來源於棉花的miRNA-GhmiRnC及其應用的製作方法

2023-10-10 04:05:09 1

專利名稱：來源於棉花的miRNA-GhmiRnC及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域,尤其涉及一種來源於棉花的HiiRNA-GhmiRnC及其應用。
背景技術：
miRNA (microRNA,微小RNA)是一類長度約為20_24nt的內源單鏈非編碼小分子 RNA,在生物體中廣泛存在(Bartel D P. MicroRNAs:genomics, biogenesis, mechanisms, and function. Cell, 2004，116:281-297. )。近年來大量研究表明，miRNA 能夠調控生物體中許多基因的表達，在調節生長發育、細胞增殖、凋亡、抵禦環境脅迫等諸多方面發揮重要作用(Bushati N, Cohen S M. MicroRNA functions. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. , 2007, 23:175-205.;金龍國，王川，劉進元·植物MicroRNA.中國生物化學與分子生物學報，2006，22:609-614.)。植物miRNA主要通過切割靶基因mRNA，或抑制靶mRNA翻譯，來調控植物個體生長發育並影響其生理過程，是一種新的基因調控模式，具有重要的石開究意義(Voinnet 0. Origin, biogenesis, and activity of plant microRNAs.Cell,2009, 136:669-687.)。棉花是世界最重要的經濟作物之一，同時棉花纖維也是研究單細胞伸長的良好模型。與擬南芥、水稻等模式生物相比，目前已經發現的棉花miRNA數量可謂寥寥無幾，因此通過高通量測序技術，有望挖掘出更多的棉花miRNA，這對於全面了解棉花乃至整個植物miRNA的形成過程、結構特點和功能機制具有現實意義。另外，棉花中miRNA可能在諸多生理過程(如纖維的起始與伸長等)發揮重要功能，但棉花中關於miRNA的生物學功能研究甚少，因此，通過關注特定發育時期、特定組織中的miRNA，有望闡明棉花miRNA參與的生理過程，以及在該過程中具體發揮的作用。我國是世界上主要的棉花生產和消費國，棉花對於我國具有舉足輕重的地位。國內外除了利用常規育種手段之外，逐步運用基因工程技術對棉花纖維產量、品質、抗蟲等進行遺傳改良已經成為了一種趨勢。由於miRNA對植物有廣泛的調控作用，很可能成為植物遺傳改良的重點研究基因之一，因此迫切需要通過大規模測序方法充分挖掘和開發屬於本國智慧財產權的新的miRNA基因，從而為後期定向改良和培育優質性狀的棉花品種奠定基礎。

發明內容
本發明的目的是提供來源於棉花的HiiRNA-GhmiRnC及其應用。本發明提供了 miRNA-GhmiRnC，為單鏈RNA,為序列表的序列I所示的RNA，序列如下(5，一 3，)UAAGUGAAGAAAGAGGUAGGUU。本發明還提供miRNA-GhmiRnC前體(pre_GhmiRnC),為單鏈RNA,為序列表的序列
2所示的 RNA，序列如下(5』 一 3』)GAAGGACAACUAAGUGAAGAAAGAGGUAGGUUUGAAGAAGAAGAUGGUAAGCUGAGUUUAAGAGGAAUGGUGAACUUAAUUGAGAUCAUCUUCUCCUAGUUUUC⑶CACAUGAACCUUUCUUCAUUUAGAUCUUCAAACCAGCCUUUUCUUCACUUAGUUGUCCUUCCo序列I所不RNA或序列2所不的RNA在抑制韓調素結合蛋白基因(TC259543)表達中的應用也是本發明保護的範圍；所述鈣調素結合蛋白的胺基酸序列為序列表的序列3 ；所述鈣調素結合蛋白基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5』末端第194-745位核苷酸。序列I所示RNA或序列2 所示的RNA在促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解中的應用也是本發明保護的範圍；所述鈣調素結合蛋白的胺基酸序列為序列表的序列3 ;所述鈣調素結合蛋白基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5』末端第194-745位核苷酸。其中，促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解為切割鈣調素結合蛋白基因的mRNA。序列I所示RNA或序列2所示的RNA在棉花纖維品質改良中的應用也是本發明保護的範圍。Solexa克服了常規miRNA克隆技術的缺點，具有靈敏度高的優點，能夠檢測出最少一個小RNA分子，並且準確性高，檢出的小RNA分子鹼基錯誤率極低。HiSeq 2000是Illumina公司2010年推出的一款新的測序儀，採用穩定的可逆終止法邊合成邊測序技術。該技術使用4種含有末端阻斷基團和不同螢光信號的鹼基進行模板互補鏈的合成，不僅確保了測序的高精確性和高順序性，而且排除了由重複序列和同聚物導致的測序錯誤。融合了最新的光學系統和製造工藝，該光學系統採用2個雷射源對Flowcell進行掃描，並使用4臺照相機對4種鹼基分別進行記錄，大幅度減少了不同鹼基之間的信號幹擾，提高了測序系統的準確度。同時，HiSeq 2000使用了新穎的雙表面成像技術，增加了 Flowcell的有效面積,從而提高測序產量和降低成本。每個文庫的測序量至少達到1500萬條小RNA序列以上。基於這種最新的測序手段，將有望識別棉花中特定發育時期特定組織特異表達的新miRNA。本發明的實驗證明，本發明採用國際上先進的Solexa高通量測序技術，最新的HiSeq 2000測序儀結合生物信息學分析、5』 RACE等多種生物學手段，首次從基因組水平鑑定到miRNA-GhmiRnC，並且證實GhmiRnC的靶基因為鈣調素結合蛋白，該基因參與了棉花纖維伸長和次生壁增厚的發育調控，這都將為棉花的品質育種(如提高棉纖維產量)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價值和社會效益，並最終用於實際生產。本發明提供的miRNA廣泛參與了棉花多種生命活動的調節，具有重要的生物學意義和潛在應用價值。


圖I為小RNA測序數據中分離和鑑定新miRNA的流程圖。圖2為棉花開花後5天、10天、15天、20天和25天纖維小RNA庫中GhmiRnC的測序數；所有數字均代表歸一化為每1，000萬「乾淨」序列(「乾淨」序列見小RNA文庫中新的miRNA的鑑定部分中的解釋)中的數目。圖3為GhmiRnC的前體二級結構圖。圖4為GhmiRnC的靶基因5』 RACE驗證；序列上方的箭頭表示發生切割的位點，數值表示該切點處發生切割的克隆數與克隆總數比值。圖5為實時定量RT-PCR檢測靶基因的表達；誤差線表示相對標準偏差。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的％,如無特殊說明,均為質量百分含量。以下實施例中所用棉花品種均為陸地棉中棉35 (Gossypium hirsutumcv. CRI35)，棉花種子來源於中國農業科學院棉花研究所。編號國審棉990005。實施例I、miRNA-GhmiRnC 的發現 一、樣品採集棉花於每年四月下旬種植于田間，常規作業，開花前一天花苞套袋，防止花粉傳播造成異花傳粉，開花當天除袋，並掛牌標記。分別收取開花後5、10、15、20、25天的棉鈴，去除棉鈴殼，將種子及纖維迅速凍存於液氮，保存於-80°C備用。二、miRNA-GhmiRnC 的發現I、RNA 提取用研杵在裝有液氮的研缽中敲擊棉花纖維及種子，進而將纖維和種子剝離，取出種子，研磨纖維，研磨過程中加入PVP (按1/5質量比)以防止酚類氧化，用PUreLink PlantRNA Reagent (Invitrogen)提取總RNA,操作步驟如下(以O. Ig材料為例,相應試劑量可根據材料量按比例調整)①磨好的纖維粉末加入到Iml提取緩衝液中，加20μ 1β-巰基乙醇，混勻後置於室溫10-15分鐘。4度12000轉/分離心5分鐘，將上清轉至新的離心管，加入100 μ I5MNaCl，混勻後加入300 μ I氯仿，充分混勻，4度12000轉/分離心10分鐘，將上清轉至新的離心管；②將轉出的溶液依次用氯仿、酚、酚氯仿(I :1)、氯仿抽提，經四次抽提後的上清液轉入新的離心管，加入100 μ I多糖去除劑(北京華越洋生物科技有限公司)，混勻後加入200 μ I氯仿，充分混勻，4度12000轉/分離心10分鐘，將上清轉至新的離心管；③加入等體積的異丙醇，混勻後置-20度I小時以上，4度12000轉/分離心10分鐘，棄上清，離心得到的沉澱用75%的乙醇洗滌，晾乾後溶於適量的DEPC水中，得到總RNA。使用Ultrospec 3000型紫外分光光度計(Amersham Biosciences)測定提取的RNA在260nm (OD260)和280nm (OD280)波長的吸光度值以確定RNA的純度和濃度。質量合格的RNA濃度應在I μ g/μ I以上，0D26(i/0D28(i的比值在I. 8-2. O之間，且經電泳檢測條帶清晰，無明顯降解和DNA汙染。2、小RNA文庫的構建將質量檢驗合格的棉花纖維總RNA用於構建小RNA文庫。5個不同時期的纖維樣品提取的RNA各取10 μ g，分別用於構建小RNA文庫。小RNA文庫的構建按照IlluminaSample Preparation Protocol文庫構建方法進行,構建好的文庫採用Illumina公司新一代高通量測序儀HiSeq 2000測序(北京華大基因研究中心)，獲得高質量的18_30nt的小RNA序列。3、小RNA文庫中新的miRNA的鑑定
參考之前國外文獻對高通量測序數據分析的成功方法(Jones-RhoadesM W， Bartel D P.Computational identification of plant miRNAs and theirtargets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell，2004，14:787-799.)，建立一套計算機分析方法用來發現和鑑定測序數據中的棉花miRNA (分析流程如圖I所示)。①將獲得的5個小RNA文庫中的原始序列通過計算機方法去掉3』接頭，並過濾掉序列長度在ISnt以下的序列，獲得所謂的「乾淨」序列庫；②將「乾淨」的序列與國際權威的miRNA資料庫 miRBase (19) (http: //microrna. sanger.ac.uk/sequences/)中公布的 miRNA 成熟序列進行BLAST，從而發現哪些序列來自於已知的miRNA，已知miRNA超過2個錯配的序列再進入下一步分析將排除了保守miRNA的序列再與其它非編碼RNA資料庫Rfam(10. I)進行序列比對，從而發現哪些序列來自於rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等非編碼RNA，過濾掉這些序列，剩下的序列中可能含有新的miRNA，稱為潛在miRNA序列庫； 將潛在miRNA 序列庫中的序列與已有的棉花資料庫進行BLAST，資料庫包括棉花EST(http://C0mpbi0.dfci. harvard, edu)、棉花GSS (NCBI)、以及已有的部分雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)的基因組序列。將找到的棉花資料庫中對應的序列進行下一步分析。⑥使用miRNA前體結構預測軟體 mireapO. 2 (http: //sourceforge. net/pro jects/mireap),對獲取的棉花資料庫中有小RNA對應的序列進行二級結構分析,若能形成類似miRNA前體(pre-miRNA)的良好莖環結構則該序列可以認為是候選的新miRNA;⑦對候選的新的miRNA繼續進行篩選，考察候選的新miRNA序列所在的莖環結構前體的小RNA分布特徵，若主要分布在候選的新miRNA區域以及對應的miRNA*區域,則認為該候選的新miRNA序列高度可信，是真實的 miRNA 序列(Meyers B C，Axtell M J, Bartel B, Bartel D P, Baulcombe D, Bowman JL, Cao X, Carington J C, Chen X, Green P J, et al. Criteria for annotation of plantmicroRNAs. Plant Cell, 2008, 20:3186-3190.)。鑑定到I個新的miRNA，命名為GhmiRnC。GhmiRnC 的序列如下(5，一 3』)UAAGUGAAGAAAGAGGUAGGUU (序列 I)。開花後5、10、15、20和25天5個獨立的棉花纖維小RNA文庫中能夠獨立鑑定到GhmiRnC序列，測序數分別為187，645，516，332和33 (經歸一化處理後每1，000萬測序數中的數目)。結果見圖2。miRNA前體(pre_miRNA)序列的二級莖環結構是miRNA基因最顯著的特點之一,也是所有miRNA鑑定方法都不可逾越的重要規則。 GhmiRnC 前體(pre-GhmiRnC)序列如下(5，一 3』)GAAGGACAACUAAGUGAAGAAAGAGGUAG⑶ UUGAAGAAGAAGAUG⑶ AAG ⑶GA⑶ UUAAGAGGAAUG⑶GAA ⑶ UAAUUGAGAUCAU ⑶腳 C ⑶CGUCACAUGAACCUUUCUUCAUUUAGAUCUUCAAACCAGCCUUUUCUUCACUUAGUUGUCCUUCC (序列表的序列2)。pre-GhmiRnC能形成良好的莖環結構，成熟的miRNA從miRNA前體的莖部產生,完全符合miRNA前體的結構特徵(圖3，紅色部分(左側加深)指示成熟miRNA所在的位置，藍色部分(右側加深)指示miRNA*所在的位置。)。實施例2、miRNA的靶基因預測與驗證由於植物miRNA與靶基因mRNA近乎完全互補，因此可以通過生物信息學方法預測 GhmiRnC 的祀基因。採用在線軟體 psRNATarget (http://plantgrn. noble, org/psRNATarget/)在棉花EST資料庫CGIll中尋找到能與miRNA序列近乎完全互補的cDNA或基因，即為miRNA的靶標；參數設置為=PsRNATarget程序參數為默認設置，靶標的功能通過NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)同源性檢索，以同源性最高的已知功能基因進行注釋。預測結果見表I。表IGhmiRnC的靶基因及功能
GhmiRnC的靶基因為鈣調素結合蛋白(CaMBP)基因TC259543 (基因序列為序列表的序列4，編碼區為序列表中序列4自5』末端第194-745位核苷酸，其編碼的蛋白見序列表的序列3)。該類基因能夠參與代謝調節，細胞骨架功能，逆境脅迫，響應植物激素等過程，也參與了棉花纖維伸長的發育調控(Bouche N, YellinA, SneddenWA, et al.Plant-specific calmodulin-binding proteins. Annu Rev PlantBiol,2005,56:435-466. ；Preuss M L, Delmer D P, Liu B.The cotton kinesin-likecalmodulin—binding protein associates with cortical microtubules in cottonfibers. Plant Physiol,2003，132 (I):154-160.)。實施例3、miRNA對靶基因mRNA的切割GhmiRnC對靶基因TC259543 (見序列表的序列4)mRNA的切割用5』 RACE方法進行驗證(Jones-Rhoades M ff, Bartel D P. Computational identification of plant miRNAsand their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell, 2004, 14:787-799. X靶基因mRNA被miRNA切割後，其較為穩定的3』切割產物5』端核苷酸磷酸基團暴露，用T4RNA連接酶在該切割產物5』端連接上5』 RACE專用接頭；通過反轉錄反應合成cDNA ;通過靶基因特異的巢式外引物和試劑盒所帶的巢式外引物進行第一輪PCR，靶基因特異的巢式內引物和試劑盒所帶的巢式內引物進行第二輪PCR ;將5』 RACE獲得的PCR產物連接到pMD19-T載體(TaKaRa)後測序，就能知道精確的靶基因mRNA切割位點。I、分別提取實施例I的步驟一製備的各種棉花纖維樣品的總RNA。2、按Firstchoice RLM-RACE試劑盒(Ambion)操作說明進行5』 RACE,靶基因特異的巢式外弓I物的序列為CAACTCTCTTACCACACAAAATGC，靶基因特異的巢式內引物的序列為AATCCCTTCCTTTTTAATTGCCTCAC。3、得到140bp PCR產物進行瓊脂糖電泳，回收特異條帶。4、將回收的PCR產物連接到pMD 19-T載體(TaKaRa)，並轉化大腸桿菌DH5 α。5、挑單克隆測序，根據測序結果確定靶基因mRNA的切割位點。測序結果顯示的切割位點見圖4。GhmiRnC的靶基因在與其互補的區域發生了切害I]，這個結果強有力的證明了 TC259543確實是GhmiRnC體內真正調控的靶基因。
實施例4、靶基因的表達量分析為了進一步考察GhmiRnC的功能，用實時定量RT-PCR分別檢測靶基因TC259543在開花後5、10、15、20和25天的棉花纖維中的表達情況。I、分別提取實施例I的步驟一製備的棉花纖維樣品的總RNA。2、總RNA加入DNase I (TaKaRa)，室溫放置30min以除去基因組DNA的汙染。3、加入終止緩衝液(50mM EDTA)後，70°C加熱IOmin以變性DNase I和RNA。4、採用TaKaRa RNA PCR KU，用RNA合成cDNA模板，操作按試劑盒說明書進行。5、米用 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)在iCycler iQ5Multicolor實時定量PCR檢測儀(Bio-Rad)上進行PCR擴增反應，通過比較 Ct 值法(Δ Δ Ct 值法)(Schmittgen T D. Real-Time Quantitative PCR.Methods, 2001, 25:383-385.)計算靶基因在不同樣品中的相對表達量(對照組基因的表達量設定為I)。靶基因的檢測設置3個重複，結果取平均值。以棉花UBQlO基因作為內參(ffalford S A. , Wu Y R. , Llewellyn D J and Dennis E S. (2011)GhMYB25-like:a keyfactor in early cotton fibre development. Plant J, 65 (5)，785-97)。擴增靶基因TC259543的引物如下(5，— 3，):上遊引物CCTCAAATTTTCAATGTCACAAGG；下遊引物TACAGCACAATAGGGAATCCAAGC。·
擴增UBQ10基因引物如下(5，— 3，):上遊引物CCAGAAGGAATCCACTTTGC；下遊引物CCAGCTCACATCAGCATACG。結果見圖5，靶基因TC259543在纖維發育過程中表達量發生了明顯的變化，通過和GhmiRnC在5個小RNA庫中測序數的表達(圖2)進行比較，發現TC259543的表達和GhmiRnC的表達呈現出負相關性，在開花後5天到10天的纖維中GhmiRnC表達主要呈明顯上調的趨勢，TC259543的表達量呈現明顯下調的趨勢；10天到20天，GhmiRnC呈現下調的趨勢，TC259543表達量上調；這與miRNA對靶基因的負調控作用是完全一致的，20天之後，次生壁起始，棉花纖維細胞內的代謝流向纖維素合成，miRNA在纖維伸長過程中對TC229676的調控作用結束，與靶標mRNA的表達同時下降。實時定量PCR的結果進一步證明了 TC259543確實是GhmiRnC的靶基因。
權利要求
1.序列表的序列I所示的RNA。
2.序列表的序列2所示的RNA。
3.權利要求I或2所述RNA在抑制鈣調素結合蛋白基因表達中的應用；所述鈣調素結合蛋白的胺基酸序列為序列表的序列3。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述鈣調素結合蛋白基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5』末端第194-745位核苷酸。
5.權利要求I或2所述RNA在促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解中的應用；所述鈣調素結合蛋白的胺基酸序列為序列表的序列3。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述鈣調素結合蛋白基因的核苷酸序列為序列表的序列4或序列表中序列4自5』末端第194-745位核苷酸； 所述促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解為切割鈣調素結合蛋白基因的mRNA。
7.權利要求I或2所述RNA在棉花纖維品質改良中的應用。
全文摘要
本發明公開了來源於棉花的miRNA-GhmiRnC及其應用。本發明保護的miRNA-GhmiRnC是序列表的序列1所示的RNA。本發明保護的miRNA-GhmiRnC前體(pre-GhmiRnC)是序列表的序列2所示的RNA。本發明還保護序列1所示RNA在抑制鈣調素結合蛋白基因表達和/或促進鈣調素結合蛋白基因的mRNA降解中的應用。所述鈣調素結合蛋白如序列表的序列3所示。所述鈣調素結合蛋白基因如序列表的序列4所示。應用miRNA-GhmiRnC有望獲得在棉花纖維長度，強度有重要表型的植株，具有重要的生物學意義和潛在應用價值，將為棉花的品質育種(如培育抗逆性棉花)提供寶貴的基因資源，帶來一定的研究價值和社會效益，並最終用於實際生產。
文檔編號A01H5/00GK102925442SQ20121039891
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月19日 優先權日2012年10月19日
發明者劉進元, 薛偉, 王正明 申請人:清華大學