製備用於在大腸桿菌和昆蟲細胞中表達鴨α－幹擾素基因的方法

2023-10-10 11:10:59

專利名稱：製備用於在大腸桿菌和昆蟲細胞中表達鴨α－幹擾素基因的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因工程產品的核苷酸序列的製備、表達載體的製備及其表達，具體地說是利用RT-PCR技術克隆鴨α-幹擾素基因，並構建了其真核表達載體和原核表達載體，分別在真核表達系統-Sf9和原核表達系統-BL21(DE3)plysS中表達。
背景技術：
幹擾素(interferon，IFN)是白細胞等在病毒或其他誘生劑作用下產生的一種具有調節免疫功能和廣譜抗病毒活性的蛋白質。幹擾素分為兩大類型，即I型(主要是α和β)和II型(γ)幹擾素。α-幹擾素(IFN-α)由白細胞產生，具有較強的抗病毒作用。
鴨I型幹擾素基因是在1995年由Schults等首次克隆。當時使用已克隆的ChIFN1作為探針，用Southern雜交法獲得了一段長為1.2kb的核苷酸片段，包括鴨I型幹擾素的完整閱讀框架，即以ATG為起始密碼子的576bp的一段核苷酸序列，共編碼191個胺基酸，其中N末端的30個疏水胺基酸為信號肽，成熟多肽為161個胺基酸。鴨I型幹擾素與雞I型幹擾素相比，核苷酸水平和胺基酸水平的同源性分別為73％和50％。

發明內容本發明的目的在於提供製備用於在大腸桿菌和昆蟲細胞中表達鴨α-幹擾素基因的方法。
本發明的目的是這樣實現的(1)用淋巴細胞分離液分離鴨外周血單核細胞，植物血凝素誘導培養鴨外周血單核細胞，收穫誘導培養的細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA；(2)設計擴增鴨α-幹擾素基因的特異性引物，如下上遊引物P1 20bp5′-GCACAACCCAGGATCCACCA-3′，引入BamH I酶切位點；下遊引物P2 19bp5′-GTGCGCGTGTGGGGTACCT-3′；(3)利用RT-PCR技術擴增鴨α-幹擾素基因；(4)對鴨α-幹擾素基因進行克隆、測序鑑定；(5)利用BamH I(引物中引入)、Sal I(克隆載體pGEM-T上的酶切位點)這兩個多克隆位點，將鴨α-幹擾素基因定向亞克隆至原核表達載體pET30a和真核表達載體pBlueBacHis2A上；
(6)重組表達質粒pET30a-DuIFN-α轉化大腸桿菌BL21(DE3)plysS；(7)確定原核表達系統中表達鴨α-幹擾素的最佳誘導時間和IPTG濃度；(8)鴨α-幹擾素在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中的誘導表達；(9)重組表達質粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α轉染昆蟲細胞Sf9細胞株；(10)噬斑分析篩選重組病毒；(11)確定真核表達系統中表達重組鴨α-幹擾素的最佳表達時間和感染複數；(12)按最佳表達時間和MOI接種病毒，感染Sf9細胞，在Sf9細胞中表達鴨α-幹擾素。
採用本發明的方法生產的產品可用於①研究鴨α-幹擾素生物活性及其作用機理。
②製備抗病毒的藥物。
本發明的產品優點體現在①pET和pBlueBacHis2A載體系統表達效率非常高。
②兩種載體系統都攜帶His標籤，便於純化。


圖1是本發明DuIFN-α基因的核苷酸序列編碼的胺基酸序列，其中下劃線表示信號肽，方框表示糖基化位點；圖2為構建含有DuIFN-α基因的重組克隆載體的流程圖；圖3為構建含有DuIFN-α基因的原核表達載體的流程圖；圖4為構建含有DuIFN-α基因的真核表達載體的流程圖。
(五)具體實施方案下面舉例對本發明作更詳細的描述(1)用淋巴細胞分離液分離鴨外周血單核細胞，植物血凝素(PHA)誘導培養鴨外周血單核細胞，收穫誘導培養的細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA；(2)設計擴增鴨α-幹擾素基因的特異性引物，如下上遊引物(P1) 20bp5′-GCACAACCCAGGATCCACCA-3′，引入一個BamH I酶切位點；下遊引物(P2) 19bp5′-GTGCGCGTGTGGGGTACCT-3′；(3)利用RT-PCR技術擴增鴨α-幹擾素基因；(4)對鴨α-幹擾素基因進行克隆、測序鑑定；(5)利用BamH I(引物中引入)、Sal I(克隆載體pGEM-T上的酶切位點)這兩個多克隆位點，將鴨α-幹擾素基因定向亞克隆至原核表達載體pET30a和真核表達載體pBlueBacHis2A上；(6)重組表達質粒pET30a-DuIFN-α轉化大腸桿菌BL21(DE3)plysS；(7)確定原核表達系統中表達鴨α-幹擾素的最佳誘導時間和IPTG濃度；(8)鴨α-幹擾素在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中的誘導表達，具體操作如下把構建好的重組表達質粒pET30a-DuIFN-α，轉化宿主菌BL21(DE3)PlysS，挑含重組陽性質粒的單菌落到含有濃度為50ug/mL的卡那黴素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜。按1％的接種量將過夜培養的菌液接種於100mL的Kan+/LB液體培養基中，37℃振蕩培養2-3h後，菌液光密度值至0.4時馬上加入1mM IPTG誘導4h。離心收集誘導的細菌，用PBS洗滌3次，沉澱用PBS溶液重懸起，加入等體積的2×SDS上樣緩衝液，100℃煮沸5min，然後進行超聲處理，以4℃，12000g離心10min，取上清和沉澱分別進行SDS-PAGE電泳；(9)重組表達質粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α轉染昆蟲細胞Sf9細胞株，具體操作如下將10ul(0.5ug)BAC-N-BlueTM Linear DNA(線性化的AcMNPV DNA)，4ul(1ug/ul)重組質粒DNA，1000ul不含血清和添加成份的Grace’s培養基，20ul(1mg/ml)轉染試劑(使用前混均)，混均10sec，室溫作用15min，轉移至用不含血清和添加成份的Grace’s培養基洗滌兩次的Sf9細胞單層上，室溫下作用4h之後，往每個培養孔中加入3ml含血清的Grace’s完全培養基，27℃培養箱中培養；(10)噬斑分析篩選重組病毒(藍色噬斑)，具體操作如下將所收穫的第四和第八天轉染液(重組病毒液)依次稀釋2-3個梯度加到棄去培養基的Sf9細胞單層上，作用1h，棄上清，將含血清的完全培養基和2.2％低熔點瓊脂糖按1∶1比例混合，加X-gal至終濃度150ug/ml，立即快速加到細胞上，等膠凝固後，倒置6孔培養板，放於27℃培養箱中培養，直到看到噬斑出現；(11)確定真核表達系統中表達重組鴨α-幹擾素的最佳表達時間和MOI(感染複數)，具體操作如下①將PCR鑑定的第四輪重組病毒感染2×106對數期Sf9細胞，放於27℃培養箱中培養，直至細胞完全裂解，製備高滴度病毒液；以10倍的梯度將高滴度病毒液稀釋至10-6和10-7，分別做噬斑分析，通過計算噬斑數，根據公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀釋度)×噬斑數，確定其滴度；②根據公式接種所需高滴度病毒液的體積(ml)＝(感染複數×細胞數)/滴度，計算出感染複數(MOI)為5、7和10時，需要接種高滴度病毒液的體積。並設置不接病毒液的Sf9細胞對照。分別於感染後的第1-5天收穫細胞，製備SDS-PAGE樣品；(12)按最佳表達時間和MOI接種病毒，感染Sf9細胞，在Sf9細胞中表達鴨α-幹擾素。
權利要求
1.製備用於在大腸桿菌和昆蟲細胞中表達鴨α-幹擾素基因的方法，其特徵是(1)用淋巴細胞分離液分離鴨外周血單核細胞，植物血凝素誘導培養鴨外周血單核細胞，收穫誘導培養的細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA；(2)設計擴增鴨α-幹擾素基因的特異性引物，如下上遊引物P1 20bp5′-GCACAACCCAGGATCCACCA-3′，引入BamH I酶切位點；下遊引物P2 19bp5′-GTGCGCGTGTGGGGTACCT-3′；(3)利用RT-PCR技術擴增鴨α-幹擾素基因；(4)對鴨α-幹擾素基因進行克隆、測序鑑定；(5)利用BamH I、Sal I這兩個多克隆位點，將鴨α-幹擾素基因定向亞克隆至原核表達載體pET30a和昆蟲杆狀病毒轉移載體pBlueBacHis2A上；(6)重組表達質粒pET30a-DuIFN-α轉化大腸桿菌BL21(DE3)plysS；(7)確定原核表達系統中表達鴨α-幹擾素的最佳誘導時間和IPTG濃度；(8)鴨α-幹擾素在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中的誘導表達；(9)重組表達質粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α與杆狀病毒線性DNA共轉染昆蟲細胞Sf9細胞株；(10)噬斑分析篩選重組病毒；(11)確定真核表達系統中表達重組鴨α-幹擾素的最佳表達時間和感染複數；(12)按最佳表達時間和MOI接種病毒，感染Sf9細胞，在Sf9細胞中表達鴨α-幹擾素。
2.根據權利要求1所述的製備用於在大腸桿菌表達鴨α-幹擾素基因的方法，其特徵是所述的鴨α-幹擾素在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中誘導表達的操作方法為把構建好的重組表達質粒pET30a-DuIFN-α，轉化宿主菌BL21(DE3)PlysS，挑含重組陽性質粒的單菌落到含有濃度為50ug/mL的卡那黴素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜；按1％的接種量將過夜培養的菌液接種於100mL的Kan+/LB液體培養基中，37℃振蕩培養2-3h後，菌液光密度值至0.4時馬上加入1mM IPTG誘導4h；離心收集誘導的細菌，用PBS洗滌3次，沉澱用PBS溶液重懸起，加入等體積的2×SDS上樣緩衝液，100℃煮沸5min，然後進行超聲處理，以4℃，12000g離心10min，取上清和沉澱分別進行SDS-PAGE電泳。
3.根據權利要求1所述的製備用於在昆蟲細胞中表達鴨α-幹擾素基因的方法，其特徵是所述重組表達質粒pBlueBacHis2A-DuIFN-α轉染昆蟲細胞Sf9細胞株的操作方法為將10ul濃度為(0.5ug/ulBAC-N-BlueTM Linear DNA，4ul濃度為1ug/ul重組質粒DNA，1000ul不含血清和添加成份的Grace’s培養基，20ul濃度為1mg/ml轉染試劑，混均10sec，室溫作用15min，轉移至用不含血清和添加成份的Grace’s培養基洗滌兩次的Sf9細胞單層上，室溫下作用4h之後，往每個培養孔中加入3ml含血清的Grace’s完全培養基，27℃培養箱中培養；將所收穫的第四和第八天轉染液依次稀釋2-3個梯度加到棄去培養基的Sf9細胞單層上，作用1h，棄上清，將含血清的完全培養基和2.2％低熔點瓊脂糖按1∶1比例混合，加X-gal至終濃度150ug/ml，立即快速加到細胞上，等膠凝固後，倒置6孔培養板，放於27℃培養箱中培養，直到看到噬斑出現。
4.根據權利要求1和3所述的製備用於在昆蟲細胞中表達鴨α-幹擾素基因的方法，其特徵是所述的確定真核表達系統中表達重組鴨α-幹擾素的最佳表達時間和感染複數的操作方法為①將PCR鑑定為純的第四輪重組病毒感染2×106對數期Sf9細胞，放於27℃培養箱中培養，直至細胞完全裂解，製備高滴度病毒液；以10倍的梯度將高滴度病毒液稀釋至10-6和10-7，分別做噬斑分析，通過計算噬斑數，根據公式滴度(pfu/ml)＝(1/稀釋度)×噬斑數，確定其滴度；②根據公式接種所需高滴度病毒液的體積(ml)＝(感染複數×細胞數)/滴度，計算出感染複數(MOI)為5、7和10時，需要接種高滴度病毒液的體積；並設置不接病毒液的Sf9細胞對照；分別於感染後的第1-5天收穫細胞，製備SDS-PAGE樣品。
全文摘要
本發明涉及製備用於在大腸桿菌和昆蟲細胞中表達鴨α－幹擾素基因的方法。包括編碼鴨α－幹擾素的基因的克隆，含鴨α－幹擾素基因的原核表達載體和重組昆蟲杆狀病毒轉染載體的構建，用所述含鴨α－幹擾素基因的重組原核表達載體轉化大腸桿菌和誘導表達，用所述含鴨α－幹擾素基因的重組杆狀病毒轉染昆蟲細胞及在昆蟲細胞中的表達等。通過本方法製備的產品為研究鴨α－幹擾素生物活性及其作用機理提供了基礎，也可製備成抗病毒的藥物。
文檔編號C12P21/02GK1861796SQ200510009978
公開日2006年11月15日 申請日期2005年5月13日 優先權日2005年5月13日
發明者王君偉, 任桂萍, 許麗娜, 李洪濤 申請人:東北農業大學