平滑肌細胞增殖的調節的製作方法

2023-10-10 13:19:59 1

專利名稱：平滑肌細胞增殖的調節的製作方法
技術領域：
本發明涉及平滑肌細胞增殖的調節，尤其是涉及血管內皮生長因子在增強平滑肌細胞增殖，及治療與平滑肌細胞增殖減少相關疾病上的新應用。
PDGF/VEGF生長因子家族包含許多結構上相關的生長因子。該家族成員含有一個保守的富含半胱氨酸的區域，即半胱氨酸結(Sun，P.D.1995)，它通過鏈間二硫鍵共價連接，形成二聚體(Potgens et al.1994，Andersson et al.1992)。血小板來源的生長因子(PDGF)對包括成纖維細胞和平滑肌細胞在內的結締組織細胞具有促有絲分裂活性(綜述於Heldin et al.1999)。PDGF由相異的A鏈和B鏈的異二聚體組成，並激活兩個受體酪氨酸激酶，PDGFR-α和PDGFR-β。PDGF mRNA在正常細胞類型範圍內被表達，並可能涉及腫瘤發生及其它疾病過程(Heldin et al.1999)。此外，PDGF-B基因作為v-sis致癌基因由轉化逆轉錄病毒攜帶(Devare et al.，1983)，表明其過度表達可致癌。
血管內皮細胞生長因子涉及新血管形成及血管通透性(綜述於FerraraDavis-Smyth，1997，Neufeld et al.，1999)。到目前為止，五種內源VEGFs(VEGF-A，-B，-C，-D和胎盤生長因子(PLGF))已被描述過。VEGF的信號傳遞是通過一個受體酪氨酸激酶家族(FerraraDavis-Smyth，1997，Neufeld et al.，1999)進行的，儘管最近顯示神經菌毛素1也是VEGF-A的一些同工型的受體(Soker et al.，1998)。
VEGF-A在若干包括心臟、胎盤和胰腺的正常組織中被表達(Berse etal.，1992)。在許多腫瘤中VEGF-A顯示出被過度表達(Takahashi etal.，1995)，並且在動物模型中，VEGF-A作用的抑制顯示出會導致腫瘤的消退(Kim et al.，1993)。VEGF-A也與其它涉及不恰當血管發生的疾病過程相關(Folkman 1995)。VEGF-B mRNA在正常組織中的表達與VEGF-A的表達重疊，但在中樞神經系統中也是可檢測的(Lagercrantz et al.，1998)。VEGF-C以低於VEGF-A和VEGF-B的表達水平被表達(Lagercrantz et al.，1998)，但在一系列組織中可以檢測到(Lee et al.1996，Fitz et al.，1997)。VEGF-D在肺、心臟和小腸中強表達，且在若干其它組織中也可以檢測到(Yamada etal.，1997)。
通過檢索EST資料庫，結果鑑定了一個VBGF/PDGF家族新成員。所鑑定的多肽序列含一個N-末端CUB結構域和一個C-末端PDGF結構域，該多肽被命名為血管內皮生長因子-X(VEGF-X；專利WO 0037641；EMBL編號AX028032)。相同序列最近被公布，並顯示具有PDGF活性(Lietal.，2000)，被命名為PDGF-C，這兩種命名可交替使用。Li等人發現PDGF-C的C-末端PDGF結構域具有PDGFR結合活性，並刺激成纖維細胞增殖，反之，全長PDGF-C不顯示該活性。他們提出一種模型，該模型中，CUB結構域的功能是作為PDGF結構域的抑制物激活作用是通過蛋白質水解以釋放活性PDGF-C。
在尿道和膀胱壁中，平滑肌細胞在控制膀胱功能上起著重要作用。已證實平滑肌細胞數量的增加可治療充溢性尿失禁和膀胱功能障礙(Yokoyama et al.，2000)。作為一種治療方法，可直接注射平滑肌細胞(成肌細胞)於尿道和膀胱壁中，以增加細胞數量。
另一方面，已知動脈平滑肌細胞增生會導致多種疾病，且阻斷這種不希望有的細胞水平事件的試劑可用於對這些疾病的藥物定向治療中。動脈粥樣硬化，一種大動脈的疾病，是心臟病及中風的主要原因。在西方社會，它是大約50％死亡的基本原因。動脈粥樣硬化症是一種進展性疾病，該病的特徵是在大動脈中積累了脂類及纖維成分。血管壁細胞，尤其是平滑肌細胞(SMCs)的過度生長，促成了動脈粥樣硬化症的發病(Lusis，AJ，2000)。一種可阻斷平滑肌細胞增殖和遷移的治療方法足以預防內膜增生，並也可促進血管癒合過程。在當前血管介入環境中，高的再狹窄率提高了對內膜增生，即一種在血管壁損傷後出現的慢性結構病變的重要性的注意，該結構病變可引起腔狹窄和血管閉塞。內膜增生被定義為血管平滑肌細胞的異常遷移和增殖，並伴隨細胞外結締組織基質的沉積(Hagen P.O.，et al.1994)。心臟移植動脈粥樣硬化是限制受體長期存活的主要原因之一。其特徵是由增殖的平滑肌細胞組成的內膜增厚，由於動脈壁的廣泛損傷，這種內膜增厚可能發生在吻合位點(Suzuki J.et al.2000)。對平滑肌細胞病理性過度增殖的預防可被用於減少癒合微動脈吻合時的內膜增生，及移植動脈的內膜增生(Robert C.，et al.，1995)。抑制平滑肌細胞外膜細胞的生長將有助於減少由冠狀動脈血管成形術引起的新內膜增生。在糖尿病受試者的膀胱病變中，膀胱或腎肥大和腎增生是公認的。平滑肌的過度增殖也能由於慢性和/或急性膀胱出口阻塞而引起膀胱和腎功能不可逆的改變(Mumtaz FH，et al 2000)。
現在已經令人驚訝地發現，重組的全長VEGF-X和CUB結構域蛋白質在體外都顯示出對人動脈平滑肌細胞具有促有絲分裂活性，這表明CUB結構域除了維持PDGF結構域潛伏狀態的作用外還具有一個功能。因此，VEGF-X及提高平滑肌細胞增殖的CUB結構域可能在治療尿失禁、膀胱功能障礙與其它由平滑肌細胞組成的括約肌的功能障礙上具有優勢。在重建骨盆底時，也可利用VEGF-X和CUB結構域以改善平滑肌功能。
因此，根據本發明的第一個方面，提供了編碼VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或變體的核酸分子在製造可於體內或體外刺激平滑肌細胞增殖的藥物上的應用。優選地，VEGF-X多肽序列如

圖1(a)所示。本發明也提供了VEGF-X的CUB結構域或功能等同物、衍生物或其變體於體內或體外刺激平滑肌細胞增殖的應用，該CUB結構域的優選由如圖1(a)所示40-150位的胺基酸序列組成。上述多肽、CUB結構域和核酸分子也可被用作藥物，或用於製備可治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙或其它與功能性VEGF-X或CUB結構域蛋白質表達降低相關的疾病或狀況的藥物，或用來製備用於骨盆底重建的藥物。本發明的另一方面提供了VEGF-X或其CUB結構域在體內或體外組織工程應用中，用平滑肌細胞構成基質的用途。
本發明的DNA分子可被方便地包含在適合的表達載體中，以在適合的宿主中表達由其編碼的VEGF-X。如Sambrook et al.，(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press所提供的，將克隆DNA摻入適合的表達載體，以進行該細胞隨後的轉化和轉化細胞的篩選的方法為本領域的技術人員所熟知。
本發明的表達載體包括具有一個本發明的核酸的載體，該核酸可操作地連接於能夠影響所述DNA片段表達的調控序列上，例如啟動子區。術語「可操作地連接」指一種並置關係，其中所描述的成分處於一種允許它們以其指定方式發揮功能的關係當中。這樣的載體可被轉化到適合的宿主細胞中，以表達本發明的多肽。
這種表達載體也可被用於刺激平滑肌細胞增殖，並也可被用在對本發明的包括尿道功能障礙、膀胱功能障礙或其它與功能性VEGF-X蛋白質表達減少相關疾病在內的疾病或狀況的治療中。
本發明的多肽可以是重組的、合成的或天然存在的，但優選是重組的。同樣，可採用重組或合成技術，例如，採用PCR克隆原理，製備本發明的核酸序列。
根據另一方面，本發明提供了含有治療有效量的本發明多肽的藥物組合物的應用，該組合物包含例如多肽的可溶解形態、或本發明的核酸分子、或摻入了與藥學可接受載體或賦形劑結合的所述核酸分子的載體。這樣的載體包括，但不僅限於鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其組合。根據發明的這一方面，藥物組合物可被用於刺激在組織和器官中的平滑肌細胞增殖，或可選地，治療或預防尿道、膀胱或括約肌的功能障礙，或與發明的VEGF-X多肽的異常內源性活性相關的功能障礙中的任意一種。
本發明進一步涉及藥物包裝和試劑盒，二者含一個或多個充滿一種或多種上述發明組合物的成分的容器。多肽及其它本發明的化合物可被單獨應用或與其它化合物，例如治療化合物聯合應用。
本發明的蛋白質或多肽(此處兩種術語可交替使用)此處被定義為包括由本發明的核酸分子編碼的所有可能的胺基酸變體，包括被所述分子編碼的多肽，且具有保守胺基酸改變。保守胺基酸取代指在一種蛋白質中的一個或多個胺基酸的替代，該替代並不影響蛋白質的功能或表達。本發明的蛋白質或多肽此處被進一步定義為包括這種序列的變體，包括天然存在、基本上與所述蛋白質或多肽同源的等位變體。在上下文中，基本同源性被看作是至少有70％、優選80％或90％和優選95％的胺基酸與本發明的核酸分子編碼的蛋白質或多肽同源的序列。本發明的蛋白質或多肽的「功能等同物」包含所有如本發明方法和應用所要求的、上文中預見的顯示VEGF-X活性的胺基酸和等位變體。本發明的蛋白質或多肽可以是重組體、合成物或天然存在的，但優選是重組的。
本發明的蛋白質或多肽此處也被定義為包括所述蛋白質或多肽的生物前體。該生物前體是能夠在生物過程中被轉化成具有如發明所要求的VEGF-X活性的蛋白質或多肽的分子。發明的核酸或蛋白質可被用作藥物，或用於製備治療癌症或其它與VEGF-X蛋白質表達相關疾病或狀況的藥物。
本發明的核酸分子或蛋白質可連同其藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑被方便地提供在藥物組合物中。
本發明進一步涉及通過採用反義技術在體內抑制VEGF-X。通過反義DNA或RNA的三螺旋結構形成，反義技術可被用於控制基因表達，兩種方法均基於多核苷酸與DNA或RNA的鍵合。例如，編碼本發明蛋白質的5』編碼部分或成熟DNA序列，可被用於設計一種長度為10-50個鹼基對的反義RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被設計成與涉及轉錄的基因的一個區域互補(三螺旋-見Lee et al.Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al.，Science，241456(1988)；以及Dervanet al.，Science，2511360(1991))，從而阻止VEGF-X的轉錄及產生。
因此，本發明也提供了一種治療或預防動脈粥樣硬化症、因動脈吻合術或球囊導管導致的新內膜增生、因經皮經腔冠狀血管成形術後的動脈擴張(stenting)導致的血管成形術後再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的與編碼VEGF-X多肽的核酸分子反義的多核酸分子，例如可雜交與圖1(a)的核酸，或其在高嚴格性條件下的互補序列雜交的反義多核苷酸分子，其濃度足夠治療或預防所述病症。
高嚴格性條件通常包括溫度超過30C、典型地超過37℃、優選地超過45C。嚴格的鹽條件通常低於1000mM，典型地低於500mM，優選地低於200mM。
根據給藥途徑，例如通過全身或口服途徑可調整組成。全身給藥的優選形式包括注射、典型地通過靜脈注射。其它注射途徑，如皮下、肌內或腹膜內也可被採用。
全身給藥的可選方法包括採用滲透劑，如膽鹽或梭鏈孢酸或其它去汙劑，經黏膜和經皮給藥。另外，如果本發明的多肽或其它化合物可被製劑化為腸道製劑或膠囊化製劑，口服給藥也是可能的。這些化合物的給藥也可是體表的和/或局部的，以藥膏、糊劑、凝膠等形式。
所需的劑量範圍取決於本發明的肽或其它化合物的選擇、給藥途徑、製劑的性質、受試者狀況的性質、及參與的實施者的判斷。儘管如此，合適的劑量仍在0.1-100mg/kg受試者體重範圍內。不過，鑑於可用化合物的多樣性及不同給藥途徑的不同功效，仍然期望在需要劑量上有廣泛的變化。
例如，口服給藥預期需要的劑量高於靜脈注射給藥的劑量。正如本領域內所熟知的，這些劑量水平上的變化可採用標準經驗程序調整優化。
此處所用的術語「治療有效量」，意指本發明的VEGF-X、或其它活性物質的量，當根據預期治療計劃給藥時，該劑量會得到預期的治療效果或反應、或提供希望的益處。
優選的治療有效量是可刺激平滑肌細胞增殖的量。
此處所用的「藥學可接受的」意指從毒性或安全的角度出發，通常適合於對哺乳動物，包括人類給藥。
本發明中，VEGF-X蛋白質典型地給藥一段足夠的時間，直到達到預期治療效果。此處所用「直到達到預期治療效果」，意指根據選擇的給藥方案，持續給予一種或多種治療劑，直到臨床醫生或研究者觀察到被調節的疾病或狀況有尋求的臨床或醫學效果的時間為止。對本發明的治療方法而論，化合物被持續給藥直到在骨質或結構上觀察到有預期的變化為止。在這些實例中，預期的目標是達到平滑肌細胞的增加。對降低疾病狀態或狀況危險的方法而論，只要需要就儘可能長時間地持續給藥化合物，以預防不希望發生的狀況。
兩種或兩種以上平滑肌細胞增殖的刺激物的聯合也被認為在本發明的範圍內。
「多核苷酸」通常指任何多聚核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，可以是未修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA。「多核苷酸」不加限制地包括單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區混合物DNA、單鏈和雙鏈RNA、及單鏈和雙鏈區混合物RNA、雜交分子，該雜交分子包含可以是單鏈、或更典型的是雙鏈、或單鏈與雙鏈區域混合物的DNA或RNA。另外，「多核苷酸」指包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區。
術語「多核苷酸」也包括含有一個或多個已修飾鹼基的DNAs或RNAs，及為了穩定性或其它原因而修飾過主鏈的DNAs或RNAs。「已修飾」鹼基包括，例如，三苯甲基化的鹼基、非常見鹼基如次黃嘌呤核苷。對DNA和RNA可進行若干種修飾；這樣，「多核苷酸」包括自然界中典型發現的多核苷酸的化學、酶學或代謝的修飾形式，也包括病毒和細胞的特徵性的DNA和RNA的化學形式。「多核苷酸」也包括相對短的多核苷酸，常常指寡核苷酸。
「多肽」指任何含有兩種或兩種以上，通過肽鍵或已修飾肽鍵彼此連接的胺基酸的肽或蛋白質，即，肽等排物。「多肽」指短鏈和長鏈，短鏈一般指肽、寡肽或寡聚物，長鏈通常指蛋白質。多肽可含有除了20個基因編碼胺基酸以外的胺基酸。
「多肽」包括通過自然方法，如翻譯後加工，或通過本領域內已熟知的化學修飾技術修飾的胺基酸序列。這些修飾方法在基礎課本、更為詳細的專著、及大量文獻中有很好的描述。修飾可以發生在多肽的任何位置，包括肽主鏈，胺基酸側鏈和氨基或羧基末端。應當理解在特定多肽的若干位點上，相同類型的修飾可能表現相同或不同的程度。同樣，特定多肽可含有許多修飾類型。多肽可由於遍在蛋白化作用而有分支，且可為具有或無分支的環狀。環狀、分支和分支的環狀多肽可由翻譯後自然加工產生，或通過合成方法製成。修飾包括乙醯化作用、醯化作用、ADP核糖基化作用、醯胺化作用、黃素的共價連接、亞鐵原卟啉部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂類或脂類衍生物的共價連接、磷脂醯肌醇的共價連接、交聯、環化作用、二硫鍵形成、脫甲基作用、共價交聯形成、半胱氨酸鍵形成、焦穀氨酸鹽形成、甲醯化作用、γ羧化作用、糖基化作用、GPI錨形成、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、豆蔻醯化作用、氧化、蛋白水解加工、磷酸化作用、異戊二烯化作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸化作用、轉運RNA介導的胺基酸添加到蛋白質，例如精氨醯化作用、及遍在蛋白化作用(見，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，2nc Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，NewYork，1993；Wold，F.，Post-translational Protein ModificationsPerspectives and Prospects，pages.1-12 in POSTTRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，New York，1983；Selfter et al.，「Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors」，Meth Enzymol(1990)182626-646和Rattan et al.，「Protein SynthesisPost-translational Modifications and Aging」，Ann NYAcad Sci(1992)66348-62)。
含有任何上述修飾的多肽可被描述為本發明的蛋白質或多肽的「衍生物」。
本發明進一步涉及用於鑑定VEGF-X生物學活性的抑制劑的篩選方法。這些抑制劑包括中和性VEGF-X抗體、反義VEGF-X序列或與VEGF-X生物學活性競爭的非蛋白拮抗劑。適合的抗體可由適當的免疫原，例如分離的和/或重組抗原，或其部分(包括合成分子，如合成肽)，或表達重組抗原的宿主細胞刺激產生。另外，表達重組抗原的細胞，如轉染細胞，可被用作免疫原，或用於對結合受體的抗體進行篩選(舉例見，Chuntharapai et al，J Immunol.，159.-17831-1789(1994)。
抗體產生細胞，優選的是脾或淋巴結的那些抗體產生細胞，可獲得自經感興趣的抗原免疫過的動物。融合細胞(雜交瘤)可採用選擇性培養條件進行分離，並通過有限稀釋進行克隆。可通過適合的分析方法(例如ELISA)選擇出產生具有期望特異性的抗體的細胞。
因此，本發明也提供了治療或預防動脈粥樣硬化症、因動脈吻合術或球囊導管導致的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張導致的血管成形術後再狹窄中的任何一種的方法，該方法包括給予上述受試者一定量的能結合於如圖1(a)中所示VEGF-X多肽，或其表位的抗體，其濃度足夠治療或預防上述病症。
適用於本發明的抗VEGF-X抗體的特徵在於高親和力結合於VEGF-X受體。抗VEGF-X的抗體可通過吸入法給藥(如，加入吸入劑或噴霧劑中，或作為噴霧的薄霧)。其它給藥途徑包括鼻內、口服、包括輸注和/濃注(bolus)的靜脈內、真皮下、經皮的(如，在緩釋聚合物中)、肌內、腹膜內、皮下、局部的、硬膜外、頰等途徑。也可採用其它適合的給藥途徑，例如，通過上皮、或黏膜皮膚襯細胞達到吸收的目的。抗體也可通過基因療法給藥，其中編碼特定治療蛋白質或肽的DNA分子可通過，例如載體的方法給予病人，該載體可引起特定蛋白質或肽在體內於治療水平被表達和分泌。另外，抗VEGF-X抗體可連同其它生物學活性試劑的成分給藥，如藥學可接受表面活性劑(例如，甘油酯)，賦形劑(例如，乳糖)，載體、稀釋劑和運載體。抗VEGF-X抗體可在其它治療方案或試劑(如，多藥物方案)之前、同時或序貫地，預防性或治療性地給個體用藥。與其它治療劑同時給藥的抗VEGF-X抗體，可以在相同或不同組合物中給藥。抗VEGF-X抗體可與藥學可接受腸胃外運載體一起被製劑化成溶液、懸液、乳劑或凍乾粉。
VEGF-X抗體的治療有效量可根據症狀性質和範圍、同時進行的治療、及預期效果等因素以單次或分開劑量給藥(如，按日、周或月的時間間隔分成系列劑量)，或以持續釋放形式給藥。
另一方面，提供了激動劑和拮抗劑的篩選檢驗方法，該方法包括測定候選化合物對本發明的VBGF-X或CUB結構域多肽結合於VEGF-X受體的效果。特別地，該方法包括將VEGF-X受體與本發明的VEGF-X或CUB結構域多肽和候選化合物接觸，並且確定VEGF-X或CUB結構域多肽與VEGF-X受體的結合是否由於候選化合物的存在而增加或減少。在這個測定方法中，VEGF-X或CUB結構域多肽的結合超過標準結合的增加，表明候選化合物是VEGF-X或CUB結構域的激動劑。與標準相比，VEGF-X或CUB結構域多肽結合的減少表明化合物是VEGF-X或CUB結構域的拮抗劑。
從下列實施例，並參考附圖，可以更清晰地理解本發明。其中圖1(a)是PDGF-C的cDNA序列說明。預測的PDGF-C翻譯產物示於序列上方，預測信號序列加有下劃線。預測的mRNA剪接剪切事件實心發生部位以實心三角形指示。通過對分離的BAC克隆直接測序，或者通過與EMBL資料庫中的部分BAC序列比較的方法推斷mRNA剪切事件的位置(來自AC0015837的nt.1-374的區域，公布日期2000年4月7日，來自AC009582的nt.375-571的區域，公布日期2000年4月5日)。對斜體指示的nt.900-957區域而論，目前為止還沒有關於剪切事件的資料。從通過PCR分離的變異序列推斷，隱蔽剪切供體/受體位點位於nt.719/720和988/989(空心三角形)。多肽序列中的潛在N連接糖基化位點於方框中表示，且從小於預期長度的PCR片段預測(b)變異PDGF-C蛋白質序列-多肽序列。克隆並測序覆蓋該區域的PCR片段，以展現如圖1(a)所示的隱蔽剪切供體/受體位點。
圖2是PDGF-C結構域與資料庫序列比較說明(A)用其它的人類PDGFs和VEGFs的PDGF結構域與PDGF-C的PDGF結構域進行比對。
(B)用BMPs和神經菌毛素的CUB結構域與PDGF-C的CUB結構域進行比對；蛋白質如指示所示，來自X.laevis，小鼠或小雞。
所有結構域序列來自PFAMA資料庫(Rocchigiani，M.et al.，(1998)Genomics 47，204-216)，並採用CLUSTALW比對程序進行比對(EMBL，Heidelberg，Germany)。表1總結了圖2顯示的蛋白質區域的比較結果。從這些比較中，可以清楚地看出CUB結構域與其它資料庫序列的相似程度高於PDGF結構域與其它資料庫序列的相似程度。
圖3是從PDGF-C的mRNA表達獲得的結果圖示說明(A)組織和癌細胞系中的PDGF-C mRNA分布的RNA印跡分析。採用β肌動蛋白cDNA探針進行的對照雜交表明在每一泳道中有等量的mRNA。PDGF-C mRNA的位置已指示出。
(B)來自組織和癌細胞系的cDNA的PCR分析。對照採用設計用於擴增部分甘油醛-3-磷酸脫氫酶cDNA的引物，表明在擴增反應中存在等量的每種cDNA(未顯示)。
圖4是從PDGF-C(VEGF-X)基因座的FISH圖譜獲得的結果的圖示說明-顯示了一個實例左邊顯示的是在人類染色體上的FISH信號，右邊顯示的是用4』，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的相同有絲分裂圖，以鑑定人類染色體4。同時還顯示了圖解總結每一圓點代表在染色體4上檢測到的雙FISH信號。
圖5是PDGF-C重組蛋白質特性的圖示說明(A)糖基化鏈間二硫化物形成。用表達全長PDGF-C的杆狀病毒感染T.ni Hi5細胞。杆狀病毒感染的昆蟲細胞培養基樣本處理如下泳道1-酶緩衝液+N-糖苷酶F；泳道2-酶緩衝液，無N-糖苷酶F；泳道3-還原的；泳道4-非還原的。蛋白質印跡後的檢測採用抗His6抗體，以檢測導入的C-末端表位標記。
(B)肝素結合。已純化的大腸桿菌來源的全長MBP融合蛋白經過SDS-PAGE，並用考馬斯藍染色凝膠。泳道1-用於肝素柱的上樣部分，泳道2-洗柱，泳道3-高鹽洗脫。
(C)全長和CUB結構域-由大腸桿菌製備的PDGF-C全長融合蛋白(泳道1)和CUB結構域(泳道2)樣品經考馬斯染色的SDS-PAGE。通過不溶物質的重摺疊製備CUB結構域在採用抗-His6抗體的蛋白質印跡實驗中，20和25kDa的主帶均被檢測到，因此推斷25kDa類型含有未剪切信號肽。分子量標準以kDa為單位指示於左側。
圖6是PDGF-C(VEGF-X)或PDGF-C CUB結構域對人類冠狀動脈平滑肌細胞增殖的效果圖示。細胞經所示濃度的大腸桿菌來源的CUB或全長PDGF-C蛋白質處理。
材料及方法VEGF-X的cDNA和部分基因組克隆化基於已知VEGF序列(VEGF-A、B、C和D)中的PDGF樣結構域對圖形顯影(Lee et al.，1996)，並將之用於檢索LifeSeqTM人類EST資料庫(Incyte Genomics Inc.Palo Alto，CA，USA)，檢索顯示出VEGF家族的潛在新成員的部分序列。為延伸cDNA序列，採用Marathon-Ready胎盤和骨骼肌cDNAs進行5』RACE(Clontech，Palo Alto，CA，USA)。然後採用標準聚合酶鏈式反應方法擴增全長編碼序列(Fitz etal.，1997)。將PCR片段克隆進載體pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA.USA)或pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA.USA)中。測序多個克隆以確定編碼序列；所有的亞克隆也同樣通過DNA測序進行驗證。為獲得部分基因組克隆，通過與來源於PDGF-C cDNA序列的寡核苷酸進行雜交，以篩選人類染色體組BAC基因庫(Genome Systems，Inc.，StLouis，MI，USA)。為確定內含子/外顯子邊界，直接採用基於已知cDNA序列的20-mer測序引物對BAC DNA進行測序。採用Qiagen質粒midi試劑盒製備BAC DNA(Qiagen GmbH，Düsseldorf，Germany)。
VEGF-X基因的染色體定位染色體圖譜的研究由See DNA Biotech Inc.(Toronto，Canada)採用如以前描述的生物素化的2.7kb探針(Yamada et al.，1997；Gribsteor et al.，1987，Ausabel et al.，1997)的FISH分析進行。
通過RNA印跡和RT-PCR對VEGF-X mRNA表達的分析將含有來源自不同人類組織的2μg富含poly(A)+的RNA的RNA印跡(Clontech Laboratories；MTNTMblot，MTNTMblot II和癌細胞系MTNTMblot)與a-[32P]-dCTP隨機引物標記的(Multiprime labelling試劑盒，Roche Diagnostics)293bp的特異性PDGF-C片段(包括PDGF-C的3』末端編碼區的9 2bp和3』非翻譯區的201bp的PinAI-StuI片段)雜交。將印跡於68℃雜交過夜，並在68℃於0.1xSSC/0.1％SDS中進行高嚴格性的最終洗滌。用增強屏將膜進行1-3天的放射自顯影。就RT-PCR分析而論，採用寡核苷酸引物GTTTGATGAAAGATTTGGGCTTG和CTGGTTCAAGATATCGAATAAGGTCTTCC對來自PDGF-C的350bp片段進行特異性PCR擴增。PCR擴增是在人類多組織cDNA(MTCTM)板(Clontech人MTC板I和II以及人腫瘤MTC板)上進行，該板標準化為6種不同管家基因的mRNA表達水平。另外，cDNA由不同腫瘤細胞培養物製得(Caco-2結直腸腺癌；T-84結腸直腸癌；MCF-7乳腺腺癌；T-47D乳腺導管腺癌；HT1080骨纖維肉瘤；SaOS-2骨肉瘤；SK-N-MC成神經細胞瘤；HepG2肝胚細胞瘤；JURKAT T細胞白血病和THP-1髓單核細胞白血病)。為製備腫瘤細胞cDNA，將細胞勻漿化，並採用RNeasy Mini試劑盒製備總RNA(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。採用寡(dT)15為引物，及50U的ExpandTM逆轉錄酶(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)對1μg的總RNA進行逆轉錄。然後用PDGF-C特異性或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)特異性引物對1μl該cDNA進行PCR反應。對所有cDNAs，用PDGF-C特異性引物進行的PCR反應於50μl總體積中進行。加熱樣品至95℃，持續30s，並且完成25、30或35個循環操作，每循環包括於95℃ 30s，68℃ 30s。同時進行對照反應，該反應採用了用於擴增管家基因G3PDH的1kb片段的特異引物。
重組蛋白質的表達、純化和檢測對哺乳動物細胞表達而論，擴增全長編碼序列，並將其克隆進載體pcDNA6/V5-His(Invitrogen，Leek，Netherlands)以添加一個C末端His6肽標記，以便輔助檢測與純化。對大腸桿菌表達而論，PCR擴增預測的成熟蛋白質(Glu23-Gly345)的編碼區，以添加一個C末端His6肽標記，然後將其克隆進載體pMAL-p2(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。將得到的MBP融合蛋白質首先在鎳螯合樹脂(Ni-NTA，Qiagen GmbH，Düsseldorf，Germany)上，然後於直鏈澱粉樹脂(New England Biolabs，Beverly，MA)上進行純化。PCR擴增編碼了PDGF-C(Glu23-Val171)的CUB結構域片段的DNA序列，以添加一個C末端His6肽標記，並將其克隆進pET22b(Novagen，Madison，WI)中，用於在大腸桿菌中的分泌。通過標準方法(Fitz et al.，1997)從誘導培養物的周質或不合細胞培養基中製備CUB結構域蛋白質。通過用20％飽和的硫酸銨沉澱初步純化蛋白質。用20mM Tris pH8.0，300mMNaCl透析過夜，以去除硫酸銨，然後採用前述的鎳螯合樹脂進一步純化蛋白質。採用N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals，Brussels，Belgium)進行蛋白質糖基化分析。根據製造商使用說明使用肝素瓊脂糖柱(HiTrap，Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。在其用於基於細胞的分析前，採用可商購試劑盒(COATESTEndotoxin，Chromogenix AB，Sweden)檢驗蛋白質樣品的內毒素汙染。
細胞培養於EGM-2生長培養基(Clonetics，San Diego，CA)中維持人類臍靜脈內皮細胞(HUVECs)(Clonetics，San Diego，CA)，並於骨骼肌生長培養基(Clonetics，San Diego，CA)中培養人類骨骼肌細胞(SkMC)(Clonetics，San Diego，CA)。於補充有10％胎牛血清(FBS)(HyClone，Logen，UT)，6mM Hepes，50I.U./ml青黴素和50μg/ml鏈黴素的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)(Gibco，Gaithersburg，MD)中維持包括HCASMs(Clonetics，San Diego，CA)、大鼠心臟心肌H9c2(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)、及人類新生兒皮膚成纖維細胞(39-SK)(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)在內的細胞。採用4-6代的細胞。於補充有10％FBS、100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素的DMEM中維持人類成骨細胞(MG 63)(美國典型培養物保藏中心，Rockville，MD)。如以前描述的方法(Masure etal.，1998)，將原代軟骨細胞從牛肩分離。於補充有10％FBS、10mMHEPES、0.1mM非必需胺基酸、20μg/ml L-脯氨酸、50μg/ml抗壞血酸、100μg/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素和0.25μg/ml兩性黴素B(軟骨細胞生長培養基)的DMEM(高葡萄糖)中培養原代牛軟骨細胞。所有細胞培養均於37℃、溼化培養箱中、5％CO2和95％空氣的環境中進行。
細胞增殖分析用0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA(Gibco，Gaithersburg，MD)消化HUVECs，並按5,000細胞/孔將其分配於96孔組織培養板中。在細胞貼壁並形成單層(16小時)後，用含有0.5％-2％FBS的DMEM中如所示的不同濃度的VEGF-X刺激細胞。對人類皮膚成纖維細胞而論，生長培養基用含有0.1％BSA、有或無不同濃度VEGF-X的DMEM替代。對MG63、人類SkMC，H9c2或HCASMC而論，培養基用含有0.5％FBS的DMEM替代。將牛軟骨細胞按5,000細胞/孔接種於補充有10％FBS的高葡萄糖DMEM培養基的96孔組織培養板中，並讓其貼壁72h。培養基用含有2％BSA的DMEM替代，進行或不進行處理兩天。對所有的測試細胞而論，經過處理的孵育後，培養基用100ml含有5％FBS和3μCi/ml的[3H]-胸苷替代。脈衝標記後，用甲醇/乙酸(3∶1，體積比)於室溫固定細胞1h。以250ml/孔，用80％甲醇洗滌細胞兩次。將細胞先於0.05％胰蛋白酶(100ml/孔)中處理30min，然後於0.5％SDS(100ml/孔)中再處理30min，以溶解細胞。細胞裂解物的等分物(180ml)與2ml閃爍混合物結合，並用液體閃爍計數器(Wallac 1409)測定細胞裂解物的放射性。
PDGF-C基因的染色體定位及內含子/外顯子結構通過FISH分析將VEGF-X定位於人類染色體4，q31-q32區的長臂上(圖2)。對該探針而論，雜交效率為約70％。資料庫檢索鑑定了兩種攜有VEGF-X序列的基因組BAC克隆(EMBL編號AC009582和AC015837)。這些BAC克隆來源自染色體4，支持FISH數據。分離含有cDNA的3』部分的BAC克隆。通過對該克隆直接測序，可推斷在cDNA的PDGF結構域中剪切事件的位置(圖1中nt.位置1179/1180)。就VEGF-A和VEGF-D而論，剪切位點的位置是保守的(Heng et al.，1993，Hagen et al.，1994)。圖1中所示的其它剪切位點的位置，可從上述資料庫BAC克隆AC009582和AC015837的序列推斷出。
VEGF-X和CUB結構域的測試總結VEGF-X和CUB結構域均不增加人類皮膚成纖維細胞、人類臍內皮細胞、牛軟骨細胞或人類成骨細胞(MG63)的增殖。然而，全長和CUB結構域結構均能夠以劑量依賴方式刺激人類冠狀動脈平滑肌細胞的增殖(圖3)。最佳刺激濃度範圍為1-10μg/ml。全長或CUB結構域結構的效果，於測試的最高濃度，均超過對照水平的四倍(圖2)。我們沒有觀察到CUB結構域對其它肌細胞類型，例如人類骨骼肌細胞或大鼠心肌(數據未顯示)的促有絲分裂活性。去除第三個半胱氨酸或將其突變為一個絲氨酸殘基，我們發現CUB結構域對人類冠狀動脈平滑肌細胞的促有絲分裂活性降低到大約為最高濃度下的一半(10μg/ml)(數據未顯示)。
表1.PDGF-C和相關蛋白質同一性和相似性的成對比較％同一性％相似性CUBNRP_XENLA 35 50NRP_MOUSE 33 46NRP_CHICK 32 48BMP1_XENLA28 44BMP1_HUMAN24 41％同一性％相似性PDGFVEGFB 29 47VEGFD 29 44PDGFB 29 40PDGFA 29 39VEGFA 25 51VEGFC 24 43PLGF 23 42VEGF-Avs VEGF-C 38 51比較在圖2所示的蛋白質區域間進行，用Genedoc程序(http//www.cris.com/~Ketchup/genedoc.shtml)計算。參考文獻Li，X.，Ponten，A.，Aase，K.，Karlsson，L.，Abramsson，A.，Uutela，M.，Backstrom，G.，Bostrom，H.，Li，H.，Soriano，P.，Betsholtz，C.，Helding，C-H.，Alitalo，K.，Ostman，A.Eriksson，U.(2000)PDGF-C is a new protease-activated ligandforthe PDGF -receptor.Nature Cell Biology 2，302-309.Sun，P.D.(1995)The cystine-knot growth factor superfamily.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24，269-291.Potgens，A.J.，Lubsen，N.H.，van Altena，M.C.，Vermeulen，R.，Bakker，A.，Schoenmakers，J.G.，Ruiter，D.J.de Waal，R.M.(1994)Covalent dimerisation of vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factor is essential for itsbiological activity.Evidence from Cysto Ser 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序列表110詹森藥業有限公司120平滑肌細胞增殖的調節130JAB 1687150US 60/2749011512001-03-091606170PatentIn version 3.12101211345212PRT213人(Homo sapiens)4001Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110
Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser245 250 255Val Ser Ile Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr Ile Phe Trp Pro260 265 270Gly Cys Leu Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu275 280 285His Asn Cys Asn Glu Cys Gln Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys290 295300
Tyr His Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu305 310 315 320His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp325 330 335Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly340 3452102211111212PRT213人4002Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn1 5 10 15Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr20 25 30Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln35 40 45Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile50 55 60Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile65 70 75 80Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser85 90 95Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe Val Ser Asp Glu Tyr Phe100 105 110
210321123212DNA213人工序列220
223PDGF-C正向引物4003gtttgatgaa agatttgggc ttg 23210421129212DNA213人工序列220
223PDGF-C反向引物4004ctggttcaag atatcgaata aggtcttee 292105211282212PRT213人4005Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60
His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly245 250 255
Leu His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys260 265 270Asp Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly275 2802106211167212PRT213人4006Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe
130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Ser Asn Arg Gly Gly Lys145 150 155 160Ile Ile Gln Leu His Thr Ser16權利要求
1.下列任意一種物質在製造用於刺激組織和器官中的平滑肌細胞增殖的藥物中的應用編碼包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含所述核酸分子的表達載體、包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體、或包含所述核酸分子、載體或所述VEGF-X多肽中任意一種物質的藥物組合物。
2.下列任意一種物質在製造用於治療或預防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙中的任意一種、或用於骨盆底重建的藥物中的應用編碼包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含所述核酸分子的表達載體、包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體、或包含所述核酸分子、載體或VEGF-X多肽中任意一種物質的藥物組合物。
3.下列任意一種物質在製造用於刺激組織和/或器官中的平滑肌細胞增殖的藥物中的應用包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物或衍生物的CUB結構域、或編碼所述CUB結構域或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含所述核酸分子的表達載體。
4.根據權利要求3的用途，其中所述CUB結構域包含圖1(a)所描述的胺基酸序列的40-150位的多肽。
5.下列任意一種物質在製造用於治療或預防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙中的任意一種、或用於骨盆底重建的藥物中的應用圖1(a)的VEGF-X多肽的CUB結構域、或編碼所述CUB或其功能等同物或衍生物的核酸分子、包含所述核酸分子或所述CUB結構域中任意一種物質的藥物組合物。
6.一種刺激組織或器官中的平滑肌細胞增殖、或刺激受試者中的組織修復的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質編碼包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽的VEGF-X核酸分子、或圖1(a)的VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體，其濃度足夠刺激平滑肌細胞增殖。
7.一種治療或預防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、編碼該多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體，和包含所述核酸分子或所述多肽中任意一種物質的藥物組合物。
8.一種通過施用治療有效量的下列任意一種物質治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、或用於骨盆底重建、治療括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙的方法包含圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體、包含該多肽連同其藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
9.一種刺激組織或器官中的平滑肌細胞增殖、或刺激受試者中的組織修復的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的包含圖1(a)描述的核苷酸序列的40-150位的序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物或衍生物的CUB結構域，其濃度足夠刺激平滑肌細胞增殖。
10.一種治療或預防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質編碼包含圖1(a)描述的胺基酸序列的40-150位的序列的CUB結構域或其功能等同物或衍生物的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體，和包含意所述核酸分子和所述CUB結構域中任意一種物質的藥物組合物。
11.一種治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、或用於骨盆底重建、治療括約肌功能障礙、或與CUB結構域多肽的異常內源活性相關的功能障礙的方法，該方法包括施用治療有效量的包含圖1(a)描述的胺基酸序列的40-150位的多肽的CUB結構域多肽或其功能等同物或衍生物、包含該CUB結構域及其藥學可接受載體、稀釋劑或其賦形劑的藥物組合物中的任意一種物質。
12.一種可結合於包含一個圖1(a)的胺基酸序列的VEGF-X多肽或其表位的抗體在製造用於治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任意一種的藥物中的應用。
13.一種治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的在高嚴格性條件下，可雜交於編碼圖1(a)的VEGF-X多肽的核酸分子、或其互補序列的反義多核苷酸分子，其濃度足夠治療或預防所述病症。
14.一種治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的圖1(a)的VEGF-X多肽的拮抗劑，其濃度足夠治療或預防所述病症。
15.一種治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的可結合於圖1(a)的VEGF-X多肽或其表位的抗體，其濃度足夠治療或預防所述病症。
16.一種診斷受試者中病理學狀況或對病理學狀況易感性的方法，該方法包括(a)測定生物樣品中圖1(a)的VEGF-X多肽或其受體的突變的存在與否；及(b)基於VEGF-X多肽或其受體的表達程度，診斷病理學狀況或對病理學狀況的易感性。
17.一種鑑定抑制或增強平滑肌細胞增殖的化合物的方法，該方法包括在圖1(a)的VEGF-X多肽的存在下，使表達VEGF-X受體的細胞接觸該化合物，並監測與沒有和所述化合物接觸的細胞相比，所述化合物對所述細胞的作用。
18.一種用於直接遞送圖1(a)的VEGF-X多肽的拮抗劑，或編碼所述多肽的核酸分子的反義分子，或可結合於所述VEGF-X多肽或其表位的中和抗體的方法，該方法包括經由栓子切除術導管的球囊尖端給予所述拮抗劑、反義分子或抗體，以限制牽張損傷後的新內膜增生。
19.下列任意一種物質在製造用於刺激組織和器官中的平滑肌細胞增殖的藥物中的應用編碼VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體、VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、或者包含所述核酸分子、或所述VEGF-X多肽中任意一種物質的藥物組合物。
20.下列任意一種物質在製造用於治療或預防尿道、膀胱或括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙中的任意一種、或用於骨盆底重建的藥物中的應用編碼VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體、VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、或者包含所述核酸分子、或所述VEGF-X多肽中任意一種物質的藥物組合物。
21.下列任意一種物質在製造用於刺激組織和/或器官中的平滑肌增殖的藥物中的應用VEGF-X多肽的CUB結構域、或編碼該CUB結構域、或其功能等同物、或衍生物的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體、包含該CUB結構域、核酸分子或表達載體中的任意一種物質的藥物組合物。
22.根據權利要求21的應用，其中所述CUB結構域包含圖1(a)描述胺基酸序列的40-150位的多肽。
23.下列任意一種物質在製造用於治療或預防尿道、膀胱或括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙、或用於骨盆底重建的藥物中的應用VEGF-X多肽的CUB結構域、或編碼該CUB結構域、或其功能等同物、或衍生物的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體、包含該CUB結構域、核酸分子或表達載體中的任意一種物質的藥物組合物。
24.一種刺激組織或器官中的平滑肌細胞增殖、或刺激受試者中組織修復的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的編碼VEGF-X多肽的核酸分子、或VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體，其濃度足夠刺激平滑肌細胞增殖。
25.一種治療或預防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質VEGF-X多肽、編碼該多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體和包含該核酸分子或該多肽中的任何一種物質的藥物組合物。
26.通過施用治療有效量的下列任意一種物質治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙或者用於骨盆底重建的方法VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前體、一種包含該多肽連同其藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
27.一種刺激組織或器官中的平滑肌細胞增殖，和所述受試者中組織修復的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的VEGF-X多肽或其功能等同物或衍生物的CUB結構域，其濃度足夠刺激平滑肌細胞增殖。
28.一種治療或預防尿道功能障礙、膀胱功能障礙、骨盆底重建、括約肌功能障礙、或與VEGF-X多肽的異常內源活性相關的功能障礙中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的下列任意一種物質編碼CUB結構域或其功能等同物、衍生物或生物前體的核酸分子、包含該核酸分子的表達載體、和包含該核酸分子和該CUB結構域中的任意一種物質的藥物組合物。
29.一種治療尿道功能障礙、膀胱功能障礙、括約肌功能障礙、或與CUB結構域多肽的異常內源活性相關的功能障礙，或者用於骨盆底重建的方法，該方法包括施用治療有效量的下列任意一種物質CUB結構域、包含該CUB結構域多肽或其功能等同物、或其衍生物及藥學可接受載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。
30.一種可結合於VEGF-X多肽或其表位的抗體在製造用於治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任何一種的藥物中的應用。
31.一種治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任何一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的編碼VEGF-X多肽的核酸分子的反義分子，其濃度足夠治療或預防所述病症。
32.一種治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的VEGF-X多肽的拮抗劑，其濃度足夠治療或預防所述病症。
33.一種治療或預防動脈粥樣硬化、因動脈吻合術或球囊導管引起的新內膜增生、因經皮經腔冠狀動脈血管成形術後動脈擴張引起的血管成形術後再狹窄中的任意一種的方法，該方法包括給予所述受試者一定量的可結合於VEGF-X多肽或其表位的抗體，其濃度足夠治療或預防所述病症。
34.一種診斷受試者中的病理學狀況或對病理學狀況的易感性的方法，該方法包括(a)測定生物樣品中VEGF-X多肽或其受體的突變的存在與否；及(b)基於VEGF-X多肽或其受體的表達程度，診斷病理學狀況或對病理學狀況的易感性。
35.一種鑑定抑制或增強平滑肌細胞增殖的化合物的方法，該方法包括在VEGF-X多肽的存在下，使表達VEGF-X受體的細胞接觸該化合物，並監測與沒有和所述化合物接觸的細胞相比，所述化合物所述細胞的作用。
36.一種用於直接遞送VEGF-X多肽的拮抗劑，或編碼所述多肽的核酸分子的反義分子，或可結合於所述VEGF-X多肽或其表位的中和抗體的方法，該方法包括經由栓子切除術導管的球囊尖端給予所述拮抗劑、反義分子或抗體，以限制牽張損傷後的新內膜增生。
全文摘要
本發明提供了血管內皮生長因子，此處命名為VEGF－X，和VEGF－X的序列中的CUB結構域的一種新應用，它們增強平滑肌細胞增殖，並且可用於治療與平滑肌細胞增殖減少相關的疾病。VEGF－X和CUB結構域也可被用於組織工程應用，增加特定組織內部平滑肌細胞數量，以恢復該組織功能或結構。本發明也公開了用於確定VEGF－X生物活性抑制劑的篩選方法，這些抑制劑包括中和性VEGF－X抗體，反義VEGF－X序列，或與VEGF－X生物活性競爭的非蛋白拮抗劑。本發明也提供了與平滑肌細胞過度增殖相關病症的治療方法，及對與平滑肌細胞過度增殖相關的病理學狀況、或與平滑肌細胞過度增殖相關的病理學狀況易感性的診斷方法。
文檔編號A61K48/00GK1568194SQ02806185
公開日2005年1月19日 申請日期2002年3月7日 優先權日2001年3月9日
發明者J·C·格辛, A·戈西夫斯卡, J·徐, R·戈爾頓, J·約恩, S·N·哈納拉, I·哈裡斯 申請人:詹森藥業有限公司