一種檢測丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法

2023-10-10 22:24:04

一種檢測丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法
【專利摘要】一種檢測丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法，屬於免疫分析領域。本發明用丁香假單胞菌丁香致病變種NCPPB2844（來自湖南省進出口檢驗檢疫局）免疫8周齡BALB/c小鼠，經免疫、細胞融合、篩選得7株單抗。7株單抗分別標記HRP並以NCPPB2844作標準品兩兩配對。以13B10抗體為包被抗體（CGMCCNo.9801單克隆細胞株L），13B10抗體標記HRP後為酶標抗體（13B10-HRP），以NCPPB2844為標準品建立了丁香致病變種的夾心ELISA法。LOD：2.4×104cfu/mL，線性範圍4.57×104~1.11×108cfu/mL。本發明用理化性質高度均一、特異性好、可大量製備的單抗建立的夾心法靈敏度高，成本低，特異性好，為丁香致病變種的檢測提供快速高效的分析手段。CGMCC No.98012014.10.15
【專利說明】一種檢測丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法

【技術領域】
[0001]本發明涉及了一種檢測丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法，屬於酶聯免疫分析領域。

【背景技術】
[0002]丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)是一種常見植物致病菌,屬於革蘭氏染色陰性細菌假單胞菌屬(Pseudomonas)。假單胞菌是一類重要的植物病原菌，主要侵染十字花科植物引起葉片或根莖的疾病。丁香假單胞菌可以引發多種植物產生超敏反應，可使40多種植物致病，引發植物的葉片、根莖等處疾病，而且該菌還是一種冰核細菌，可使植物在較高溫度下產生凍害。丁香假單胞菌的部分成員具有宿主特異性，根據其寄主植物的不同以及所引發症狀的不同可分為40多種致病變種.Λ 丁香假單胞菌丁香致病變種，學名:Pseudomonas syringae pv.syringae, 丁香屬植物發病後出現葉部壞死斑,嚴重時病斑迅速擴散最終導致失去觀賞價值和綠化價值，因此研究並提出相應的綜合防治建議具有非常重要的意義。
[0003]對丁香假單胞菌丁香致病變種的傳統檢測技術耗時長，且檢測結果存在不可靠性。PCR檢測方法快速、準確、靈敏，但是技術條件高，設備昂貴，普及推廣受到很大限制。
[0004]建立丁香假單胞菌丁香致病變種的有效而且便捷快速的檢測方法有利於對丁香屬植物的檢驗、檢疫。而ELISA方法憑藉其靈敏、快速、特異性好、易於推廣的特點成為致病菌的常規檢測方法。抗體的親和力、交叉反應、穩定性對於ELISA方法的靈敏度和特異性有著關鍵性的決定作用。
[0005]因此本發明製備了高靈敏的丁香假單胞菌丁香致病變種的單克隆抗體並以此為基礎建立了雙抗體夾心ELISA法，為丁香屬植物中丁香假單胞菌丁香致病變種的大批量、快速、準確的檢測奠定基礎。


【發明內容】

[0006](一 )要解決的技術問題
本發明的目的在於建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯免疫吸附檢測方法，用於丁香屬植物中丁香假單胞菌丁香致病變種的大批量、快速、準確檢測。
[0007]( 二 )技術方案
為實現上述目的，本發明建立了一種丁香屬植物中丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心檢測方法，該方法包括對檢測方法的優化。
[0008]其中，單克隆抗體是採用丁香假單胞菌丁香致病變種菌體NCPPB 2844經過特定免疫程序免疫BALB/c小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選得到的。
[0009]其中，用於配對的抗體是通過優化參數下夾心法配對，並通過多次試驗篩選確定的，具有穩定性好、靈敏度高的特點。
[0010]其中，建立的夾心法優化了包被抗體的濃度，包被液，封閉液，標準品稀釋液，酶標抗體稀釋液，酶標抗體稀釋濃度。LOD達到了 2.4X104 cfu/mL。
[0011]一種基於單克隆抗體的檢測丁香屬植物中丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法，步驟為:
(1)丁香假單胞菌丁香致病變種單克隆抗體的製備
以丁香假單胞菌丁香致病變種NCPPB 2844 (來自湖南省進出口檢驗檢疫局)菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選，共篩選到7個細胞株；
(2)單克隆抗體的配對篩選
將純化後的7株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑑定標記成功後進行夾心法配對；配對參數如下:包被抗體2 μ g/mL ;包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩衝液；標品濃度I X 108cfu/mL ;標品稀釋液0.01M、pH7.2的PBS+0.2%Tween ;酶標抗體稀釋500倍使用；在此條件下，實驗成功得到了 5對P/N值>2.1的配對；
(3)夾心法的建立
選擇檢測限穩定、靈敏的配對，即以編號13B10抗體即CGMCC N0.9801單克隆細胞株L作為包被抗體，編號13B10抗體標記辣根過氧化酶HRP後作為酶標檢測抗體13B10-HRP，建立夾心法；具體參數如下:
包被抗體13B10濃度:2 μ g/mL ；
包被液:0.01M、pH 9.6碳酸鹽緩衝液；
標品稀釋液:0.01M、pH7.2 PBS+0.2%Tween ；
酶標檢測抗體13B10-HRP濃度:2.5 μ g/mL ；
反應時間:包被抗體:封閉37°C，反應a ;標準品:37°C，反應Ih ;酶標檢測抗體37°C，反應Ih ;顯色時間1min。
[0012]丁香假單胞菌丁香致病變種夾心法的LOD:2.4X 14 cfu/mL。
[0013]本發明方法的檢測分析原理是:
酶標板上包被了捕獲抗體13B10，合適的濃度下可以最大限度捕獲丁香假單胞菌丁香致病變種；洗板3次，洗去未結合的抗體，加入封閉液220 μ L封閉板孔上多餘結合位點；洗板3次，加入樣品和對照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標抗體13B10-HRP，37°C孵育Ih ；洗板4次，加入顯色液顯色10 min0如果樣品有足夠的丁香假單胞菌丁香致病變種菌體，那麼丁香假單胞菌丁香致病變種菌體被捕獲抗體13B10捕獲並與酶標抗體13B10-HRP結合，並催化底物在450nm產生吸收值，並被判定為陽性(P/N ^ 2.1);如果樣品丁香假單胞菌丁香致病變種菌體濃度太低那麼樣品不被捕獲或者捕獲數量太小不足以引起足夠的信號，被判定為陰性(P/N彡2.1)。
[0014](三)有益效果
本發明提供的丁香假單胞菌丁香致病變種雙抗體夾心檢測方法採用了理化性質高度均一、特異性好、可以大量製備的丁香假單胞菌丁香致病變種單克隆抗體，建立的夾心法靈敏度高，穩定性好、成本低，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測大量樣品，適合丁香屬植物中大規模、高通量、快速、靈敏的檢測要求，具有推廣和應用價值。
[0015]生物材料樣品保藏:一株單克隆細胞株L (又稱13B10)，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2014年10月15日，保藏編號為CGMCC N0.9801。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1 丁香假單胞菌丁香致病變種雙抗體夾心法的標準曲線。
具體實施方案
[0017]以下通過實施例進一步說明本發明。
[0018]一、儀器:
TGL - 40B臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠
KFLOff純水機，凱佛隆公司
ZD - 9556水平搖床，太倉科教器材廠
96孔8X 12可拆酶標板，廈門怡佳美實驗器材有限公司
MuLtiska Mks 酶標儀，Thermo Labsystems 公司
可調試移液器，Thermo Labsystems公司
渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠
二、試劑:
四甲基聯苯胺(TMB)，上海晶純實業有限公司其他試劑均為分析純試劑
三、步驟
1.單抗製備
1)實驗動物:選5隻，8周齡的BALB/c小鼠進行免疫；
2)抗原配置:將免疫原用生理鹽水稀釋，配成IXlO9cfu/mL的溶液；
3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全後皮下多點注射小鼠；
免疫方法:按照特定免疫流程免疫小鼠，3免後用間接競爭法測定效價，效價達到要求後，進行衝刺免疫；衝免3天後眼眶採血後進行融合；
4)採血:第三次免疫後I周進行斷尾採血，採用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血清效價；
5)融合、篩選:採用雜交瘤技術進行融合，採用間接ELISA篩選陽性細胞孔，採用有限稀釋法對陽性孔進行亞克隆；
6)抗體的純化和保存:採用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析後得到單克隆抗體，採用微量紫外方法測定其濃度後分裝，放入-20°C保存。
[0019]2、ELISA 反應過程:
抗體效價測定步驟:
1)將包被原用包被緩衝液作系列稀釋包被96孔酶標板，100μ L/孔，於4 °C冰箱過夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200 UL PBST溶液，搖床上振蕩3 min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍幹，繼續洗滌2次。以下洗滌方法相同；
2)充分洗滌後，用封閉緩衝液封閉酶標板，220yL/孔，於37 °C溫育箱內溫育2h後取出烘乾待用；
3)將陽性血清系列稀釋對應加入到酶標板的前7行列，第8行加入陰性血清，100μ L/孔，37 °C孵育I h後洗滌、拍幹；
4)每孔加入100μ L，1:3000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37°C孵育I h後洗滌、拍幹;
5)每孔加入100μ L顯色液(TMB與底物液比例為1:5)，暗處37°C反應15 min，取出後每孔加入50 μ L終止液(2 mol/L的硫酸)，用酶標僅測定吸光值A45。。
[0020]丁香假單胞菌丁香致病變種雙抗體夾心法測定步驟:
a、包被:用2μ g/mL的13B10包被酶標板，100 μ L /孔，4°C過夜；
b、洗滌:用PBST洗滌反應板三次，每次3min，200μ L/孔，然後甩幹反應板；
C、封閉:含0.2%明膠的CBS, 220 μ L /孔，37°C封閉2h ；
d、洗漆:同b;
e、樣品:用PBST將丁香假單胞菌丁香致病變種稀釋成1.0X109、3.33X 108、1.1lXlO8、3.70X 107、1.23X 107 ,4.1lXlO6、1.37X 106、4.57X 105、1.52X 105 cfu/mL系列濃度，另設一個PBST空白對照。每孔加入100 μ L樣品，於37°C溫育Ih ；
f、洗漆:同b;
g、加酶標抗體(13B10-HRP,2.5 μ g/mL), 100 μ L / 孔，37°C反應 Ih ；
h、洗漆:同b;
1、顯色:加底物TMB100 μ L /孔，顯色1min ; j、終止:加終止液50 μ L /孔；
k、測定:用酶標儀檢測0D45(lnm。
[0021]試驗結果如下:
1、標準曲線:本發明所獲得的抗原檢測的檢測範圍是為4.57X 104^1.llX108cfu/mL,具體請見說明書附圖1。
[0022]2、LOD =LOD是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的標準偏差對應的抗原濃度，丁香假單胞菌丁香致病變種雙抗體夾心法LOD為2.4X 14 cfu/mL。
【權利要求】
1.一種基於單克隆抗體的檢測丁香屬植物中丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法，其特徵在於步驟為: (1)丁香假單胞菌丁香致病變種單克隆抗體的製備 以丁香假單胞菌丁香致病變種NCPPB 2844菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選，得到7個細胞株； (2)單克隆抗體的配對篩選 將純化後的7株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑑定標記成功後進行夾心法配對；配對參數如下:包被抗體2 μ g/mL ;包被液為0.01M、pH9.6的碳酸鹽緩衝液；標品濃度I X 108cfu/mL ;標品稀釋液0.01M、pH7.2的PBS+0.2%Tween ;酶標抗體稀釋500倍使用；在此條件下，實驗成功得到了 5對P/N值>2.1的配對； (3)夾心法的建立 選擇檢測限穩定、靈敏的配對，即以編號13B10抗體即CGMCC N0.9801單克隆細胞株L作為包被抗體，編號13B10抗體標記辣根過氧化酶HRP後作為酶標檢測抗體13B10-HRP，建立夾心法；具體參數如下: 包被抗體13B10濃度:2 μ g/mL ； 包被液:0.01M、pH 9.6碳酸鹽緩衝液；
標品稀釋液:0.01M、pH7.2 PBS+0.2%Tween ； 酶標檢測抗體13B10-HRP濃度:2.5 μ g/mL ； 反應時間:包被抗體:封閉37°C，反應2h ;標準品:37°C，反應Ih ;酶標檢測抗體:37°C，反應Ih ;顯色時間1min。
2.根據權利要求1所述基於單克隆抗體的檢測丁香屬植物中丁香假單胞菌丁香致病變種的雙抗體夾心酶聯免疫法，其特徵在於丁香假單胞菌丁香致病變種夾心法的LOD:2.4 X 14 cfu/mL。
【文檔編號】G01N33/577GK104360069SQ201410688936
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】徐麗廣, 孔德昭, 胥傳來, 匡華, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲, 馮民 申請人:江南大學