D－丙氨酸微生物製造方法

2023-10-25 21:32:12 1

專利名稱：D－丙氨酸微生物製造方法
技術領域：
本發明涉及一種以消旋的丙氨酸為原料，利用微生物分解其中的L-丙氨酸，生產D-丙氨酸的方法。
背景技術：
D-丙氨酸是一種重要的手性有機化合物，主要應用於手性藥物、藥物中間體、食品添加劑等領域，在製藥、食品行業作為手性合成的手性原料。作為一種結構最簡單的具有光學活性的胺基酸，在某些手性化合物的不對稱合成過程中具有不可替代的作用，目前主要用於生產新型廣譜抗生素、D-丙氨醇、多肽、新型甜味劑阿力甜(Alitame)，其中合成新型甜昧劑阿力甜(Alitame)為該產品提供了巨大的市場空間。
已知的製取D-丙氨酸的技術方法主要有「生物發酵法」、「不對稱化學合成法」、「胺基酸醯化酶拆分法」。其中「發酵法」生產周期長，設備投資大，有副反應，分離較複雜、汙染大成本高；「不對稱化學合成法」反應機制複雜，工藝過程長；需要純手性試劑或貴金屬絡合物作催化劑，生產成本極高，以上兩種方法不具備工業化應用價值，目前國內外工業化生產D-丙氨酸普遍採用「胺基酸醯化酶拆分法」，該法利用的胺基酸價格昂貴，生產成本仍然較高，只能用於小規模工業化生產。
由於D-丙氨酸的生理作用被不斷發現，其應用越來越廣泛，需要研究開發一種適合大規模工業工業化、能顯著降低生產成本的技術。依據生物的不對稱降解或同化作用機理，研究生產手性胺基酸的方法，是一個重要的方向。本發明也是基於此原理。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種生產過程簡單，條件溫和，能夠大幅度降低生產成本的D-丙氨酸微生物製造方法。
其技術方案是一種D-丙氨酸微生物製造方法，具體步驟和特徵如下1、含酶細胞懸液的製作採用搖瓶或發酵罐通風培養。搖瓶旋轉速度為40-200轉/分鐘，1000毫升三角燒瓶裝液量100-400毫升，培養時間12-48小時，培養溫度25℃-40℃。發酵培養通風比1∶0.05V-1∶0.4V(液體體積∶每分鐘通入的空氣體積)，培養時間12-48小時，培養溫度25℃-40℃。
培養基可以使用通常的碳水化合物作為碳源，如葡萄糖、蔗糖、澱粉、糊精、麥芽汁、糖蜜等；作為氮源可以單獨或混合使用各種動物植物蛋白腖、豆餅水解液、硫酸銨、酵母提取物、玉米漿等；無機鹽可以單獨或混合使用氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等多種無機鹽。此外培養基中加入大豆油、各種消泡劑，避免滅菌或培養過程中的起泡現象。培養基配製後用酸或鹼調節PH值到4-7.5。然後用蒸汽110-121℃滅菌10--30分鐘。
其中碳源的濃度為0-100g/L；氮源的濃度為0.5-50g/L；無機鹽的濃度為0.1-10g/L。誘導物L-丙氨酸的濃度為0.1-200g/L。
本發明所篩選使用的微生物主要有假絲酵母和其他各種絲狀真菌，也包括細菌中的大腸桿菌屬、變形桿菌屬和綠膿桿菌屬等革蘭氏陰性細菌，上述這些微生物都是好氧型的。利用的微生物酶主要有胺基酸氧化酶、丙氨酸轉氨酶等。其中主要的酶胺基酸氧化酶活力最高可以達到每小時每克溼細胞催化分解2800μmolL-丙氨酸。這些酶可以單獨提取出來使用，本發明主要是利用含有能夠分解L-丙氨酸的酶系的全細胞培養液(發酵液)。當然，具有上述能夠分解L-丙氨酸能力的微生物細胞也可以從發酵液中分離出來，用聚合膠包埋等方式固定化使用。
2、酶催化不對稱降解反應將培養好的細胞懸液(發酵液)維持一定溫度30-58℃，通入空氣，通風比為1∶0.05V-1∶2V(液體體積∶每分鐘通入的空氣體積)。向液體中流加底物DL-丙氨酸，流加的DL-丙氨酸兩種異構體的比例可以是任意的。反應體系中的胺基酸氧化酶特異性的氧化分解L-丙氨酸，並放出氨氣，其中的D-丙氨酸很少或基本不參與反應。隨著底物流加量的不斷增加，反應液體的PH值會增加，影響反應的進行，可以通過加大通風量或加入硫酸等手段降低溶液PH值，維持最適宜的PH值在4.5-8.0。
3、產物提取分離反應過程D-丙氨酸的濃度不斷增加，積累到一定程度，D-丙氨酸從反應體系中結晶出來，通過離心分離得到粗品，這是本發明的又一項重要創新。離心後的酶反應液可以回收反覆套用多次，直到酶活力降低到沒有利用價值。喪失酶活力的酶反應液中含有一定濃度的D-丙氨酸，這部分產品可以通過濃縮的方式結晶出來。每升上述發酵液可以生產D丙氨酸100-1500克。
4、D-丙氨酸的精製可以通過公知的活性炭脫色、過濾、重結晶等簡單工藝進行。活性碳脫色溫度60-80℃，脫色濃度8％-16％。脫色液透光率98.8％以上。脫色液用真空濃縮的方法減少水分，從而使D-丙氨酸結晶出來。離心或抽濾得到成品。
其技術效果是利用微生物產生的胺基酸氧化酶，不對稱催化氧化分解底物DL-丙氨酸中的L-丙氨酸，而D-丙氨酸則很少或基本不參與反應，最終作為目標產物被提取出來。產品光學純度高達99.8％、化學純度高達99.7％；生產過程簡單，條件溫和，生產成本低。
實施例以下，用實施例對本發明進行說明，但本發明不受這些實施例的限制。實施例中使用的原料是旋光度為零的DL-丙氨酸。
實施例1配製含有蛋白腖20g/L，葡萄糖10g/L，氯化鈉5g/L，玉米漿乾粉18g/LL-丙氨酸5g/L，硫酸鎂0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L的培養基1升，用氨水或硫酸調整PH值到7左右，分裝入1000毫升三角燒瓶中，每瓶裝液量250毫升。將上述培養基121℃高壓滅菌15分鐘。冷卻到30℃，將保存在斜面上的假絲酵母用ф1mm接種環挑取一環接入上述培養基中。使用旋轉震蕩器，在30℃、110rpm下培養24小時。
合併上述細胞培養液1升，水浴升溫至45℃，每分鐘通入空氣0.5升，流加DL-丙氨酸，用PH試紙檢測氨氣釋放強度，反應連續進行40小時，累計加入DL-丙氨酸600g，停止加料，繼續反應1小時。冷卻至15℃，用抽濾的方法分離結晶出的D-丙氨酸粗品180g，抽濾液真空濃縮得D-丙氨酸粗品80g，合併粗品260g。粗品溶解於2升蒸餾水中，加熱到80℃，加入6g活性碳脫色30分鐘，抽濾。用旋轉薄膜蒸發器真空濃縮結晶，得D-丙氨酸精製品230g，25℃母液190毫升。產品光學純度99.5％，化學純度99.6％。
實施例2配製含有蛋白腖20g/L，酵母膏20g/L，葡萄糖10g/L，氯化鈉5g/L，玉米漿乾粉18g/L，硫酸鎂0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L的一級培養基150毫升，用氨水或硫酸調整PH值到7左右，分裝入500毫升三角燒瓶中，每瓶裝液量150毫升。將上述培養基121℃高壓滅菌15分鐘。冷卻到37℃，將保存在斜面上的假絲酵母用ф1mm接種環挑去一環接入上述培養基中。使用旋轉震蕩器，在30℃，110rpm下培養16小時，得到一級種子細胞懸液400毫升。
配製含豆餅水解液20g/L(折幹)，麥芽粉20g/L，葡萄糖5g/L，氯化鈉5g/L，玉米漿乾粉5g/L，硫酸鎂0.2g/L，磷酸二氫鉀1g/L、L-丙氨酸5g/L的發酵液10升，調整整PH值7左右，將上述培養基加到有效容積10升的發酵罐中，115℃高壓滅菌15-20分鐘。冷卻至30℃，接入上述一級種子細胞懸液400毫升。每分鐘通入無菌空氣2升，培養24小時。
將上述發酵液體水浴升溫至50℃，每分鐘通入空氣5升，流加DL-丙氨酸，反應連續進行48小時，累計加入DL-丙氨酸8000g，停止加料，繼續反應1小時。冷卻至15℃，用100目滌綸濾布過濾得D-丙氨酸粗品2400g。
濾液再加熱至50℃，按上述方法繼續流加DL-丙氨酸，隨著反應時間的延長，反應速度降低，繼續反應50小時，氨氣析出量很少，用HPLC測量液體中的L-丙氨酸殘留量低於0.5％時停止反應。第二次累計加入DL丙氨酸6000g，分離得D-丙氨酸粗品2900g。
第二次分離後的反應液真空濃縮得D-丙氨酸粗品900g，合併上述D-丙氨酸粗6200g，用實施例1的方法精製，得光學純度99.8％、化學純度99.7％的D-丙氨酸5952g。
權利要求
1.一種D-丙氨酸微生物製造方法，其特徵在於1)分解L-丙氨酸的微生物細胞懸液的製作將碳源、氮源、無機鹽、水和誘導物按比例配製培養基，用酸或鹼將其PH值調節到4-7.5；然後，接入經篩選出來的能夠產生分解L-丙氨酸酶的微生物，用旋轉震蕩器或發酵罐通風培養12-48小時，培養溫度為25℃-40℃。2)酶催化不對稱降解反應向培養好的細胞懸液液體中不斷流加底物DL-丙氨酸，使反應體系中的胺基酸氧化酶特異性的氧化分解L-丙氨酸，並放出氨氣，通過加大通風量或加入硫酸等手段降低溶液PH值，使溶液中的PH值維持在4.5-8.0；反應溫度28-68℃。3)產物提取分離通過向轉化體系中不斷加入DL-丙氨酸，增加D-丙氨酸的濃度，使D-丙氨酸從反應體系中結晶出來，通過離心分離得到粗品；4)D-丙氨酸的精製粗品通過活性炭脫色、過濾、重結晶，即得精製的D-丙氨酸成品。
2.根據權利要求1所述的一種D-丙氨酸微生物製造方法，其特徵在於所述培養基中的碳源為單獨或混合使用的碳水化合物中的葡萄糖、蔗糖、澱粉、糊精、麥芽汁和糖蜜；氮源為單獨或混合使用的各種動物植物蛋白腖、豆餅水解液、硫酸銨、酵母提取物和玉米漿；無機鹽為單獨或混合使用的氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀；所述的誘導物為L-丙氨酸。
3.根據權利要求1或2所述的一種D-丙氨酸微生物製造方法，其特徵在於所述碳源的濃度為0-100g/L；氮源的濃度為0.5-50g/L；無機鹽的濃度為0.1-10g/L；誘導物L-丙氨酸的濃度為0.1-200g/L。
4.根據權利要求1所述的一種D-丙氨酸微生物製造方法，其特徵在於所述能夠產生分解L-丙氨酸酶的微生物為假絲酵母和其他各種絲狀真菌，也包括細菌中的大腸桿菌屬、變形桿菌屬和綠膿桿菌屬等革蘭氏陰性細菌。
5.根據權利要求1所述的一種D-丙氨酸微生物製造方法，其特徵在於所用原料DL-丙氨酸中的兩種旋光異構體的比例可以是任意的；DL-丙氨酸是作為酶催化分解的底物，而不是培養基的成分；利用的是微生物全細胞進行催化分解反應。
全文摘要
D－丙氨酸微生物製造方法屬生物技術領域。其所要解決的技術問題是提供一種生產過程簡單、能夠降低生產成本的D－丙氨酸微生物製造方法。其技術要點在特定的培養條件下培養微生物如假絲酵母，產生對L－丙氨酸具有強氧化能力的胺基酸氧化酶；以DL－丙氨酸為底物，流加進培養好的含有胺基酸氧化酶、L－丙氨酸轉氨酶的細胞懸液中，通入空氣，特異性地降解DL－丙氨酸中的L－丙氨酸脫去氨基分解；而D－丙氨酸則完全不參與反應，作為目標產物提取出來；通過不斷流加底物，產物濃度增高，使D－丙氨酸在酶液中形成結晶體，直接分離，經過脫色、過濾、重結晶就可以達到精製提純的目的。產品化學純度和光學純度高，製造成本低。
文檔編號C12P41/00GK1884565SQ20061004068
公開日2006年12月27日 申請日期2006年5月29日 優先權日2006年5月29日
發明者黃建坡, 陳武軍, 尹若春 申請人:安徽華恒生物工程有限公司