一種靶向lin28基因的幹擾小分子rna及其抗膠質瘤增殖的用途的製作方法
2023-10-17 23:46:24 1
專利名稱：一種靶向lin28基因的幹擾小分子rna及其抗膠質瘤增殖的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向LIN^基因的幹擾小分子RNA及其抗膠質瘤增殖的用途。
背景技術：
LiM8最早在線蟲中發現控制發育時段的異常基因。大量的研究表明，LiM8和 Lin28B在發育和疾病領域有廣泛而重要的作用。在人類纖維母細胞被誘導為多功能幹細胞的過程中，LiM8是四個關聯誘導因子之一，在誘導分化過程發揮調節作用，同時發現 Lin28和Lin28B的表達在多種癌中激活，他們的過表達常誘導細胞形狀的改變。已有研究揭示在胚胎細胞生物學、細胞再分化、發育和癌症的探索過程中LiM8都具有重要的生物學作用。LiM8基因對腫瘤細胞的增殖方面的研究，在國內外尚未見諸報導。腦膠質瘤是中樞神經系統中最常見的原發性腦腫瘤，起源於神經膠質細胞。由於惡性腦膠質瘤具有生長迅速，侵襲性強，手術後容易復發，病死率高等的特點，儘管包括手術切除術，放療以及化療在內的腦膠質瘤綜合治療水平在不斷提高，但其總體療效仍不理想。患上多形性膠質母細胞瘤(WHO IV級)的病人的平均存活時間僅僅為12-15個月，而患上間變性星形細胞瘤(WHO III級)的病人的平均存活時間為2-5年。因此，尋找有效的腦膠質瘤治療方法仍是神經外科領域關注的焦點。LI擬8是一種高度保守的RNA結合蛋白 (RBP)，在線蟲和高等物種中有著複雜的調節機制和表達方式，對微小RNA表達的調節、骨髂肌及心肌分化、腫瘤形成、多潛能誘導等多種發育的重要事件中起關鍵作用。近年來，多項研究顯示，LIN28在多種腫瘤中起到關鍵的作用，並且有研究認為LI擬8可能是一種調節細胞生長和發育的重要的原癌基因。RNA幹擾(RNA interference,RNAi)是指由雙鏈RNA介導的細胞內與其序列同源的mRNA發生特異性降解，從而導致基因表達沉默的現象，這是一種轉錄後水平的基因沉默機制。
發明內容
本發明的目的之一在於提供一種靶向LIN^基因幹擾小分子RNA。本發明的目的之二在於提供該幹擾小分子RNA的製備方法。本發明的目的之三在於提供該幹擾小分子RNA的應用。為達到上述目的，本發明採用如下技術方案
一種用於抗膠質瘤增殖的幹擾小分子RNA，其特徵在於該基因為SEQ NO. 1所示的鹼基序列。一種製備上述的用於抗膠質瘤增殖的幹擾小分子RNA的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為根據MAGic載體設計的具體要求，設計對應於LiM8基因388-406位，即 GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為58bp，送華大基因研究中心進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列為SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'
Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GAA ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；
根據MAGic載體設計的具體要求，將設計的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic質粒進行連接，得到用於抗膠質瘤增殖的幹擾小分子RNA。一種上述的用於抗膠質瘤增殖的幹擾小分子RNA在製備抗膠質瘤增殖的藥物中的應用。本發明設計對抗膠質瘤增殖有關聯的基因的RNAi，並應用膠質瘤細胞模型研究其對抗膠質瘤增殖的用，為RNAi在膠質瘤的治療應用提供了一種新方法。
圖1為shRNA的寡核苷酸序列引物和Pmm^質粒的連接圖。圖2 Lin28下調抑制了膠質瘤細胞的增殖；感染LiM8幹擾病毒3天為dayl，圖中U251-pLVT148為LiM8幹擾病毒。
具體實施例方式
一、膠質瘤細胞的培養膠質瘤細胞U251細胞系培養於37°C，5%C02恆溫培養箱。對數生長期的細胞用胰酶消化脫壁，之後加入適量培養液並反覆吹打以混勻細胞；將得到的細胞懸液移入15ml離心管中，1500rpm離心!Bmin ；去上清；用5ml無菌1 XPBS將細胞懸起，吹打混勻；加約Iml細胞懸液於裝有5ml新鮮培養基的新培養瓶中，放入37°C，5%0)2培養箱中培養，約2天左右傳代1次(主要查看細胞有無鋪滿培養瓶)。二、人腦膠質瘤細胞的分離取人腦膠質瘤手術標本，浸入4°C的KRBB溶液 (Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩衝液)中.清洗二次，然後將標本剪成小塊，轉移至盛有5mL 消化酶液的三角瓶中，於恆溫搖床中37 °C保溫，搖床轉速lOOr/min，每IOmin玻璃管反覆吹打一次，放置30min。將該懸液離心500-1000rpm，5min,最後剩下為膠質瘤細胞. 用細胞培養液懸起沉澱，在黑背景的顯微鏡下觀察可發現到呈圓形的膠質瘤細胞。三、LIN28-RNAi質粒的設計和感染 1. LIN28-RNAi質粒的設計
根據MAGic載體設計的具體要求，設計對應於LI擬8基因388-406位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為58bp，送華大基因研究中心進行合成； 所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為 SEQ NO. 1
Sense: 5' -CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'
Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GM ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；
根據MAGic中載體設計的具體要求，將設計的LIN28 -RNAi的幹擾片段和MAGic質粒連接，參見圖1，然後感染進膠質瘤細胞。圖1為MAGic質粒原理的圖解，使用基於RNA的CMV啟動子和優化的終止子，從而在靶細胞內可以精確地形成小分子幹擾RNA(shRNA)。shRNA 的表達質粒是一個預切好的備用載體。通過質粒上攜帶的篩選標記，進行哺乳動物細胞的共轉染，可建立shRNA表達的穩定細胞系。通過兩個MAGic的質粒各自與正義的DNA插入片段及反義的DNA插入片段相連接，便可介導shRNA的產生。或者單個質粒與一個具有髮夾結構的DNA插入片段相連接，也可介導shRNA的產生。無論哪種方法，首先必須合成兩段互補的DNA片段。而CMV啟動子則控制著shRNA的生成(參附圖1)。對於需要進行幹擾的目的基因，選擇一段靶序列為A2GN17C的DNA片段(靶序列的正義序列)，其GC含量接近 30-50% ο2. LI擬8-RNAi質粒的感染
感染前一天，用0. 25%trpsin消化IOcm培養皿中匯合率達到85%左右的U373-MG細胞lmin，然後吹打製備單細胞懸液，使細胞懸液終密度達到3X IO5 cells/ml細胞。用該細胞懸液鋪M孔板；每孔鋪500ul，細胞貼壁24h後，用pLVT148病毒以M0I=20的濃度感染 U373-MG細胞。感染24h對U373-MG細胞進行換液操作，並以每孔hlO3 cells/well的密度將U373-MG細胞傳代到5塊96孔板中，從3rfd開始檢測細胞增殖的變化，如圖2。四、實驗分組與檢測指標
正常對照組膠質瘤細胞，培養液為膠質瘤細胞培養液；
RNAi組感染過LIN28-RNAi的膠質瘤細胞，培養液為膠質瘤細胞培養液。膠質瘤細胞增殖的檢測將感染後的各組細胞懸液置於37 5% C02的培養箱中培養。5d後，以每孔hlO3 cells/well的密度將U251細胞鋪到5塊96孔板中，從6thd 開始採用MTS實驗檢測U251細胞增殖的變化。如圖2。五、實驗結果
感染過LIN28-RNAi幹擾質粒的膠質瘤的細胞增殖從第三天開始生長趨勢和對照相比呈現抑制趨勢。該實驗結果表明，通過RNAi技術下調膠質瘤中的LI擬8表達抑制了膠質瘤的增殖。
權利要求
1.一種靶向LIN^基因的幹擾小分子RNA及其抗膠質瘤增殖的用途，其特徵在於該基因為SEQ NO. 1所示的鹼基序列。
2.一種製備根據權利要求1所述的用於抗膠質瘤遷移的幹擾小分子RNA的方法，其特徵在於該方法的具體步驟為根據MAGic載體設計的具體要求，設計對應於LIN^基因 388-406位，即GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各為58bp，送華大基因研究中心進行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列序列為SEQ NO. 1: Sense: 5'-CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3'Anti-sense: 5，-MT TCA MA MG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GM ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3'；依據pMAGic載體設計的要求，將設計的shRNA序列和MAGic質粒進行連接，得到用於抗膠質瘤遷移的幹擾小分子RNA。
3.根據權利要求1所述的用於抗膠質瘤增殖的幹擾小分子RNA及其在製取抗膠質瘤增殖藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種靶向LIN28基因幹擾小分子RNA及其抗膠質瘤遷移的用途。該幹擾小分子RNA為SEQNO.1所示的鹼基序列。本發明設計對抑制膠質瘤增殖有作用的基因的幹擾小分子RNA，應用膠質瘤細胞模型研究其對膠質瘤增殖的抑制作用，為膠質瘤的基因治療提供了一種新方法。
文檔編號A61P35/00GK102181445SQ20111006744
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月21日 優先權日2011年3月21日
發明者夏清梅, 殷珊, 潘謳東, 車麗花, 陳國澤, 黃紅軍 申請人:上海生博生物醫藥科技有限公司