Uch677蛋白及其編碼基因在調控植物生長發育中的應用的製作方法
2023-10-10 04:12:24
Uch677蛋白及其編碼基因在調控植物生長發育中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種UCH677蛋白及其編碼基因在調控植物生長發育中的應用。該應用為由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質或其編碼基因在調控植物如下1)-10)中至少一種的生長發育中的應用：1)種子重量；2)種子體積；3)種子粒長；4)種子粒寬；5)種子粒厚；6)單穗種子數；7)植株株高；8)植株葉長；9)植株葉寬；10)植株穗長。實驗證明，在水稻的發育過程中，將水稻中UCH677蛋白表達水平上調，可導致水稻種子表現出如下表型：比野生型水稻種子相比，種子重量增加、體積增大，同時單穗種子數增多；另外，從植株表型上來說，與野生型相比，過表達植株的株高更高。本發明為找出更簡單的創製作物高產性狀的思路和方法奠定了基礎。
【專利說明】UCH677蛋白及其編碼基因在調控植物生長發育中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物分子生物學【技術領域】，涉及一種UCH677蛋白及其編碼基因在調控植物生長發育中的應用。
【背景技術】
[0002]從上世紀70年代以來，雜種優勢利用為我國水稻生產做出了重大的貢獻。面臨我國經濟發展對農業生產所提出「高產、優質、高效、安全、生態」的新的重大需求，能否進一步發掘雜種優勢的應用潛力以應對，就成為擺在當代科學家面前的一個嚴峻挑戰。
[0003]雜種優勢的形成基於兩個不同親本的組合。要在現有應用的基礎上進一步發掘其潛力，除了需要加強雜種優勢形成機制的研究之外，還急需建立有效的方法來創造雄性不育性狀，以便有效擴大雜交組合的篩選和優秀組合在生產上的應用。
[0004]目前，在育種工作和生產上廣泛應用的雄性不育性狀多來自於自然突變及其性狀轉育株系。雄性不育性狀的來源十分有限，是擴大雜交組合篩選特別是應用的嚴重製約因子。按照目前國際通行的規則，所有具有應用潛力的創新都受到智慧財產權保護。因此，尋找新的、具有自主智慧財產權的創製人工控制作物種子大小及產量的思路和方法，已經成為希望把握髮掘雜種優勢應用潛力主動權的國家和地區所面臨的無法迴避、亟待解決的關鍵問題之一。
[0005]長期以來， 人們一直利用常規育種的方法選育雜交作物，這些方法周期長、見效慢，不能滿足生產發展的迫切需要。基因工程方法相比傳統方法具有一些特點:選育周期縮短，育性相對穩定，受環境影響小，對基因型依賴少，環境汙染少。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種UCH677蛋白及其編碼基因在調控植物生長發育中的應用。
[0007]本發明所提供的應用，具體為由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質(命名為UCH677蛋白)或其編碼基因(命名為UCH677基因)在調控植物如下1)-10)中至少一種中應用:
[0008]I)種子重量；
[0009]2)種子體積；
[0010]3)種子粒長；
[0011]4)種子粒寬；
[0012]5)種子粒厚；
[0013]6)單穗種子數；
[0014]7)植株株高；
[0015]8)植株葉長；
[0016]9)植株葉寬；[0017]10)植株穗長。
[0018]上述應用具體體現在:所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的UCH677蛋白在所述植物中的表達量越高，所述植物的種子重量越重、和/或種子體積越大、和/或種子粒長越長、和/或種子粒寬越寬、和/或種子粒厚越厚、和/或單穗種子數越多、和/或植株株聞越聞、和/或植株葉長越長、和/或植株葉寬越寬、和/或植株穗長越長；所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的UCH677蛋白在所述植物中的表達量越低，所述植物的種子重量越輕、和/或種子體積越小、和/或種子粒長越短、和/或種子粒寬越窄、和/或種子粒厚越薄、和/或單穗種子數越少、和/或植株株高越矮、和/或植株葉長越短、和/或植株葉寬越窄、和/或植株穗長越短。
[0019]由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的(UCH677蛋白)或其編碼基因(UCH677基因)在選育具有如下I)-X)目的性狀中至少一種的植物品種中的應用也屬於本發明的保護範圍:
[0020]I)種子重量增加或減少；
[0021]II)種子體積增大或減小；
[0022]III)種子粒長增長或減短；
[0023]IV)種子粒寬增寬或變窄；
[0024]V)種子粒厚增厚或變薄；
[0025]VI)單穗種子數增加或減少；
[0026]VII)植株株高增高或變矮；
[0027]VIII)植株葉長增長或減短；
[0028]IX)植株葉寬增寬或變窄；
[0029]X)植株穗長增長或減短。
[0030]在實際應用中，當所選育的植物品種為種子重量增加、和/或種子體積增大、和/或種子粒長增長、和/或種子粒寬增寬、和/或種子粒厚增厚、和/或單穗種子數增加、和/或)植株株高增高、和/或植株葉長增長、和/或植株葉寬增寬、和/或植株穗長增長的植物品種時，需將所述UCH677蛋白表達量較高的植株作為親本進行雜交。當所選育的植物品種為種子重量減少、和/或種子體積減小、和/或種子粒長減短、和/或種子粒寬變窄、和/或種子粒厚變薄、和/或單穗種子數減少、和/或植株株高變矮、和/或植株葉長減短、和/或植株葉寬變窄、和/或植株穗長減短的植物品種時，需將所述UCH677蛋白表達量較低的植株作為親本進行雜交。
[0031]本發明的再一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0032]本發明所提供的培育轉基因植物的方法，具體可為如下(A)或⑶:
[0033](A)培育具有如下bl)_bl0)目的性狀中至少一種的轉基因植物的方法，包括如下步驟:
[0034]a)向目的植物中導入由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因，得到表達所述編碼基因的轉基因植物；
[0035]b)從步驟a)所得轉基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下bl)_blO)目的性狀中至少一種的轉基因植物:
[0036]bl)種子重量增加；[0037]b2)種子體積增大；
[0038]b3)種子粒長增長；
[0039]b4)種子粒寬增寬；
[0040]b5)種子粒厚增厚；
[0041]b6)單穗種子數增加；
[0042]b7)植株株高增高；
[0043]b8)植株葉長增長；
[0044]b9)植株葉寬增寬；
[0045]blO)植株穗長增長；
[0046](B)培育具有如下dl)-dl0)目的性狀中至少一種的轉基因植物的方法，包括如下步驟:
[0047]c)在目的植物中對由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因進行抑制表達，得到轉基因植物；
[0048]d)從步驟c)所得轉基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下dl)-dl0)目的性狀中至少一種的轉基因植物:
[0049]dl)種子重量減少；
[0050]d2)種子體積減小；
[0051]d3)種子粒長減短；
[0052]d4)種子粒寬變窄；
[0053]d5)種子粒厚變薄；
[0054]d6)單穗種子數減少；
[0055]d7)植株株高變矮；
[0056]d8)植株葉長減短；
[0057]d9)植株葉寬變窄；
[0058]dlO)植株穗長減短。
[0059]在上述應用或方法中，所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質(UCH677蛋白)的編碼基因(UCH677基因)是如下(I)至(3)中任一所述的DNA分子:
[0060](I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0061](2)在嚴格條件下與(I)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子；
[0062](3)與⑴或⑵所限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子。
[0063]上述嚴格條件可為用6XSSC，0.5% SDS的溶液，在65°C下雜交，然後用2XSSC，
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。
[0064] 其中，序列2由534個核苷酸組成，為所述UCH677基因的編碼序列(ORF);序列2編碼序列表中序列I所示的蛋白質，序列I由177個胺基酸殘基組成。
[0065]在上述方法(A)中，所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因具體是通過重組表達載體的形式導入所述目的植物中的。
[0066]所述重組表達載體可用現有的植物表達載體構建。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表達載體。所述植物表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端。使用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛素基因Ubiquitin啟動子(PUbi)、脅迫誘導型啟動子rd29A等，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用重組表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學試劑標記基因等。也可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。
[0067]在本發明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述UCH677基因基因轉錄的啟動子具體為Actin啟動子。
[0068]更為具體的，所述重組表達載體為將所述UCH677基因基因插入到pCAM23A載體的多克隆位點後得到的重組質粒；在本發明的一個實施例中，所述多克隆位點具體為Xba I和Sal I。
[0069]在上述方法⑶中，所述在目的植物中對所述UCH677蛋白的編碼基因進行抑制表達，可為任何可降低 所述目的植物中所述UCH677基因的表達的方法。
[0070]在上述培育轉基因植物的方法㈧和方法⑶中，將攜帶有所述UCH677基因的所述重組表達載體或所述UCH677基因的所述RNA幹擾表達載體導入所述目的植物，具體可為:通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。
[0071]在上述各應用或各方法中，所述植物即可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。在本發明中，所述植物具體為單子葉植物水稻，如水稻品種中花11。
[0072]在上述各應用或各方法中，所述葉長和所述葉寬均具體為旗葉的葉長和葉寬。
[0073]實驗證明，在水稻的發育過程中，本發明通過基因過表達技術，將水稻中UCH677蛋白及其編碼基因表達水平上調，可導致水稻種子表現出如下表型:比野生型水稻種子相t匕，種子重量增加、體積增大(粒長、寬、厚均增加)，同時單穗種子數增多；另外，從植株表型上來說,與野生型相比,過表達植株的株高更高、葉長、葉寬和穗長均增加。本發明為找出更簡單的創製作物高產性狀的思路和方法奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0074]圖1為T1代轉入過量表達載體pCAM23A_UCH677ox的轉基因水稻的PCR鑑定結果。其中，泳道M為DNA分子量標準，各條帶從大到小依次為5000，3000，2000，1000，750，500，300，200bp ;泳道1-7為鑑定陽性的植株，8為未轉基因的野生型水稻中花11。[0075]圖2為T1代轉入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉基因水稻中UCH677基因的實時螢光定量PCR檢測。其中，WT表示未轉基因的野生型水稻中花11 ;677ox表示1\代轉入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉基因水稻。以未轉基因的野生型水稻中花11中UCH677基因的表達量為I。*表示與WT相比差異顯著(P〈0.05)。
[0076]圖3為UCH677基因各遺傳材料水稻植株表型。其中，WT表示為未轉基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示鑑定陽性的T1代轉入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉基因水稻植株。
[0077]圖4為UCH677基因各遺傳材料水稻植株的株高、旗葉的葉長和葉寬的統計結果。其中，A為株高；B和C分別為旗葉的葉長和葉寬。A-C中，WT表示未轉基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉基因水稻，*表示與WT相比差異顯著(P〈0.05)。
[0078]圖5為UCH677基因各遺傳材料水稻稻穗表型。其中，WT表示未轉基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉基因水稻植株。
[0079]圖6為UCH677基因各遺傳材料水稻單穗種子數。其中，ZHll表示未轉基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉基因水稻植株，*表示與ZHll相比差異顯著(P〈0.05)。
[0080]圖7為UCH677基因各遺傳材料水稻籽粒表型。其中，WT表示未轉基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉基因水稻植株。
[0081]圖8為UCH677基因各遺傳材料水稻籽粒的粒長、粒厚和粒寬的統計結果。其中，A、B和C分別為粒長、 粒寬和粒厚。A-C中，WT表示未轉基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉入重組表達載體pCAM23A-UCH677ox的轉基因水稻，*表示與WT相比差異顯著(Ρ〈0.05)。
[0082]圖9為UCH677基因各遺傳材料水稻種子的千粒重。其中，ZHll表示未轉基因的野生型水稻中花11 ；677οχ表示T1代轉入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉基因水稻植株，*表示與ZHll相比差異顯著(P〈0.05)。
[0083]圖10為UCH677基因各遺傳材料水稻種子的結實率。其中，ZHlI表示未轉基因的野生型水稻中花11 ；677ox表示T1代轉入過量表達載體PCAM23A-UCH6770X的轉基因水稻植株。
【具體實施方式】
[0084]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0085]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0086]PCAM23A載體:北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。記載於「池正昌.水稻減數分裂基因OsSGOl功能研究與分析.揚州大學，2010年，碩士論文」一文中。pCAM23A載體上自帶的位於Xba I上遊的啟動子是Actin啟動子。
[0087]水稻品種中花11號:購自於中國農業科學院作物研究所；由中國農科院作物所1979年用京風五號/特特普/福錦進行花培。記載於「倪丕衝.水稻花培新品種一中花11號.作物品種資源，1989年04期」。
[0088]農桿菌EHA105:北京全式金生物工程有限公司。[0089]下述實施例中獲得轉基因植物的過程中所涉及的培養基如下: [0090]1、水稻愈傷誘導及繼代培養基(粳稻)NB基本培養基
[0091]
【權利要求】
1.由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質或其編碼基因在調控植物生長發育中的應用； 所述植物生長發育，具體體現在如下1)-10)中至少一種: 1)種子重量； 2)種子體積； 3)種子粒長； 4)種子粒寬； 5)種子粒厚； 6)單穗種子數； 7)植株株高； 8)植株葉長； 9)植株葉寬； 10)植株穗長。
2.由序列表中序列I所不的氣基酸序列組成的蛋白質或其編碼基因在選育具有如下D-X)目的性狀中至少一種的植物品種中的應用: I)種子重量增加或減少； 11)種子體積增大或減小； III)種子粒長增長或減短； IV)種子粒寬增寬或變窄； V)種子粒厚增厚或變薄； VI)單穗種子數增加或減少； VII)植株株高增高或變矮； VIII)植株葉長增長或減短； IX)植株葉寬增寬或變窄； X)植株穗長增長或減短。
3.培育轉基因植物的方法，為如下⑷或⑶:(A)培育具有如下bl)-bl0)目的性狀中至少一種的轉基因植物的方法，包括如下步驟: a)向目的植物中導入由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因，得到表達所述編碼基因的轉基因植物； b)從步驟a)所得轉基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下bl)_blO)目的性狀中至少一種的轉基因植物: bl)種子重量增加； b2)種子體積增大； b3)種子粒長增長； b4)種子粒寬增寬； b5)種子粒厚增厚； b6)單穗種子數增加； b7)植株株高增高；b8)植株葉長增長； b9)植株葉寬增寬； blO)植株穗長增長； (B)培育具有如下dl)-dlO)目的性狀中至少一種的轉基因植物的方法，包括如下步驟: c)在目的植物中對由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因進行抑制表達，得到轉基因植物； d)從步驟c)所得轉基因植物中得到與所述目的植物相比，具有如下dl)-dlO)目的性狀中至少一種的轉基因植物: dl)種子重量減少； d2)種子體積減小； d3)種子粒長減短； d4)種子粒寬變窄； d5)種子粒厚變薄； d6)單穗種子數減少； d7)植株株高變矮； d8)植株葉長減短； d9)植株葉寬變窄； dlO)植株穗長減短。
4.根據權利要求1- 3中任一所述的應用或方法，其特徵在於:所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因是如下(I)至(3)中任一所述的DNA分子: (1)序列表中序列2所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與⑴所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子； (3)與(I)或⑵所限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的DNA分子。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於:所述(A)中，所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因是通過重組表達載體的形式導入所述目的植物中的。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於:所述重組表達載體中，啟動所述由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白質的編碼基因轉錄的啟動子為Actin啟動子。
7.根據權利要求1-6中任一所述的應用或方法，其特徵在於:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
8.根據權利要求7所述的應用或方法，其特徵在於:所述單子葉植物為水稻。
【文檔編號】C07K14/415GK104004074SQ201410228344
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】王東輝, 白書農, 許智宏 申請人:北京大學