一種高通量篩選乳酸菌素的方法與流程
2023-10-10 23:58:29
本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及微生物技術領域，尤其涉及一種高通量篩選乳酸菌素的方法。
背景技術：
乳酸菌素是由益生乳酸細菌在代謝過程中所產生的一類具有較強生物活性的多肽或蛋白質。乳酸菌素由於對病原菌具有高效的抑菌活性且對人畜安全無毒，已在養殖業、食品防腐等眾多領域中得到廣泛應用。
在養殖領域中，目前普遍存在濫用抗生素、消毒劑的現象，不僅導致病原菌耐藥性增加，而且易造成環境汙染，影響人體健康。隨著病原微生物耐藥性的不斷增強，傳統抗生素使用的弊端日漸顯露，抗生素殘留帶來的安全隱患引起了人們的高度重視。而以乳酸菌素為代表的抗菌肽因其獨特的結構和抗菌機制，不易使細菌產生耐藥性；且在動物體內可避免藥物殘留，無免疫原性和細胞毒性，不損傷正常機體細胞。相對於其他蛋白質類的生物製劑，乳酸菌素對溫度、酸鹼、金屬離子、蛋白酶的耐受性強。乳酸菌素產品有望單獨使用或與乳酸菌活菌進行復配，用於飼料拌喂，維持畜禽動物腸道的正常微生態平衡，提高其免疫力，促進生長，因而越來越成為飼料行業的熱門添加劑。
在食品保鮮領域中，乳酸菌素亦具備巨大的市場開發潛力。例如，乳鏈菌肽(Nisin)是一種經聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織確認為安全、高效、可靠的食品防腐劑，並在全世界得到廣泛使用。Nisin天然產自食品級的乳酸乳球菌，對革蘭氏陽性菌呈廣譜抗菌作用，如芽孢桿菌、肉毒桿菌、葡萄球菌、李斯特菌、耐熱腐敗菌、棒桿菌、小球菌、明串球菌、分枝桿菌等；食用後在消化道中很快被蛋白水解酶消化成胺基酸，故不會在體內殘留，也不會改變腸道正常菌群。與其它抗菌肽相比，乳酸菌素的優點是能夠在殺滅病原菌的同時，不殺滅乳酸菌自身，因此有利於維持畜禽腸道正常的微生態平衡。
由於乳酸菌素具有廣闊的應用市場和開發潛力，近年來針對其進行分離篩選的工作也越來越多。乳酸菌素天然存在於多種乳酸菌中，因而可從中篩選分離得到。現有技術中傳統的篩選方法只針對單一或少數幾株乳酸菌進行逐一篩選，通過平板/牛津杯法進行抗菌活性篩選。該方法的特點是批量較小，針對性強，但難以同時對上百株菌進行篩選，效率低下。
技術實現要素：
針對現有技術的不足，本發明提供了一種高通量篩選乳酸菌素的方法，所述方法可快速篩選出針對特定目標指示菌具有顯著抑菌活性的乳酸菌素等抗菌物質，極大地提高了篩選效率。
為達到此發明目的，本發明採用以下技術方案：
第一方面，本發明提供了一種高通量篩選乳酸菌素(又稱乳酸菌肽、乳酸菌抗菌肽)的方法，所述方法包括如下步驟：
(1)培養病原菌；
(2)培養乳酸菌；
(3)在多孔板上加入LB培養基、步驟(1)培養的病原菌發酵液和步驟(2)培養的乳酸菌發酵液上清，在多孔板上共培養8-25h，用酶標儀定時測量OD600的吸光度；
其中，所述多孔板為24孔板、48孔板、96孔板或384孔板中的任意一種或至少兩種的組合。
本發明中，所述乳酸菌產生的乳酸菌素會分泌到細胞外，通過離心將乳酸菌發酵液的上清用於檢測，既可以只測試上清中的乳酸菌素的效果，又可以排除乳酸菌菌體本身對檢測的影響。
本發明，步驟(3)檢測時，由於用多孔板進行，便於做平行試驗，一般會做3個平行試驗，同時也會做多個對照組，採用的對照組為以200μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液+198μL滅菌LB培養基、20μL乳酸菌發酵液上清+180μL滅菌LB培養基為對照。
作為優選技術方案，所述乳酸菌發酵液的上清通過將乳酸菌發酵液進行離心獲得，所述離心轉速為8000-12000g，例如可以是8000g、8100g、8200g、8300g、8500g、8600g、8800g、10000g、10100g、10500g、10600g、10800g、11000g、11300g、11500g、11800g或12000g，優選為10000g；所述離心時間為1-15min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min，優選為3-10min，進一步優選為5min。
本發明中，所述培養時間例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、15h、16h、18h、20h、21h、23h或25h。
優選地，步驟(1)所述的病原菌為蝦致病菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈維弧菌(Vibrio harveyi)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)或溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)中的任意一種或至少兩種的組合。
優選地，所述乳酸菌為從動物消化道及生殖道中分離所得乳酸細菌。
優選地，所述乳酸菌選自但不限於：格氏乳桿菌、發酵乳桿菌、捲曲乳酸桿菌、澱粉乳桿菌、乳酸腸球菌、海氏腸球菌、糞腸球菌、約氏乳桿菌、副乾酪乳桿菌、戊糖乳桿菌、植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、唾液乳桿菌、臺灣乳球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌屬、乳酸片球菌、戊糖片球菌、非解乳糖鏈球菌、海豚鏈球菌、巴黎鏈球菌、唾液鏈球菌、前庭鏈球菌、漫遊球菌屬、食竇魏斯氏菌、融合乳桿菌、赫倫魏斯氏菌、楊氏檸檬酸桿菌、紅樹腸桿菌、齲齒羅氏菌、粘滑羅氏菌、弗氏志賀菌、表皮葡萄球菌或乳酸菌所屬亞種中的任意一種或至少兩種的組合。
所述亞種可以為乳酸乳球菌的乳脂亞種、乳酸亞種、霍氏亞種；唾液乳桿菌的水楊素亞種、唾液亞種。
優選地，步驟(1)所述的培養病原菌的步驟包括活化菌種和擴大培養。
優選地，所述活化菌種的接種量為1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，優選為5％。
優選地，所述擴大培養為將活化的菌種轉接到新鮮滅菌的LB培養基中，所述擴大培養中活化菌種的接種量為0.5-5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％，優選為1％。
優選地，所述活化菌種和擴大培養的溫度為30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，優選為35-38℃，進一步優選為37℃。
優選地，所述活化菌種和擴大培養的轉速為200-300rpm，例如可以是200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm或300rpm，優選為230-280rpm，進一步優選為250rpm。
優選地，所述活化菌種和擴大培養的時間為8-25h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、15h、16h、18h、20h、21h、23h或25h，優選為10-18h，進一步優選為12h。
優選地，所述培養乳酸菌採用多孔板進行培養。
本發明中，採用多孔板進行培養就可以同時培養多種乳酸菌，測試的時候也可以同時將多種乳酸菌進行同時測試。
優選地，步驟(2)所述的培養乳酸菌的步驟包括活化菌種、擴大培養和轉接培養。
優選地，所述活化菌種的接種量為5-15％，，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，優選為10％。
優選地，所述擴大培養為將活化的菌種轉接到新鮮滅菌的MRS培養基中，所述擴大培養中活化菌種的接種量為1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，優選為5％。
優選地，所述活化菌種和擴大培養的溫度為25-33℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃，優選為28-31℃，進一步優選為30℃。
優選地，所述活化菌種和擴大培養的時間為8-25h，例如可以是8h、9h、10h、11h、12h、13h、15h、16h、18h、20h、21h、23h或25h，優選為10-18h，進一步優選為12h。
作為優選技術方案，所述轉接培養為將擴大培養的菌液轉接到新鮮滅菌的MRS培養基中25-33℃培養3-10h，再加入病原菌液，在25-33℃共培養8-25h。
本發明中，加入病原菌液可以誘導乳酸菌素的產生，使原本難以檢測到抑菌活性的部分菌株經刺激後能產生顯著的抑菌活性，增加了篩選到更多乳酸菌素的可能性。
優選地，所述將培養菌種轉接到新鮮滅菌的MRS培養基中的培養條件為28-31℃培養5-8h，優選為30℃培養6h。
優選地，所述加入病原菌液後共培養的條件為28-31℃培養10-18h，優選為30℃培養12h。
優選地，所述轉接培養中擴大培養菌液的接種量為1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，優選為5％。
優選地，所述轉接培養中病原菌液的接種量為0.5-5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％或5％，優選為1％。
優選地，步驟(3)所述的LB培養基、病原菌液和乳酸菌發酵液上清的體積比為(60-100):1:(3-15)，例如可以是60:1:3、61:1:4、62:1:5、65:1:6、68:1:7、70:1:7、73:1:5、75:1:7、76:1:7、78:1:7、80:1:8、82:1:5、83:1:4、85:1:8、86:1:9、87:1:10、88:1:11、89:1:12、90:1:6、92:1:3、95:1:4、96:1:5、97:1:6、98:1:11、100:1:12，優選為(70-90):1:(6-12)，進一步優選為89:1:10。
優選地，所述共培養的時間為10-18h，優選為12h。
優選地，所述共培養的溫度為30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，優選為35-38℃，進一步優選為37℃。
優選地，所述共培養的轉速為200-300rpm，例如可以是200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm、250rpm、260rpm、270rpm、280rpm、290rpm或300rpm，優選為230-280rpm，進一步優選為250rpm。
優選地，所述酶標儀測量的間隔時間為1-5h，例如可以是1h、2h、3h、4h或5h，優選為1-3h，進一步優選為2h。
一種高通量篩選乳酸菌素的方法，包括如下步驟：
(1)培養病原菌：
①活化菌種：按1-10％的接種量將病原菌接種到新鮮滅菌的LB培養基中，置於30-40℃，200-300rpm條件下培養8-25h；
②擴大培養：按0.5-5％的接種量將活化的菌種接種到新鮮滅菌的LB培養基中，置於30-40℃，200-300rpm條件下培養8-25h；
(2)培養乳酸菌：
①活化菌種：按5-15％的接種量將乳酸菌接種到新鮮滅菌的MRS培養基中，置於25-33℃條件下靜置培養8-25h；
②擴大培養：按1-10％的接種量將活化菌種接種到新鮮滅菌的MRS養基中，置於25-33℃條件下靜置培養8-25h；
③轉接培養：按1-10％的接種量將擴大培養的菌種接種到新鮮滅菌的MRS培養基中25-33℃靜置培養3-10h，再以0.5-5％的接種量接入培養的病原菌液，在25-33℃靜置共培養8-25h；
(3)在96孔板上將LB培養基、步驟(1)培養的病原菌發酵液和步驟(2)培養的乳酸菌發酵液上清按體積比為(60-100):1:(3-15)，在96孔板上30-40℃，200-300rpm的條件下共培養8-25h，用酶標儀每1-5h測量OD600的吸光度。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
(1)本發明在多孔板上進行篩選，可快速篩選出針對特定目標病原菌具有顯著抑菌活性的乳酸菌素等抗菌物質，能夠同時對幾百株菌進行挑選，極大地提高了篩選效率；
(2)本發明通過加入病原菌液可以誘導乳酸菌素的產生，使原本難以檢測到抑菌活性的部分菌株經刺激後能產生顯著的抑菌活性，增加了篩選到更多乳酸菌素的可能性。
附圖說明
圖1為本發明抑菌篩選的效果圖；
圖2為本發明實施例篩選的曲線圖。
具體實施方式
下面通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
主要試劑購自上海生工生物工程有限公司；
乳酸菌菌種庫：申請人前期從珠江口水產動物腸道中篩選得到乳酸菌800餘株，初步建立了珠三角本地的水產養殖乳酸菌菌種資源庫。
病原菌為蝦致病菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802。
培養基：
(1)LB培養基
胰化蛋白腖(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，搖動容器直至溶質溶解，用5mol/L NaOH調pH至7.0，用去離子水定容至1L，在121℃、0.1Mpa下滅菌20min。配製固體培養基時加入瓊脂粉含量為2％。
(2)MRS培養基
蛋白腖10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸二胺2.0g、吐溫-80 1.0ml、磷酸氫二鉀0.4g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.29g、碳酸鈣20.0g、瓊脂15.0g，蒸餾水溶解並定容到1000ml，pH調至6.2-6.6，攪拌後加熱，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下滅菌20min。
實施例1
一種高通量篩選乳酸菌素的方法，包括如下步驟：
(1)培養病原菌：
①活化菌種：往10mL試管中加入1.9mL滅菌LB培養基，並接入0.1mL解凍的病原菌液，置37℃、250rpm條件下培養12h；
②擴大培養：取0.25mL菌液接入25mL滅菌LB培養基的250mL三角瓶中，置37℃、250rpm條件下培養12h；
(2)培養乳酸菌：
①活化菌種：往96孔板中每孔裝入540μL滅菌MRS培養基，再分別接入60μL解凍的乳酸菌液，30℃下靜置培養12h；
②擴大培養：用多道移液器取出每孔30μL菌液，接入預先裝有每孔570μL滅菌MRS培養基的新孔板中，30℃下靜置培養12h；
③轉接培養：每孔取30μL菌液，接入預先裝有每孔570μL滅菌MRS培養基的新孔板中，30℃下靜置培養6h，加入6μL病原菌液，繼續在30℃下靜置培養12h；
(3)檢測：
①將培養好的96孔板置高速離心機中，10000g下離心5分鐘；
②取新96孔板，分別加入178μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液和20μL乳酸菌發酵液上清，以200μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液+198μL滅菌LB培養基、20μL乳酸菌發酵液上清+180μL滅菌LB培養基為對照，設置3個重複孔板。
③置37℃、250rpm條件下培養12小時，用酶標儀測量0-12小時內沒2h檢測每孔的OD600數值。
抑菌效果如圖1和圖2所示，其中圖1是孔板的整體實驗效果，圖2是從圖1選取3個實驗孔(D7、E5、E9)及對照孔(H12)的病原菌OD600隨時間的變化曲線。從圖2的曲線可以看出，與對照孔H12(不加乳酸菌發酵液上清)相比，3個實驗孔所加入的乳酸菌發酵液上清均有顯著的抑菌效果，其24小時抑菌活性為E9>E5>D7。
實施例2
一種高通量篩選乳酸菌素的方法，包括如下步驟：
(1)培養病原菌：
①活化菌種：往10mL試管中加入1.9mL滅菌LB培養基，並接入50μL解凍的病原菌液，置30℃、300rpm條件下培養25h；
②擴大培養：取1.25mL菌液接入25mL滅菌LB培養基的250mL三角瓶中，置30℃、300rpm條件下培養25h；
(2)培養乳酸菌：
①活化菌種：往48孔板中每孔裝入1080μL滅菌MRS培養基，再分別接入120μL解凍的乳酸菌液，25℃下靜置培養25h；
②擴大培養：用多道移液器取出每孔60μL菌液，接入預先裝有每孔1140μL滅菌MRS培養基的新孔板中，25℃下靜置培養25h；
③轉接培養：每孔取60μL菌液，接入預先裝有每孔1140μL滅菌MRS培養基的新孔板中，25℃下靜置培養3h，加入6μL病原菌液，繼續在25℃下靜置培養25h；
(3)檢測：
①將培養好的48孔板置高速離心機中，10000g下離心5分鐘；
②取新48孔板，分別加入356μL滅菌LB培養基、4μL病原菌液和40μL乳酸菌發酵液上清，以400μL滅菌LB培養基、4μL病原菌液+396μL滅菌LB培養基、40μL乳酸菌發酵液上清+360μL滅菌LB培養基為對照，設置3個重複孔板。
③置30℃、300rpm條件下培養25小時，用酶標儀測量0-25小時內沒2h檢測每孔的OD600數值。
測試結果與實施例1的結果相似，即乳酸菌發酵液上清均有顯著的抑菌效果。
實施例3
一種高通量篩選乳酸菌素的方法，包括如下步驟：
(1)培養病原菌：
①活化菌種：往10mL試管中加入1.8mL滅菌LB培養基，並接入0.2mL解凍的病原菌液，置40℃、200rpm條件下培養8h；
②擴大培養：取0.125mL菌液接入25mL滅菌LB培養基的250mL三角瓶中，置40℃、200rpm條件下培養8h；
(2)培養乳酸菌：
①活化菌種：往96孔板中每孔裝入570μL滅菌MRS培養基，再分別接入30μL解凍的乳酸菌液，33℃下靜置培養8h；
②擴大培養：用多道移液器取出每孔60μL菌液，接入預先裝有每孔540μL滅菌MRS培養基的新孔板中，33℃下靜置培養8h；
③轉接培養：每孔取60μL菌液，接入預先裝有每孔510μL滅菌MRS培養基的新孔板中，33℃下靜置培養6h，加入30μL病原菌液，繼續在33℃下靜置培養8h；
(3)檢測：
①將培養好的96孔板置高速離心機中，10000g下離心5分鐘；
②取新96孔板，分別加入178μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液和20μL乳酸菌發酵液上清，以200μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液+178μL滅菌LB培養基、20μL乳酸菌發酵液上清+180μL滅菌LB培養基為對照，設置3個重複孔板；
③置40℃、200rpm條件下培養8小時，用酶標儀測量0-8小時內沒2h檢測每孔的OD600數值。
測試結果與實施例1的結果相似，即乳酸菌發酵液上清均有顯著的抑菌效果。
實施例4
一種高通量篩選乳酸菌素的方法，包括如下步驟：
(1)培養病原菌：
①活化菌種：往10mL試管中加入1.8mL滅菌LB培養基，並接入0.2mL解凍的病原菌液，置40℃、200rpm條件下培養8h；
②擴大培養：取0.125mL菌液接入25mL滅菌LB培養基的250mL三角瓶中，置40℃、200rpm條件下培養8h；
(2)培養乳酸菌：
①活化菌種：往96孔板中每孔裝入510μL滅菌MRS培養基，再分別接入90μL解凍的乳酸菌液，28℃下靜置培養12h；
②擴大培養：用多道移液器取出每孔6μL菌液，接入預先裝有每孔594μL滅菌MRS培養基的新孔板中，28℃下靜置培養12h；
③轉接培養：每孔取6μL菌液，接入預先裝有每孔574μL滅菌MRS培養基的新孔板中，28℃下靜置培養8h，加入20μL病原菌液，繼續在28℃下靜置培養12h；
(3)檢測：
①將培養好的96孔板置高速離心機中，10000g下離心5分鐘；
②取新96孔板，分別加入178μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液和20μL乳酸菌發酵液上清，以200μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液+178μL滅菌LB培養基、20μL乳酸菌發酵液上清+180μL滅菌LB培養基為對照，設置3個重複孔板；
③置40℃、200rpm條件下培養12小時，用酶標儀測量0-12小時內沒2h檢測每孔的OD600數值。
測試結果與實施例1的結果相似，即乳酸菌發酵液上清均有顯著的抑菌效果。
實施例5
一種高通量篩選乳酸菌素的方法，包括如下步驟：
(1)培養病原菌：
①活化菌種：往10mL試管中加入1.9mL滅菌LB培養基，並接入0.1mL解凍的病原菌液，置37℃、250rpm條件下培養12h；
②擴大培養：取0.25mL菌液接入25mL滅菌LB培養基的250mL三角瓶中，置37℃、250rpm條件下培養12h；
(2)培養乳酸菌：
①活化菌種：往96孔板中每孔裝入540μL滅菌MRS培養基，再分別接入60μL解凍的乳酸菌液，30℃下靜置培養12h；
②擴大培養：用多道移液器取出每孔30μL菌液，接入預先裝有每孔570μL滅菌MRS培養基的新孔板中，30℃下靜置培養12h；
③轉接培養：每孔取30μL菌液，接入預先裝有每孔570μL滅菌MRS培養基的新孔板中，30℃下靜置培養6h，加入6μL病原菌液，繼續在30℃下靜置培養12h；
(3)檢測：
①將培養好的96孔板置高速離心機中，10000g下離心5分鐘；
②取新96孔板，分別加入188μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液和10μL乳酸菌發酵液上清，以200μL滅菌LB培養基、2μL病原菌液+198μL滅菌LB培養基、10μL乳酸菌發酵液上清+190μL滅菌LB培養基為對照，設置3個重複孔板。
③置37℃、250rpm條件下培養12小時，用酶標儀測量0-12小時內沒2h檢測每孔的OD600數值。
測試結果與實施例1的結果相似，即乳酸菌發酵液上清均有顯著的抑菌效果。
對比例1
該對比例於實施例1的不同之處僅在於，所述培養乳酸菌中的轉接培養時沒有接入病原菌液，除此之外，其餘試劑和試劑用量以及培養方法均與實施例1相同。
結果顯示，在沒有接入病原菌液時，部分乳酸菌發酵液上清抑菌效果不明顯。由此說明，本發明在乳酸菌培養過程中加入少量病原菌能刺激乳酸菌產生相應的抗菌物質(乳酸菌素)，因而能篩選到由傳統方法不容易得到的乳酸菌素。
對比例2
該對比例於實施例1的不同之處僅在於，所述培養乳酸菌中的轉接培養時接入病原菌液的接種量超過了5％，即接種量為8％，除此之外，其餘試劑和試劑用量以及培養方法均與實施例1相同。
結果顯示，當病原菌液接入量過大時，乳酸菌的生長極其緩慢，即生長受到了抑制。
申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的工藝方法，但本發明並不局限於上述工藝步驟，即不意味著本發明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。