預防或治療阿爾茨海默病的聯合療法及其試劑盒的製作方法

2023-10-10 03:21:54

專利名稱：預防或治療阿爾茨海默病的聯合療法及其試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及預防或治療阿爾茨海默病的聯合療法，以及用於實現該療法的試劑盒。
澱粉狀蛋白-β肽(Aβ)在阿爾茨海默病(AD)的神經病理學方面起著重要作用(Roher等，1993「β-Amyloid-(1-42)is a major component ofcere-brovascular amyloid depositsImplications for the pathology of Alzheimerdisease」PNAS 9010836)。該病的家族性類型與澱粉狀蛋白前體蛋白(APP)和早老蛋白(presenilin)基因的突變有關。這些基因中與疾病連鎖的突變導致這種肽的42個胺基酸形式(Aβ42)的產生增加，它是在阿爾茨海默病的澱粉狀蛋白斑(amyloid plaque)中發現的主要形式。該病的動物模型在商業上是可得的。過表達突變的人類基因APP(其中717位上的胺基酸是F而不是V)的PDAPP轉基因小鼠，以年齡或腦依賴的方式逐漸顯示出很多阿爾茨海默病的神經病理學標誌(Games等，1995「Alzheimer-typeneuropathology in transgenic mice overexpressing V717F β-amyloid precursorprotein」Nature 373523)。
已經進行了用「正常的」而非以模擬表位(mimotope)為基礎的疫苗作的接種研究。用聚集的Aβ42免疫轉基因動物，免疫或者在AD型神經病理髮作之前(6周)，或在更大的年齡(11個月)進行對年幼動物的免疫阻止了斑形成的發展、神經炎性營養不良(neuritic dystrophy)和astrogliosis。對年齡更大的動物的治療顯著降低了AD樣神經病理。這種實驗性接種方法誘導抗Aβ42抗體的產生，該抗體可以穿過血-腦屏障，攻擊澱粉狀蛋白斑(Schenk等，1999「Immunization with amyloid-β attenuatesAlzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse」Nature 400l73)。隨後，斑通過數種機制被去除，包括Fc受體介導的吞噬作用(Bard等，2000「Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the centralnervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimerdisease」Nature Med 6916)。這種疫苗也能延緩記憶缺陷(memory deficit)(Janus等2000「Aβpeptide immunization reduces behavioural impairment andplaques in a model of Alzheimer’s disease」Nature 408979)。
從1999年晚期起，一種很有前途的AD免疫治療法已經進入臨床試驗。人們認為，免疫作用可引發免疫系統進攻斑，從受感染的人腦中清除這些沉積物，雖然潛在的精確機制尚需更詳細地被表徵。
這些臨床試驗是由Elan製藥公司和它的合作者American Home Products聯合實施的(治療性疫苗AN-1792，QS21為輔劑)。一期試驗於2000年成功地完成。二期試驗於2001年晚期開始，以在一組輕度到中度AD的病人中檢測功效。
現在這些二期試驗已經永久性地終止了，因為在一些病人中發生了神經炎症(neuroinflammation)(2002年社論「Insoluble problem？」Nature Med8191)。症狀包括無菌性腦膜腦炎(aseptic meningoencephalitis)，使這些世界範圍的試驗立刻停止。在最壞的病例中，受影響的患者顯示出發生了自身免疫反應——自身免疫反應是很多免疫療法中的內在風險。自身免疫併發症本來是可以預見的，考慮到APP是普遍存在的，它理所當然地與它的蛋白水解產物具有共同的抗原決定簇。最近，更多的研究集中在聚集的Aβ42免疫所誘導的抗體(在人和鼠中)的性質，這些研究揭示大多數抗體識別Aβ42的第4和10位胺基酸之間(Aβ4-10)的小的區域。小鼠抗體阻滯Aβ原纖維生成，破壞已存在的Aβ纖維(McLaurin et al 2002「Therapeutically effective antibodies against amyloid-β peptide target amyloid-βresidues 4-10 and inhibit cytotoxicity and fibrillogenesis」Nature Med 81263)。值得注意的是，人抗體不與暴露在細胞表面的APP發生反應，也不與該前體的任何其他的非聚集蛋白水解產物發生反應(Hock et al 2002「Generationof antibodies specific for β-amyloid by vaccination of patients with Alzheimerdisease」Nature Med 81270)。在人和小鼠血清中，觀察到清楚的差別與人抗體相反，小鼠抗體檢測單體的、寡聚的和纖維狀的Aβ。這是很重要的，可能是治療效能的先決條件，因為表明不被人抗Aβ識別的Aβ的小寡聚體是這種病的主要毒性因素的證據正在越來越多，(toxic players)(Walsh etal 2002「Naturally secreted olijgomers of amyloid β protein potently inhibithippocampal longterm potentiation in vivo」Nature416535)。因此，一種可能的新策略是用包含β-澱粉狀蛋白胺基酸4-10(而不是用聚集的Aβ42)的疫苗免疫。儘管功效未知，該策略也面臨著自身免疫問題，因為病人將直接用(線性B細胞(linear B cell))「自身」表位免疫。
儘管最近在AD疫苗接種策略方面的發展令人失望，人們仍然認為Aβ疫苗是抗擊AD的最有前途的方法。然而，AD疫苗接種迫切需要改進和新的策略。特別是，這種疫苗應該不誘導自身反應性的T和/或B細胞。
不過，越來越多的其他治療法正在發展，這些治療法應該能阻止澱粉狀蛋白-β產生、澱粉狀蛋白β聚集或由上述聚集體引發的神經毒事件。在Wolfe的綜述文章(Nature Reviews Drug Discovery 1(2002 859-866))中總結了迄今為止研究過的針對AD的治療法。
形成澱粉狀蛋白-β斑的基礎是所謂的澱粉狀蛋白-β前體蛋白(APP)，它是一種內在跨膜蛋白(關於它的生理功能尚未清楚地證明；然而，大多數最近的研究結果提示，APP作為所謂的驅動蛋白I的膜運貨受體(membrane cargo receptor)而起作用)。APP在所謂的分泌酶作用下發生蛋白酶切，具體地，生理性地形成40個胺基酸長度的肽(Aβ40)。Aβ的其他更短或更長的片段也有形成，特別是一種42胺基酸的有高度的聚集潛力的形式(Aβ42)。因此，上述的Aβ42形式是在澱粉狀蛋白斑中出現最多的形式。正因為此，一種可能的AD治療策略主要集中在進攻負責上述不同切割的分泌酶(α-、特別是β-和γ-分泌酶)。因此，在AD治療中，針對上述酶，現已嘗試分別使用調節劑和抑制劑(例如，苯並二氮、磺胺、苯並己內醯胺)。
另一個與AD有關的基因是載脂蛋白E，其有3個等位變體存在(APOE2，APOE3和APOE4)。和總的人群相比，具有一個或兩個APOE4拷貝的人比攜帶APOE2的人患AD的風險更大。研究還顯示，服用抑制素，即抑制膽固醇生物合成的藥物的人，患AD的風險顯著下降。正因為此，進一步治療AD的策略集中在抑制膽固醇生物合成，例如使用抑制素。
治療AD的另一方面是抑制腦斑中澱粉狀蛋白的聚合，這也可能通過分泌酶抑制劑等手段來實現。還有人提出要降低鋅含量，因為如果鋅以生理上有意義的濃度存在，就可能誘導Aβ的聚合。
在現有技術中已經提出的其它的治療AD的策略涉及阻止APP的表達和增加Aβ的清除，其中為了實現所述阻止，尋找與APP啟動子區相互作用的物質。對於Aβ的清除，有人提出增加特定的蛋白酶，例如胰島素降解酶和中性溶酶(neprolysin)的活性，或外周使用抗Aβ抗體(De Mattos et al.，PNAS 98(15)(2001)，8850-8855)。然而，這些測試，在小鼠模型中產生了矛盾的結果(Wolfe，(2002))。最後，人們嘗試重新溶解已經存在的澱粉狀蛋白斑，例如通過降低AD病人血漿中的澱粉狀蛋白-β水平來達到這個目的。在這種背景下，還提出了利用單採血液成分術(apheresis)方法來降低腦中的β澱粉狀蛋白的斑沉積物(US 6,551,226，其提出通過單採血液成分術去除分子量大於500kD的大分子)，但未在AD中演示該方法。無論如何，在腦細胞中已存在的斑不可能由單採血液成分術直接溶解掉(大於500kD的斑或分子不能穿過血腦屏障)。
正如已經提到的，β-澱粉狀蛋白(Aβ40和Aβ42)斑的存在是AD最顯著的病理特徵。因此Aβ的減少被認為是AD防治中的主要藥理學目標。儘管有通過自動免疫誘導抗Aβ抗體導致澱粉狀蛋白的移除的描述，在臨床試驗中，迄今為止這種免疫都因為嚴重的副作用而失敗，這導致這種治療的停止。後來的臨床前結果顯示，抗體可能(也可能)引起外周的Aβ減少，可能因此而改變Aβ外周腦動力學。
現已進一步顯示，用對Aβ有高度親和力的試劑(例如凝溶膠蛋白(gelsolin)或GM1)進行外周治療，可使腦中Aβ的量下降(Masouka et al.，Journal ofNeuroscience 200329-33)。因此，有人提出將能夠降低血漿中Aβ的含量並減少或阻止腦中澱粉樣變(amyloidose)的發生的化合物作為一般手段。在此基礎上，可以發展活性不依賴於穿越血/腦屏障的新治療劑。
由所述血漿Aβ被捕捉(sequestration)所導致的Aβ從腦中流出(efflux)，已經顯示了對血漿中Aβ的含量具有方法依賴性的效果血漿中Aβ的含量不被凝溶膠蛋白減少；相反，施用凝溶膠蛋白和用抗Aβ單克隆抗體進行被動免疫導致血漿中Aβ含量的升高。然而，在實驗中，只有當使用相對年輕的APP轉基因小鼠時，腦中Aβ的載量才下降；當使用超過6月齡的小鼠時，治療證明無效。這可能由於在較老的小鼠的腦中，Aβ的不溶性增加。另一方面，長期的治療可能會成功，然而，凝溶膠蛋白或GM1的施用和被動免疫都不適合長期治療使用。
因此，本發明的目的是提供一種防治阿爾茨海默病的新策略，特別是一種還基於成功的免疫(immunization)的策略。
因此，本發明提供一種聯合治療方案，其包括誘導Aβ流出(efflux)的試劑和Aβ肽特異性的單採血液成分術。根據本發明，誘導Aβ流出(例如利用凝溶膠蛋白、GM1、Aβ-特異性的自動或被動疫苗等試劑來誘導)，且通過Aβ單採血液成分術來維持該流出。在本文中，即使用疫苗進行一次或兩次自動免疫，也足夠誘導IgM和/或IgG介導的血漿Aβ被捕捉，所述疫苗包含Aβ、Aβ衍生物或Aβ模擬表位。
因此本發明的一個特別優選的方面涉及用於預防或治療阿爾茨海默病(AD)的試劑盒，包括-誘導血漿中澱粉狀蛋白β(Aβ)被捕捉的試劑，和-單採血液成分術裝置，包括能與血液或血漿流接觸、並具有能結合澱粉狀蛋白-β前體蛋白(APP)的受體的固體載體。
本發明的試劑盒中，APP結合受體優選選自抗APP抗體，(可溶的)Aβ結合受體，例如抗Aβ40抗體或抗Aβ42抗體，APP結合蛋白，特別是凝溶膠蛋白，apoJ或apoE，APP結合多肽，APP結合神經節苷脂，特別是GM1，或APP結合核酸，特別是適體(aptamers)，或所述受體的混合物。
本試劑盒中，優選使用無菌的無熱原的柱子作為單採血液成分術的載體。
本試劑盒中，誘導血漿中澱粉狀蛋白β(Aβ)被捕捉的試劑優選選自對Aβ有高度親和力的試劑，特別是凝溶膠蛋白或GM1、Aβ特異性的肽配體或核酸配體、Aβ特異性的自動或被動疫苗或Aβ特異性的人源化單克隆抗體。
Aβ特異性的自動疫苗優選是Aβ衍生物或Aβ模擬表位。
特別優選的Aβ衍生物選自部分或全部由D-胺基酸組成，和/或不由天然胺基酸組成的多肽。
Aβ模擬表位優選由下式的肽組成或包含下式的肽X1X2X3X4X5X6，其中X1是胺基酸，除了C以外，X2是胺基酸，除了C以外，X3是胺基酸，除了C以外，X4是胺基酸，除了C以外，X5是胺基酸，除了C以外，X6是胺基酸，除了C以外，其中，X1X2X3X4X5X6不是DAEFRH，所述肽與對天然的N-端Aβ42序列DAEFRH具有特異性的抗體有結合能力，並且其5聚體(5-mer)與對天然的N-端Aβ42序列DAEFRH具有特異性的抗體有結合能力。
特別優選下式的肽X1X2X3X4X5X6，其中X1是G，或有羥基基團的胺基酸，或帶負電荷的胺基酸，優選E、Y、S或D，X2是疏水性的胺基酸或帶正電荷的胺基酸，優選I、L、V、K、W、R、Y、F或A，X3是帶負電荷的胺基酸，優選D或E，X4是芳香族胺基酸或L，優選Y、F或L，X5是H、K、Y、F或R，優選H、F或R，X6是S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y或G，優選T、N、D、R、I或G。
本文中，在蛋白質中天然存在的20種胺基酸可以被化學類似物或D-胺基酸代替；如，L、I和V可以被Nle、Nva、Cha或有其它線性或環狀脂肪族側鏈的α胺基酸所代替，W和F可以被芳香族胺基酸所代替，R和K可以被鹼性胺基酸如鳥氨酸或高精氨酸所代替。絲氨酸和蘇氨酸適合被有脂肪族和/或芳香族側鏈，且該側鏈終端有OH基團的胺基酸取代。這種變換的效率和有效性在例如PCT/EP04/00162中描述的實驗模型能夠很容易地進行檢驗。另外，對於抗體與肽的結合，也可能考慮空間因素(藉助於計算機模型)。
特別合適的表位是選自下列的至少一種表位EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DWELRI、YREFFI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG、DWEFRDA、SWEFRT、DKELR、SFEFRG、DAEFRWP、DNEFRSP、GSEFRDY、GAEFRFT、SAEFRTQ、SAEFRAT、SWEFRNP、SWEFRLY、SWELRQA、SVEFRYH、SYEFRHH、SQEFRTP、SSEFRVS、DWEFRD、DAELRY、DWELRQ、SLEFRF、GPEFRW、GKEFRT、AYEFRH、DKE(Nle)R、DKE(Nva)R或DKE(Cha)R。
依照本發明，Aβ42模擬表位用於抗AD接種這種模擬表位誘導產生抗Aβ42但不抗天然APP的抗體，這種模擬表位可以用(單克隆)抗體和(商業上可獲得的)肽文庫(例如，按照Reineke et al.2002「Identification ofdistinct antibody epitopes and mimotopes from a peptide array of 5520 randomlygenerated sequences」JImmunol Methods 26737)來鑑定。使用這樣的(單克隆)抗體，其不識別APP，而只檢測帶有氨基末端天冬氨酸的不同Aβ種類(這種抗體的實例在Johnson-Wood et al 1997中有描述「Amyloid precursorprotein processing and Aβ42 deposition in atransgenic mouse model ofAlzheimer disease」PNAS 941550)。在本發明的過程中，這樣的抗體已被證明是鑑定適用於疫苗的模擬表位的理想工具。雖然這樣的單克隆抗體在AD的小鼠模型中直接對小鼠給藥時顯示了有益的作用(Bard et al 2000「Peripherally administered antibodies against amyloid β-peptide enter the centralnervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease」Nature Med 6916)，但是這些抗體還從未被提出用作分離AD疫苗化合物的模擬表位搜索工具。
在現有技術中，所有努力都集中在天然存在的Aβ肽。如上所述，Aβ肽疫苗的臨床試驗，由於發生神經炎症事件而停止了。事實上，T細胞表位預測程序(BIMAS，用於限於I類MHC的表位；TEPITOPE，用於限於II類MHC的表位)提出在該序列內部存在高分值的(自身)表位。這可能意味著神經炎症事件是由於自身免疫反應，這使得這種疫苗不適合普遍使用。
與現有技術提出的這種Aβ疫苗相反，在使用包含本發明的模擬表位的疫苗的治療過程中，預期不會發生自身免疫反應，因為用於根據本發明的模擬表位鑑定的(單克隆)抗體不識別APP，而且模擬表位序列不同於Aβ42衍生的自身序列，所述Aβ42衍生的自身序列先前已經被用於試驗或將被用於未來的試驗。
用於按照本發明模擬表位鑑定的抗體檢測Aβ衍生的、帶有游離氨基末端的天冬氨酸的胺基酸序列DAEFRH(＝原始表位)，因此不識別天然的APP。抗體是單克隆或多克隆抗體製品，或任何抗體的部分或其衍生物，唯一的先決條件是抗體分子特異性地識別DAEFRH表位，也就是說，它不與天然的N-端延長形式的澱粉狀蛋白前體蛋白結合，這意味著，它對DAEFRH表位的結合能力比對APP分子的結合能力(binding capacity)至少高100倍，優選至少1000倍，更優選至少高105倍。抗體可以是和Johnson-Wood等1997所描述的抗體相比對DAEFRH序列有同樣的或較高的結合能力的抗體。當然，結合能力較低的抗體也可能使用(＞10％、＞50％或＞80％Johnson-Wood等的抗體的結合能力)，雖然更優選較高的結合能力。
按照本發明的化合物與那些抗體結合的特異性與DAEFRH序列相比具有可比性。
按照本發明要使用的模擬表位優選長度是5-15個胺基酸。所述的化合物存在於疫苗中的形式可以是分離的(肽)的形式，或是與其它分子偶聯，或者形成複合物(complexed)，如藥用載體物質或多肽、脂類或糖類結構。按照本發明的模擬表位優選長度是(最少)5-15、6-12個胺基酸殘基，特別是9-11個。然而，模擬表位能夠與非特異性的接頭(linker)或載體(共價或非共價地)偶聯，特別是與肽接頭或蛋白載體偶聯。而且，肽接頭或蛋白載體可以由T細胞輔助表位(T cell helper epitopes)組成或者包含T細胞輔助表位。
藥用載體優選為KLH、破傷風類毒素、白蛋白結合蛋白、牛血清白蛋白、樹狀聚體(dendrimer)(MAP；Biol.Chem，358581)、以及由Singh等所描述的佐劑物質(Nat.Biotech.17(1999)，1075-1081)(特別是那些在該文件中表1指明的物質)和O』Hagan等Nature review，Drug Discovery 2(9)(2003)，727-735(特別是其中描述的內源免疫增效化合物和分配系統)或其混合物。而且，疫苗組合物可以包括氫氧化鋁。
包括本化合物(模擬表位)和藥用載體的疫苗可以通過任何適合施用的方式給藥，例如，靜脈注射、腹腔注射、肌肉注射、鼻內、口服、皮下，等，以及以任何適當的分配裝置使用(O』Hagan et al.，Nature Reviews，DrugDiscovery 2(9)(2003)，727-735)。疫苗一般含有本發明的化合物的量為0.1ng至10mg，優選10ng至1mg，特別是100ng至100μg，或者，作為選擇，在100fMol和10μMol之間，優選10pMol至1μMol，特別是100pMol至100nMol。疫苗還包含典型的佐劑，如緩衝劑、穩定劑等。
按照本發明，單採血液成分術裝置在聯合治療過程中的啟動之後用來保持Aβ流出，所述裝置包括能與血液或血漿流接觸的固體載體，所述載體包括與澱粉狀蛋白-β前體蛋白(APP)結合的受體。藉助本單採血液成分術裝置，通過單採血液成分術，可以特異性地清除AD患者和有患AD風險的人的APP或APP分解產物，特別是Aβ40或Aβ42，這樣Aβ被捕捉的效果可以在第一步中保持。眾所周知，Aβ42在中樞神經系統(CNS)和血漿之間存在動態平衡。如上所述，在小鼠模型中可以看到(DeMattos PNAS 2001，如上)，外周使用抗Aβ抗體影響CNS和血漿中Aβ42的清除，降低Aβ42在腦中的載量，而沒有抗Aβ抗體穿過血腦屏障。Matsuoka等(Journal ofNeuroscience 200329-33)通過外周施用其它的Aβ42結合分子(凝溶膠蛋白)證實了所述結果。由此，斑形成的過程可以在腦中一個非常好的易接近的位點被阻止，即已經在血液中，也就是說所述蛋白和分解的肽各自不能再回到腦中，也不能在那裡聚集。腦中斑形成的過程也可以通過捕獲血液中的Aβ42而被阻止。在此過程中，在單採血液成分術裝置中與患者的血液或血漿接觸的受體對Aβ42或APP的其它分解形式是否具有特異性並不重要，唯一重要的是APP和它的(蛋白水解的)分解產物特別是Aβ42由所述特異吸附作用從血液中被除去，從而沒有「錯誤的」蛋白分解作用(即生成Aβ42)發生或沒有斑的形成。因此，本發明是基於與US 6,551,266完全不同的單採血液成分術的使用方法，即基於排除已經潛在的結構性的斑組分而不是斑本身。另外，對於藉助單採血液成分術治療AD而言，可以推知通過單採血液成分術消除斑是無效的，因而將其排除在外，原因是血液單採血液成分術不能到達腦中斑形成的區域。
另一方面，和其它的導致Aβ在體內自我損耗(例如，DeMattos等，PNAS98(15)(2001)，8850-8855，用外周抗Aβ抗體)且進行較長時間的方法相比，本發明的聯合治療方案具有決定性的優勢，即不會引發自身免疫反應。而且，按照本發明，不必給患者提供只能在體內(可能只有在被運到特定位點後才)起作用的物質，而致病因素被選擇性地去除，也就是，疾病的起因以體外的方式被特異性地去除，從而不必排除體內反應產物。
按照本發明，所有實施方式的現存的和已知的單採血液成分術裝置可很容易地適用於本發明。特別是，當選擇固體載體(和單採血液成分術裝置)的時候，它的/它們的醫療適用性是應該考慮的。這樣的載體、方法或裝置在US 5,476,715，US 6,036,614，US 5,817,528或US 6,551,266中有描述。相應的商業的單採血液成分術裝置由以下公司銷售，Fresenius，Plasmaselect，ASAHI，Kaneka，Braun等，它們提供例如LDL-Therasorb，Immusorba，Prosorba，Globafin，Ig-Therasorb，Immusorba，Liposorba，HELP，DALI，Bilirubin-Bile-Acid-Absorber BR-350，Prometheusdetoxication，MARS，ADAsorb of Medicap或Plasma FLO等系統。雖然所有這些系統的商業上可獲得的形式並不總是主要針對單種蛋白的特異性排除，但是單採血液成分術領域的技術人員能夠容易地將其適用於本發明，例如作為免疫單採血液成分術(irmmuno aphrensis)和/或通過在單採血液成分術裝置中安裝發明的固體載體(例如柱子)。
因此，按照本發明，「APP結合受體」理解為對配體APP及其生物副產物(biological by-product)特別是Aβ42有親和力，並且能夠從AD患者及有患AD的風險的人的血液或血漿中去除所述多肽的所有物質。所述APP和Aβ42受體各自優選(單或多克隆)抗體、蛋白、肽、神經節苷脂或核酸。
特別優選的是抗APP抗體、抗Aβ40抗體或抗Aβ42抗體、APP結合蛋白特別是凝溶膠蛋白、apoJ或apoE、APP結合肽、APP結合神經節苷脂特別是GM1、或APP結合核酸特別是適體、或所述受體的混合物。
這樣的抗體的例子有，3D6(Aβ1-5)、2H3(Aβ1-12)、2G3(Aβ33-40)、21F12(Aβ3342)、12H7(Aβ33-42)(Johnson-Wood et al.，PNAS 19971550-1555)、10D5、16C11(Bard et al.，Nature Medicine 2000916-919)、DeMattos等(2001)描述的抗體(m266，m243)，以及有同樣特異性的抗體。這樣的抗體可以通過例如用包含APP、Aβ42或其片段或變體的疫苗製劑免疫哺乳動物，然後任選地進行細胞融合和克隆選擇(用單克隆抗體)過程而獲得。
APP-結合蛋白受體的更多例子有凝溶膠蛋白(Matsuoka et al.2003，見上述)、apoJ或apoE(DeMattos et al.，2001，見上述)。GM1是APP結合神經節苷脂受體的例子(Matsuoka et al.2003，見上述)。
在本文中，作為APP-結合受體的肽可以由D型或L型胺基酸，或由D型和L型胺基酸的組合組成，並任選地通過進一步的修飾、成環或衍生化而被改變。合適的肽受體，例如Aβ42的受體，可由商業上可得到的肽文庫提供。這些肽的長度優選至少5個，優選6個胺基酸，特別是至少8個胺基酸，其中優選的長度為最多10個、優選最多14個或20個胺基酸。然而，按照本發明，更長的肽用作APP-結合受體也沒有問題。而且，寡聚物(象聚乙烯亞胺(polyethylenimine)和聚賴氨酸)是合適的受體。
當然，噬菌體文庫、肽文庫(見上述)，或例如由組合化學或對不同結構的高通量篩選技術獲得的結構文庫，也適合生產這樣的APP-結合受體。
而且，基於核酸的APP-結合受體(「適體」；還有「誘餌」(decoy)寡脫氧核苷酸(就它們的序列而言組成轉錄因子的結合位點的雙鏈寡核苷酸))，其中所述的核酸可以被各種(寡核苷酸)文庫(例如有2-160個核酸殘基)檢測(例如，Burgstaller et al.，Curr.Opin.Drug Discov.Dev.5(5)(2000)，690-700；Famulok et al.，Acc.Chem.Res.33(2000)，591-599；Mayer et al.，PNAS 98(2001)，4961-4965；及很多其它的)。核酸骨架可以例如通過天然磷酸二酯(phosphor diester)化合物和硫代磷酸酯(phosphorothioate)或組合或化學變體(如作為PNA)來檢測，其中按照本發明，主要是U、T、A、C、G、H和mC能作為鹼基使用。按照本發明可用的核苷酸的2』殘基優選是H、OH或其它的2』位置保護性基團或修飾基團，其中核酸也能被修飾，例如，被提供給保護性基團，如它們經常用於寡核苷酸的合成那樣。「保護性基團」理解為氧原子的醚化，而-OH-基團被與2』位置修飾不同的物質代替。在現有技術中描述了二者的很多不同的可能性；甲基、烯丙基、丙基和類似的保護性基團(即，例如，2』OCH3，2』-O-CH＝CH3，等)是特別優選的；特別優選的修飾是2』-脫氧、2』-氨基、2』-氟、2』-溴、2』-疊氮基(azido)，還有金屬，例如硒等。另外，按照本發明，為反義技術(核酶(ribozymes)、RNAi等)而發展的寡核苷酸穩定化處理方法可用於提供核酸(對比，例如，在這個領域領先的ISIS和Ribozyme Pharmaceuticals公司，特別是它們的專利文件和主頁)。
因此在本發明的範圍中APP-結合的適體(按照本發明和上面定義的，也包括Aβ42結合的適體)也優選作為APP-結合受體。
因此，優選由肽、抗體或核酸組成的APP-結合受體被用作載體材料，用於在阿爾茨海默病病人(或具有患該病傾向的人)中體外地消除APP及其蛋白分解產物。
在利用該發明進行常規的醫療時，載體要求是無菌和無熱原的，因此按照本發明，滿足該特性的任何載體物質和任何受體/載體組合都是優選的(參考例如US 6,030,614或US 5,476,715)。合適的例子包括含有乙烯基的單體(如丙烯酸，例如TSK Toyopearl，Fractogel TSK)的多孔的同聚物、共聚物或三元共聚物，被含有環氧乙烷的化合物(如環氧氯丙烷)修飾(活化)或可選地進一步與含有NH3、氨基或羧基、CNBr或CNCl吸附劑(如在EP110,409 A和DE 3,617,672A中所描述的)反應的載體。優選用於治療目的的吸附材料適合於避免血細胞損失，不(或很少)激活補體系統，並在體外循環中最大程度上延遲聚集物形成。所用的載體材料優選地應該在與受體偶聯的形式下對滅菌手段也是穩定的，特別是對環氧乙烷飽和、戊二醛飽和、γ射線、蒸汽處理、UV、溶劑或去汙劑等穩定。也可以使用基於sepharose、瓊脂糖、丙烯酸、乙烯基和葡聚糖的產品，它們的優選適合結合APP-結合受體的功能基團已經是商業上可獲得的。一些整體料(monoliths)(如通過交聯的縮水甘油甲基丙烯酸酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物的載體)也可以用來做載體。
可以使用本領域技術人員已知的化學反應把受體偶聯到合適的載體上(如Bioconjugate Techniques，Greg T Hermanson主編Academic Press，Inc.San Diego，CA，1995，PP 785)本發明的另一個方面涉及本發明的設備的如下用途通過調節該設備使之適用於治療各個患者，在本發明的聯合療法的範圍內，為阿爾茨海默病提供治療或治療設備，或預防該疾病。進行治療時，患者與單採血液成分術裝置連接足夠長時間，以有效的去除APP多肽，其中患者的血液或血漿流和含有APP結合受體的固體載體相接觸，APP和/或APP的蛋白水解物(特別是Aβ42)被結合在該載體上面。在單採血液成分術治療過程中，當然必須保證外周或中樞靜脈通路及動靜脈瘻，及充分地防止凝血，記錄所述的數值和測量的數據。而且，大多數單採血液成分術方法要求在正式的血漿處理之前初步分離血漿和血細胞。需要這種預防性措施的特殊人群包括有家族因素的老人(＞50、＞60或＞70歲)或者有另外的AD危險性因素特別是遺傳因素的人。
根據另一個重要的方面，本發明與涉及一種預防或治療阿爾茨海默病(AD)的方法有關，其中，-對人施用誘導血漿中澱粉狀蛋白β(Aβ)被捕捉的試劑，並用單採血液成分術裝置處理該人，該裝置包括能與血液或血漿流接觸的固體載體，該載體有與澱粉狀蛋白-β前體蛋白(APP)結合的受體，其中利用該單採血液成分術裝置將APP從該人的血液中去除。
優選用本發明的試劑盒進行所述方法。
因此，本發明也涉及如上面定義的Aβ模擬表位在生產本發明的預防或治療AD的聯合治療中使用的試劑中的用途。
下面將通過實施例更詳細地解釋本發明，當然，本發明不受這些實施例的限制。
1.攜帶APP受體的載體的生產1.1.整體柱(monolithic column)按照產品說明書，用0.5 M pH8.0的磷酸鈉緩衝液平衡CIM環氧整體柱(Epoxy Monolithic Column)(BIA Separations，SI)，同時，按照產品說明書，將抗Aβ肽的單克隆抗體激活，並與CIM柱偶聯。柱子用磷酸鹽緩衝液(+1M NaCl)洗幾次，多餘的環氧基團任選被封閉。
通過控制洗滌和平衡洗出液來保證質量；只有當洗出液中沒有活性環氧基團和沒有抗體洩漏時，柱子才可用於後面的過程並安裝在單採血液成分術裝置中。
1.2.Sepharose柱將散裝瓊脂糖材料(sepharose CL4B)在無菌條件下裝入無菌的且無熱原的容器中，材料在無菌條件下洗滌，每步洗滌之間，凝膠材料都在真空中完全乾燥。然後，將sepharose在高壓滅菌鍋中，在115℃條件下蒸汽滅菌30分鐘。
滅菌之後，將sepharose裝入盛有60％丙酮/水的無菌容器中，用CNBr和三乙胺(每96ml丙酮加14g CNBr；66.2ml 87％丙酮加30ml三乙胺)活化。然後，加入丙酮/HCl溶液(392ml消過毒的且無熱原的水；16.3ml 5N HCl，408ml丙酮)。活化的瓊脂糖在2h內洗滌並用於偶聯反應，以防止已活化的基團水解。
將過濾除菌過的抗體溶液(分別是m266或m243)導入反應容器中，至少攪拌90min。最後，(用等滲磷酸鹽緩衝液)徹底洗滌反應溶液，直到在洗出液中不能檢測到反應產物，將抗體偶聯的瓊脂糖裝入無菌且去熱原的有玻璃熔渣的玻璃柱中，進行最後的質量檢查(針對反應產物、重金屬等的洗脫液分析；顆粒分析，熱原性；無菌性)。
2.阿爾茨海默病患者的單採血液成分術治療的動物模型在過去的幾年中，德國Karlsburg的「Gerhard Katsch」糖尿病研究所已經建立了一種用於在自由活動的小動物身上進行實驗性單採血液成分術的特殊體外系統。這種單採血液成分術療法可以在同一個動物身上重複進行。而且，所用的動物也能被用於後續的研究，以對單採血液成分術療法作長期評估。在數種大鼠株系中已經成功地使用了上述的實驗性單採血液成分術系統。當大鼠的體重超過250g時，有I型糖尿病的大鼠和膠原蛋白II型誘導的關節炎的大鼠能夠很好地忍受重複的單採血液成分術治療。
在實驗性單採血液成分術治療開始前，給動物提供動脈和靜脈導管。在單採血液成分術的第一步，用血漿過濾器分離血細胞和血漿。當血細胞被直接重新注入動物體時(通過靜脈導管)，引導分離的血漿通過在實例1中生產的吸附試劑(其中由於與固定化的受體結合，配體被從血漿中分離出來)，然後將血漿重新供應給動物。
作為選擇，也可以使用全血的單採血液成分術，與對LDL的DALI單採血液成分術類似。
3.在動物模型中的本發明的聯合療法基本上，在動物模型中進行的聯合療法時，Aβ流出可在單採血液成分術之前、過程中或之後發生。此外，兩種療法使用的頻率相對彼此可以變化。
權利要求
1.用於預防或治療阿爾茨海默病(AD)的試劑盒，包括-誘導血漿中澱粉狀蛋白β(Aβ)被捕捉的試劑，-單採血液成分術裝置，其包括能與血液或血漿流接觸的固體載體，該載體具有與澱粉狀蛋白-β-前體蛋白(APP)結合的受體。
2.根據權利要求1的試劑盒，其特徵在於所述APP結合受體選自抗APP抗體，Aβ結合受體，特別是抗Aβ40抗體或抗Aβ42抗體，APP-結合蛋白，特別是凝溶膠蛋白，apoJ或apoE，APP結合肽，APP-結合糖脂類，優選神經節苷脂，特別是GM1，或APP結合核酸，特別是適體，或所述受體的混合物。
3.根據權利要求1或2的試劑盒，其特徵在於所述載體是無菌的和無熱原的柱子。
4.權利要求1至3中的任一項的試劑盒，其特徵在於所述誘導血漿中澱粉狀蛋白β(Aβ)被捕捉的試劑選自對Aβ有高度親和力的試劑，特別是凝溶膠蛋白或GM1、Aβ特異性抗體、肽或核酸、或Aβ特異性的自動或被動疫苗。
5.權利要求1至4中的任何一項的試劑盒，其特徵在於Aβ特異性的自動疫苗是Aβ衍生物或Aβ模擬表位。
6.權利要求5的試劑盒，其特徵在於Aβ衍生物選自部分或全部由D-胺基酸和/或非天然胺基酸組成的肽。
7.權利要求5的試劑盒，其中Aβ模擬表位由以下式的肽組成，或包含下式的肽X1X2X3X4X5X6，其中X1是胺基酸，除了C以外，X2是胺基酸，除了C以外，X3是胺基酸，除了C以外，X4是胺基酸，除了C以外，X5是胺基酸，除了C以外，X6是胺基酸，除了C以外，其中，X1X2X3X4X5X6不是DAEFRH，所述肽與對天然的N-端Aβ42序列DAEFRH有特異性的抗體有結合能力，並且其5-聚體與對天然的N-端Aβ342序列DAEFRH有特異性的抗體有結合能力。
8.權利要求7的試劑盒，其特徵在於，在所述式X1X2X3X4X5X6中X1是G，或有羥基基團的胺基酸，或帶負電荷的胺基酸，優選E、Y、S或D，X2是疏水性的胺基酸，或帶正電荷的胺基酸，優選I、L、V、K、W、R、Y、F或A，X3是帶負電荷的胺基酸，優選D或E，X4是芳香族胺基酸或L，優選Y、F或L，X5是H、K、Y、F或R，優選H、F或R，並且X6是S、T、N、Q、D、E、R、I、K、Y或G，優先選擇T、N、D、R、I或G，特別是EIDYHR、ELDYHR、EVDYHR、DIDYHR、DLDYHR、DVDYHR、DIDYRR、DLDYRR、DVDYRR、DKELRI、DWELRI、YREFFI、YREFRI、YAEFRG、EAEFRG、DYEFRG、ELEFRG、DRELRI、DKELKI、DRELKI、GREFRN、EYEFRG、DWEFRDA、SWEFRT、DKELR、DAEFRWP、DNEFRSP、SAEFRTQ、SAEFRAT、SWEFRNP、SWEFRLY、SWELRQA、SVEFRYH、SYEFRHH、SQEFRTP、SSEFRVS、DWEFRD、DAELRY、DWELRQ、SLEFRF、GPEFRW、GKEFRT或SFEFRG。
9.預防或治療阿爾茨海默病(AD)的方法，其中-對人施用誘導血漿中澱粉狀蛋白β(Aβ)被捕捉的試劑，並用單採血液成分術裝置處理該人，該裝置包括能與血液或血漿流接觸的固體載體，該載體具有與澱粉狀蛋白-β前體蛋白(APP)結合的受體，其中利用該單採血液成分術裝置將APP從該人的血液中去除。
10.權利要求9的方法，其中使用權利要求1-8中任一項的試劑盒。
11.權利要求7或8所定義的Aβ-模擬表位在製備權利要求1所定義的聯合療法中使用的治療或預防AD的試劑中的用途。
全文摘要
本發明涉及預防或治療阿爾茨海默病(AD)的方法。根據所述方法，對人施用誘導血漿中澱粉狀蛋白β(Aβ)被捕捉的手段，並用包含固定的載體的單採血液成份術裝置處理該人，該固定載體可與血液或血漿流接觸，並包含結合澱粉狀蛋白β前體蛋白(APP)的載體，通過該單採血液份術裝置將APP從該人的血液中去除。本發明還涉及用於實施該方法的試劑盒。
文檔編號A61M1/34GK101022825SQ200580023830
公開日2007年8月22日 申請日期2005年7月6日 優先權日2004年7月13日
發明者弗蘭克·馬特納, 沃爾特·施爾特 申請人:阿法裡斯研發有限責任公司