一種人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測方法及試劑盒與流程
2023-10-17 13:29:29 1
本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒，及其檢測方法。
背景技術：
遺傳性果糖不耐受症(Hereditary Fructose Intolerance，簡稱HFI)是為果糖代謝病的一種，為常染色體隱性遺傳病，是由於醛縮酶B基因(ALDOB基因)突變致B型醛縮酶缺乏或活性降低，從而導致患者出現果糖代謝的異常。歐洲發病率約1:26100，而我國發病率目前尚不清楚。隨著人民生活水平的提高，對糖的消費越來越多，HFI發病率會逐漸增多。
臨床上遺傳性果糖不耐受症患兒較少見，由於各種配方奶中大多含有蔗糖，所以出生後即人工餵養的新生患兒在2-3天內即可出現嘔吐、腹瀉、脫水、休克和出血傾向等急性肝功能衰竭症狀。本病的臨床診斷需要依靠血液生化檢查和果糖耐量試驗，但這兩種方法均是損傷性的。採用分子生物學的方法輔助診斷具有損傷小、可行性好的優點。
現檢測人果糖二磷酸醛縮酶B基因多態性的方法主要有直接測序和等位基因特異性寡核苷酸分析法(ASO)輔助檢測。直接測序雖然準確率較高，但耗時長，成本高。等位基因特異性寡核苷酸分析法是利用PCR擴增產物後，變性在尼龍膜上點樣，固定，然後用標記引物雜交，最後需放射自顯影。這種方法的缺點在於操作複雜，對操作人員的技術要求高，需要放射顯影，解析度不高，耗時長。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種高準確性、低成本、高通量、快速的檢測試劑盒，可用於檢測人果糖二磷酸醛縮酶B基因是否存在突變。
本發明所採取的技術方案是：
一種人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用於特異性擴增人果糖二磷酸醛縮酶B基因上3個多態性位點的引物對，3個多態性位點分別為A150P、A175D、N335K，所述引物對包括公共上遊引物和分型下遊引物，所述分型下遊引物包括野生型特異引物和突變型特異引物，對應3個多態性位點的公共上遊引物、野生型特異引物和突變型特異引物如下表所示：
表1、各個多態性位點的引物序列
F代表公共上遊引物，W代表野生型特異引物，M代表突變型特異引物。
優選地，每個公共上遊引物的5'端標記有螢光染料。所述螢光染料是FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5、JOE、VIC、PET中的一種或多種。
本發明所述人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒還包括對照基因序列，所述對照基因序列包括正常序列和突變序列。
所述正常序列：
CAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTGCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGCCAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAACTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.10)
所述突變序列：
CAAAGGGAGAACTCCTTCCCTTTATTAGAAGCCCCATGGATCAGGTACAAAGGTACAAAGAAGCCTTTCTCTCTTTTGTGACTTGCAGGGCTTGATGGCCTCTCAGAGCGCTGTGCTCAGTACAAGAAAGATGGTGTTGACTTTGGGAAGTGGCGTCCTGTGCTGAGGATTGCCGACCAGTGTCCATCCAGCCTCGCTATCCAGGAAAACGCCAACGCCCTGGCTCGCTACGACAGCATCTGTCAGCAGGTGCTCTGCCTTCCCCTTGGGCTGAAAAAGAGTAGGCTAGAGTTTTCTTCAGAGCTTTTCTTTTCAATTATACTATAACTACAAATGGACCTCCTTTTCCCAGAAGGGGATGGTATCCCCAGCAATATTCAGCAACATTGCTGTAAAAAGAAGAAAATCTGAGTGAAGGTTTGACTGGTTTCCCATGAGAGGCAGACAGGGTCAAGGTGGGGTCACATTTACTCTAACCAGTCTCCTCTCTCATATTTGTCTTCTAGGCTAAGTGCCAGGCGGCCAAAGGACAGTATGTTCACACGGGTTCTTCTGGGGCTGCTTCCACCCAGTCGCTCTTCACAGCCTGCTATACCTACTAGGGTCCAATGCCCGCCAGCCTAGCTCCAGTGCTTCTAGTAGGAGGGCTGAAAGGGAGCAACTTTTCCTCCAATCCTGGAAATTCGACACAATTAGATTT(SEQ ID NO.11)
所述的人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒還包括PCR緩衝液、熱啟動Taq酶、超純水、螢光分子量內標和等位基因分型標準物。
本發明還提供了使用上述人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒的使用方法，包括對樣品中人果糖二磷酸醛縮酶B基因的3個多態性位點的擴增採用聚合酶鏈式反應，其擴增產物的檢測採用高效液相色譜、多重螢光毛細管電泳或聚丙烯醯氨凝膠電泳。
其中，聚合酶鏈式反應的擴增程序為：95℃2分鐘；94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，共10個循環；94℃30秒、59℃30秒、72℃30秒，共18個循環；72℃10分鐘。
本發明的有益效果是：
(1)基於聚合酶鏈式反應，提高了多態性位點檢測的模板量，大大降低假陽性；
(2)公共上遊引物通過配備不同的螢光基團，能在一次電泳下最多可以檢測4-96個樣本的基因分型，具有高效節約的特點；
(3)聚合酶鏈式反應在1個小時內完成，毛細管電泳檢測過程也不足1個小時，整個檢測過程在3小時內完成，具有用時少，快速和準確度高的特點；
(4)可以省去DNA抽提步驟，唾液卡、FTA卡和血濾紙可以直接擴增，減少了操作步驟，簡化了其操作流程；
(5)本發明能夠準確判斷正常及突變樣本的基因分型。
附圖說明
圖1是試劑盒中正常序列對照野生型特異引物的3個位點檢測圖譜；
圖2是試劑盒中突變序列對照突變型特異引物的3個位點檢測圖譜；
圖3是實施例1的檢測圖譜；
圖4是實施例2的檢測圖譜；
圖5是實施例3的檢測圖譜；
圖6是實施例4的檢測圖譜；
圖7是實施例5的檢測圖譜；
圖8是實施例6的檢測圖譜。
具體實施方式
下面通過具體實施方式結合附圖對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
本發明針對的3個人果糖二磷酸醛縮酶B基因的多態性位點所在的序列如下表所示：
表2、各個多態性位點的序列
W代表野生型序列，M代表突變型序列。
人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用於特異性擴增人果糖二磷酸醛縮酶B基因上3個多態性位點的引物對，3個多態性位點分別為A150P、A175D、N335K，所述引物對包括公共上遊引物和分型下遊引物，所述分型下遊引物包括野生型特異引物和突變型特異引物，其中上遊引物為共用引物，包括螢光標記和靶序列特異結合區；下遊引物包括分型識別位點和長度調節區，所述螢光染料是FAM、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5、JOE、VIC、PET中的一種或多種。還包括對照基因序列、PCR緩衝液、熱啟動Taq酶、超純水、螢光分子量內標和等位基因分型標準物，所述對照基因序列包括正常序列和突變序列。
具體為如下表所示：
表3、試劑盒的組成
擴增後
本發明試劑盒的具體使用方法：
1、樣本DNA的提取
根據樣本的實際情況，選擇合適的方法提取樣本DNA，常見的方法有：磁珠法、陰離子交換樹脂法和鹼裂解法等等。若樣本是血濾紙、FTA卡、唾液卡等，可簡化步驟，直接擴增。
2、PCR反應
PCR反應的擴增體系如下：
PCR反應的擴增程序如下：
3、遺傳分析儀螢光電泳檢測
12μL去離子甲醯胺與0.5μL分子量內標(AGCU Marker SIZ-500)混合。再加入1μL PCR反應產物或ALDOB Allelic Ladder，渦旋混勻3500r/min離心2min，95℃變性3min，冰浴3min，用遺傳分析儀ABI3130XL進行檢測分析。
實施例1：
①標準圖譜的建立
按上述使用方法對照基因序列進行檢測，獲得如圖1和2所示的正常序列對照野生型特異引物的3個位點檢測圖譜以及突變序列對照突變型特異引物的3個位點檢測圖譜；
②樣品檢測及對照
按上述使用方法對一號樣品進行檢測，獲得如圖3所示的圖譜，可知一號樣品為A150P位點單位點突變。
實施例2：
其整體流程與實施例1相同，二號樣品的檢測結果如圖4所示，可知二號樣品為A175D位點單位點突變。
實施例3：
其整體流程與實施例1相同，三號樣品的檢測結果如圖5所示，可知三號樣品為N335K位點單位點突變。
實施例4：
其整體流程與實施例1相同，四號樣品的檢測結果如圖6所示，可知四號樣品為A150P和A175D位點雙位點突變。
實施例5：
其整體流程與實施例1相同，五號樣品的檢測結果如圖7所示，可知五號樣品為A150P和N335K位點雙位點突變。
實施例6：
其整體流程與實施例1相同，六號樣品的檢測結果如圖8所示，可知六號樣品為A175D和N335K位點雙位點突變。
以上對本發明的較佳實施方式進行了具體說明，但本發明創造並不限於所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發明精神的前提下還可作出種種的等同變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的範圍內。
SEQUENCE LISTING
廣東華美眾源生物科技有限公司
一種人果糖二磷酸醛縮酶B基因檢測方法及試劑盒
2016
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PatentIn version 3.5
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