解Tubulin tracker Green和等體積的20%濃度的F127,其中Tubulin tracker Green 的最終工作濃度為 250nM ；
[0109]3.將樣品在37°C，5%C02培養箱中避光孵育30分鐘；
[0110]4.用hanks緩衝液洗去沒有結合的染料，在螢光顯微鏡下用488nm激發光觀察。
[0111]圖4C為脂溶性紅色螢光染料DiI (Molecular Probes)標記神經細胞的細胞膜。將分離的神經細胞懸液與DiI染料混合，其中DiI工作濃度為I?5nM，將染色後的細胞種植與微球上培養成三維神經網絡。
[0112]圖4A示意了兩個低級別網絡中即微球自組裝體的神經細胞通過微流控通道相互連接。
[0113]實施例10
[0114]雷射共聚焦顯微鏡觀察實施例5中三維神經網絡的結構。
[0115]圖5A示意了多層晶片上三維神經網絡的構建過程。圖5B中綠色螢光為TubulinTracker Green,標記神經細胞的微管(同實施例9)。
[0116]結果顯示，微球支架上自組裝的低級別神經網絡定位在小室中，隨著神經細胞生長，網絡中伸出突起，在上下兩層微流控通道的調控下沿通道內生長，並進入其他自組裝神經網絡的區域，從而形成更高級別的多方向連接的更複雜的三維神經網絡。
[0117]實施例11
[0118]三維神經網絡的信號檢測(圖6)
[0119]用鈣成像的方法對神經活動進行表徵。
[0120]鈣成像的原理是神經活動發放時，神經細胞鈣庫內儲存的鈣離子會大量進入胞漿，活動發放結束時，胞漿內過量的鈣離子重新回到鈣庫，因此鈣離子的濃度與神經活動過程相偶聯。鈣離子染料Fluo4用螢光標記了鈣離子，因此螢光強度的增減反映了鈣離子的濃度，進而反映了神經活動的過程。沿時間軸對同一位置進行等間隔拍攝，拍攝間隔小於I秒，持續時間為10分鐘。圖6A為該序列中的一張。圖中的圓圈標記了所有螢光強度有變化的神經細胞，用數字人為對其進行標號，方便後續統計。陰影分別標記了兩組神經細胞，每組內的神經細胞活動發放在頻域上具有很好的一致性。從所有神經細胞中隨機選取兩個，示意了其活動發放曲線(圖6B)。縱軸是鈣信號的螢光強度，橫軸是時間。隨後對兩兩神經細胞之間發放曲線的相關性(圖6C)和歸一化距離(圖6D)進行統計，分別得出一個沿對角線對稱的矩陣。橫軸和縱軸都是按序號排列的神經細胞。最後，對兩兩神經細胞活動的相關性和距離再次做相關性分析，發現隨著神經細胞之間距離的增大，活動相關性減小。這與著名的Hebb定律相吻合,即連接在一起的神經細胞活動一致。
[0121] 申請人:聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細結構特徵以及方法，但本發明並不局限於上述詳細結構特徵以及方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細結構特徵以及方法才能實施。所屬【技術領域】的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。
【權利要求】
1.一種體外培養三維神經網絡的裝置，其特徵在於，所述裝置包括微流控晶片、用於黏附神經細胞的微球和基底，其中所述微流控晶片包括一層或多層聚二甲基矽氧烷(PDMS)彈性層並具有通孔，所述PDMS彈性層具有供神經細胞突起延伸的微流管道，所述通孔與基底形成用於容納微球的小室；所述微球優選為均一直徑；所述小室優選為圓形、長方形或串珠形；以及所述基底優選為玻璃基底、PDMS基底或聚苯乙烯(PS)基底。
2.根據權利要求1所述的裝置，其特徵在於，所述微球的直徑為30-140微米，優選為40-100微米，更優選為40-70微米。
3.根據權利要求1或2所述的裝置，其特徵在於，所述微球是矽硼玻璃微球和水凝膠微球中的任意一種。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述通孔橫截面的邊長或直徑為微球直徑的1c1-1O2倍，優選20-80倍，更優選40-60倍。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述微流管道高度為3微米-10微米,優選為4-8微米,最優選為5微米。
6.根據權利要求1至5中任一項所述的裝置，其特徵在於，所述微流管道寬度優選為5-50微米，更優選為10-40微米，最優選為20-30微米。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的裝置，其特徵在於，當採用多層PDMS彈性層時，下層PDMS彈性層的厚度為40-80微米，優選50-70微米，更優選60微米，且總厚度為200微米至3毫米，優選為500微米至2.5毫米，更優選為I毫米至1.5毫米；當採用單層PDMS彈性層時，厚度為150微米至3毫米，優選為500微米至2.5毫米，更優選為I毫米至1.5毫米。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的裝置的製備方法，其特徵在於，所述方法包括Ca)經光刻方法得到模板，用PDMS對模板上的圖案進行翻模，得到具有微流管道的所述PDMS彈性層；(b)任選地，將多層所述PDMS彈性層同向疊合，通過氧等離子體處理使相鄰兩層之間鍵合，並使相鄰兩層中所述微流管道的方向為30?90度夾角，優選為90度夾角；(c)在所述PDMS彈性層上打通孔；和(d)將所述PDMS彈性層有圖案的一面與基底貼合，通孔與基底形成所述小室。
9.根據權利要求1至7中任一項所述的裝置的使用方法，其特徵在於，所述方法包括微球的自組裝、將神經細胞種植在所述微球的表面和將黏附有神經細胞的微球放入小室中進行培養；其中在種植神經細胞之前優選地先種植膠質細胞；所述神經細胞優選為原代神經細胞。
10.根據權利要求1至7中任一項所述的裝置在神經細胞和分子生物學、神經組織工程、腦機接口和藥物篩選中的應用。
【文檔編號】C12M3/00GK104342369SQ201310317246
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月25日 優先權日:2013年7月25日
【發明者】蔣興宇, 黃卓, 劉文文, 孫一, 鄭文富 申請人:國家納米科學中心