核酸分析用組合物的製作方法

2023-10-25 10:46:47

專利名稱：核酸分析用組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及含有突變體螢火蟲螢光素酶的核酸分析用組合物、使用其的核酸分析 方法和核酸分析試劑盒。
背景技術：
螢火蟲螢光素酶為將ATP、D_螢光素和氧轉換為AMP、氧螢光素和二氧化碳並發光 的酶。作為利用螢火蟲螢光素酶進行發光檢測的核酸分析法，目前已知有焦磷酸測序 (pyrosequencing method)法(例如，參照非專利文獻1)、使用BAMPER法的基因多態性 (SNPs)分析法(例如，參照非專利文獻2)、利用雜交法的基因檢測法(例如，參照非專利文 獻3)等。這些核酸分析法基於如下原理使用ATP硫酸化酶、丙酮酸磷酸雙激酶(pyruvate phosphate dikinase,PPDK)等酶，將由於互補鏈合成而攝取核苷酸時放出的焦磷酸轉換成 ATP，通過螢光素-螢光素酶反應對生成的ATP測定發光。例如，焦磷酸測序法中，使引物與作為模板的單鏈DNA(待測核酸)雜交，向反應液 中依次地加入4種脫氧核苷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)中的每一種，使其合成互補鏈。合 成互補鏈則會生成作為反應產物的焦磷酸。通過ATP硫酸化酶將該焦磷酸轉換成ATP，通過 螢光素_螢光素酶反應對生成的ATP測定發光。接著，通過用腺苷三磷酸雙磷酸酶等進行 分解的液相法或預先使模板DNA結合到固相上後用反應液衝洗而洗滌的固相法等，來除去 未反應的核苷酸。一邊改變核苷酸一邊反覆進行該一系列的工序，從而測定待測核酸的序 列。通過焦磷酸測序法能測定的鹼基序列的長度在一次中不過是100鹼基左右，而通 過使用每板有數百萬個孔的picotiter板進行平行分析等能以低成本進行大規模核酸分 析的方法受到廣泛關注。但是，在基於上述這種原理的各種核酸分析法中，多數情況下，需要向反應液中添 加作為互補鏈合成反應的底物的dATP來作為試劑。進而，多數情況下，待測核酸中也含有 dATP。dATP由於結構與ATP類似，因此雖然與ATP相比極弱，但也作為螢光素酶的底物而起 作用、產生發光。因此，利用螢光素-螢光素酶反應在這類含dATP的反應液中分析核酸時， 由於混入的dATP而使背景發光量增高，結果具有分析靈敏度降低的問題。作為防止dATP導致的背景發光的方法，報導了使用作為dATP的衍生物的a _硫 代三磷酸脫氧腺苷(dATP a S)代替dATP的方法(例如，參照專利文獻1)。但是，dATP a S 與dATP相比非常昂貴，另外在DNA聚合酶反應中攝取效率差，存在無法正常進行互補鏈合 成反應等問題。此外，還報導了在焦磷酸測序法中通過降低dATP的含有率從而抑制dATP導致的 背景發光的方法(例如，參照專利文獻2)。但是，降低dATP的含有率的話，當在模板DNA序 列中存在連續的胸腺嘧啶(T)時，由於必要的dATP不足，無法完全完成互補鏈合成。因此，無法獲得與胸腺嘧啶數量相應的信號發光量，此外，由於殘存未反應的胸腺嘧啶，無法進入 下一個序列的反應，結果，存在無法準確地測定鹼基序列的問題。專利文獻1 國際專利申請第98/13523號小冊子專利文獻2 日本特開2007-68450號公報非專利文獻1 :Anal Biochem. 1987 年 167 卷、p235_238非專利文獻2 :Nucleic Acids Res. 2001 年 29 卷(19)、p93非專利文獻3 :Anal Biochem. 2004 年 333 卷、p296_30
發明內容
發明要解決的問題本發明提供螢火蟲螢光素酶、使用其的核酸分析方法和核酸分析試劑盒，其用於 使用dATP的廉價、高精度且高靈敏度的核酸分析，無需使用dATPa S這類對DNA聚合酶反 應性低且昂貴的試劑。用於解決問題的方案申請人:為了解決這樣的問題反覆進行了深入研究，結果發現，通過使用對dATP的 反應性低的螢火蟲螢光素酶，能夠實現抑制了 dATP導致的背景發光且廉價、高精度、高靈 敏度的核酸分析法，基於該見解完成了本發明。即本發明涉及下述方案。1. 一種核酸分析用組合物，其含有對dATP的反應性為對ATP的反應性的1/400以 下的螢光素酶。2.根據上述1所述的核酸分析用組合物，其中，螢光素酶的425位的胺基酸為亮 氨酸，或者438位的胺基酸為甘氨酸，或者532位的胺基酸為精氨酸，或者425位的胺基酸 為亮氨酸且438位的胺基酸為甘氨酸，或者425位的胺基酸為亮氨酸且532位的胺基酸為 精氨酸，或者438位的胺基酸為甘氨酸且532位的胺基酸為精氨酸，或者425位的胺基酸為 亮氨酸、438位的胺基酸為甘氨酸且532位的胺基酸為精氨酸，或者344位的胺基酸為丙氨 酸，或者344位的胺基酸為纈氨酸，或者344位的胺基酸為異亮氨酸，或者344位的胺基酸 為丙氨酸、425位的胺基酸為亮氨酸且438位的胺基酸為甘氨酸。3.根據上述1或2所述的核酸分析用組合物，其中，螢光素酶為平家螢來源。4.根據上述1所述的核酸分析用組合物，其中，螢光素酶為下述的嵌合型螢光素 酶螢光素酶中，N末端側具有源氏螢的1 448位的胺基酸序列，且217位、219位、239位 分別變為異亮氨酸(I)，C末端側具有北美產螢火蟲螢光素酶的447 550位的胺基酸序 列。5. 一種核酸分析方法，其特徵在於，使用上述1 4所述的組合物。6.核酸分析用試劑盒，其含有上述1 4所述的組合物。發明的效果根據本發明，能夠抑制dATP導致的背景發光的影響，能進行高靈敏度的核酸分 析。


圖1是dATP/ATP比和互補鏈合成試驗中添加dATP時的發光量的關係。
具體實施例方式(螢光素酶)作為本發明使用的螢光素酶(EC 1. 13. 12. 7)的來源，可舉出鞘翅目例如源氏螢、 平家螢、北美產螢火蟲等，只要是以ATP為底物顯示發光反應且對dATP為低反應性的螢光 素酶，則也可以是其他起源。此外，可以具有天然的序列，也可以進一步具有各種公知突變。 也可以利用含有在耐熱性、化學藥品耐性、發光強度、發光持續性、發光的色調等與dATP的 反應性以外的目的下導入的突變的螢光素酶。此外，也可以利用含有在耐熱性、化學藥品耐 性等其他目的下引入的突變的酶。本發明使用的螢光素酶優選源氏螢螢光素酶、平家螢螢光素酶或北美產螢火蟲熒 光素酶，更優選平家螢螢光素酶。(對dATP的反應性)本發明中，發光反應中使用的螢光素酶對dATP為低反應性這點極重要。「對dATP 為低反應性」是指在同一條件下進行反應時，與對ATP的反應性相比，對dATP的反應性相 對低，低的程度在一定值以下。將具有這種特性的螢光素酶用於本發明的方法的情況下，能 抑制dATP導致的背景發光而獲得高精度且高靈敏度的測定值。(ATP/dATP 比測定方法)為了表示本發明中的、螢光素酶對dATP的反應性，例如，可利用對ATP的反應性與 對dATP的反應性之比(ATP/dATP比)。可以以該比率為指標來規定適於本發明中使用的 螢光素酶。但是，該ATP/dATP比隨著測定時使用的ATP、dATP的濃度、pH、反應溫度、試劑 組成、測定裝置等反應條件而改變。此外，這些條件也綜合地改變。例如，有時可通過改變 PH、反應溫度、試劑組成等中任意一個或多個，使產生的發光的最大波長發生變化。另一方 面，由於測定發光的裝置側的靈敏度在每個波長下不同，這種情況下，有時也會由於測定裝 置而獲得不同的結果。考慮這些情況而用於規定本發明中使用的酶的ATP/dATP比，需要在 一定條件下測定。例如，用於規定本發明中使用的酶的ATP/dATP比能夠在以下條件下測定。為了研究對dATP和對ATP的反應性，作為發光試劑，製備含螢光素酶的ATP/dATP 比測定用試劑(pH7. 5士0. l、60mM N-三(羥甲基)甲基甘氨酸、2mM EDTA、20mM醋酸鎂、 0. 2mM 二硫蘇糖醇(DTT)、0.4mM D-螢光素、0. 牛血清白蛋白(BSA))。螢光素酶濃度依 據作為測定對象的螢光素酶的比活性而不同，期望調整到用Lumitester C-100N(龜甲萬公 司制)等檢測器能穩定地測定的濃度。期望為0. 01 u g/mL 10mg/mL。ATP測定中，向0. lmL ATP/dATP比測定試劑(含螢光素酶)中添加0. lmL的 1X1(T7M ATP，通過Lumitester C-100N測定剛添加後的發光量。dATP測定中，向0. lmL ATP/dATP比測定用試劑中添加0. lmL的1 X 1(T5M dATP,通 過Lumitester C-100N測定剛添加後的發光量。為了修正ATP濃度和dATP濃度，可使添加ATP時的發光量為100倍，再將該值除 以添加dATP時的發光量，將獲得的值作為「ATP/dATP比」。測定優選在25士 1°C下進行。測定器使用如下的測定器以光電倍增管(photomultiplier)為檢測部的 Lumitester C-100N或與其具有同等性能的測定器。
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使用在所述測定條件下得到的ATP/dATP比在400以上、優選在800以上、更優選 在2000以上、進一步優選在4000以上的螢光素酶的情況下，能夠抑制dATP導致的背景發 光而獲得高精度且高靈敏度的測定值。另一方面，在使用ATP/dATP比不足400的螢光素酶 的情況下，dATP導致的背景發光會產生不良影響，無法高精度、高靈敏度地進行測定。(對dATP為低反應性的螢光素酶的篩選)使用上述指標，從公知的各種螢光素酶、以公知的各種螢光素酶的序列為基礎而 重新製備的螢光素酶中，能夠篩選出對dATP為低反應性的螢光素酶。作為這樣篩選出的適 合用於本發明的螢光素酶，例如，可舉出螢光素酶的425位的胺基酸為亮氨酸，或者438位 的胺基酸為甘氨酸，或者532位的胺基酸為精氨酸，或者425位的胺基酸為亮氨酸且438位 的胺基酸為甘氨酸，或者425位的胺基酸為亮氨酸且532位的胺基酸為精氨酸，或者438位 的胺基酸為甘氨酸且532位的胺基酸為精氨酸，或者425位的胺基酸為亮氨酸、438位的氨 基酸為甘氨酸且532位的胺基酸為精氨酸，或者344位的胺基酸為丙氨酸，或者344位的氨 基酸為纈氨酸，或者344位的胺基酸為異亮氨酸，或者344位的胺基酸為丙氨酸、425位的氨 基酸為亮氨酸且438位的胺基酸為甘氨酸、440位的胺基酸為丙氨酸的螢光素酶。此外，所 述胺基酸位置基於平家螢的螢光素酶的胺基酸序列(序列號1)。此外，螢光素酶還可舉出如下的嵌合型螢光素酶(LUC-C)螢光素酶中，N末端側 具有源氏螢的1 448位的胺基酸序列，且217位、219位、239位分別變為異亮氨酸(I)，C 末端側具有北美產螢火蟲螢光素酶的447 550位的胺基酸序列。(對dATP為低反應性的突變螢光素酶的製作)可使用公知的各種突變酶的製作方法，來重新製作對dATP為低反應性的螢光素 酶。作為導入突變的方法，可舉出例如通常使用的方法，即，使用突變引物通過PCR來對各 個載體進行擴增的方法，但並不限定於此。此外，也可以從通過隨機突變而獲得的突變螢光 素酶來尋找目標物質。已知的是，鞘翅目類螢光素酶中，在全長中胺基酸序列同源性都很 高，已知在多數情況下，關於某種螢光素酶基因中的突變，通過將突變導入到不同來源的熒 光素酶相應的胺基酸殘基處，能獲得相同的性質改良效果，優選在導入突變時參考各種鞘 翅目中的信息。還能夠製作出不僅對dATP為低反應性而且同時具有能發揮進一步改良性 質的效果的突變的螢光素酶，這些突變酶在實際應用時有用性很高。接著，用獲得的含有突變螢光素酶基因的質粒轉化宿主細胞。從對獲得的轉化體 進行培養而得到的菌體中，純化突變螢光素酶。作為宿主，可舉出大腸桿菌K-12菌株，但並 不限定於此。(核酸分析方法)將上述試劑、酶、各工序組合，進行核酸分析。具體而言，分析可包含以下工序的組合(1)在含有待測核酸的反應液中，添加與鹼基AGTC相應的4種dNTP或其衍生物中 的至少1種，以所述待測核酸為模板進行互補鏈合成的工序。(2)由所述互補鏈合成所生成的焦磷酸來生成ATP的工序。(3)通過以所述ATP為反應底物的螢光素酶反應而產生發光，通過檢測該發光，來 判定所述互補鏈有無合成以及對合成量進行定量的工序。所述工序可每個分別進行，也可以在1種液體中同時進行⑴和(2)、⑵和(3)、或⑴ ⑶。各工序中的各成分的濃度範圍可以使用在公知的各種方法中已知的濃度。關於dNTP濃度，通過焦磷酸測序法等這種分步進行的互補鏈合成反應來進行核 酸分析的情況下，dNTP的不足會引起合成不完全，從而導致序列解析錯誤，因此必須加入足 夠的濃度。尤其是，基因組序列分析中，在DNA序列上經常存在相同的鹼基序列連續10次 的序列。為了準確測定這樣的鹼基序列，dNTP的添加量必須為模板DNA的至少30倍以上、 期望為60倍以上、更期望為100倍以上。該值為對於合成10鹼基量所需的dNTP量(模板 DNA的10倍量)的3倍、6倍、10倍的量。螢光素酶反應所產生的發光可使用公知的測定裝置進行測定。例如，可以使用 以Lumitester C-100N等光電倍增管(photomultiplier)為檢測部的測定裝置、以及 以光電二極體、(XD、C-M0S、一次成像照相機(instant camera)、圖像增強器(imaging intensifier)等為檢測部的測定裝置。(待測核酸)作為本發明中使用的待測核酸，可舉出各種核酸分析法中使用的各種核酸、具體 而言可舉出DNA、RNA。待測核酸的來源可使用人、其他真核、原核生物、病毒等生物體來源 的待測核酸、通過PCR等擴增獲得的待測核酸、通過DNA合成儀等人工合成的待測核酸。尤 其優選含有人、微生物的基因組序列的待測核酸等。(dNTP)本發明中使用的dNTP是指脫氧核糖核苷三磷酸，有脫氧腺苷三磷酸(dATP)、脫氧 鳥苷三磷酸(dGTP)、脫氧胸腺嘧啶三磷酸(dTTP)、脫氧胞嘧啶三磷酸dCTP等；也可以使用 二脫氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)中的ddATP、ddGTP、ddTTP、ddCTP，還可以使用其他dNTP的 衍生物，只要能通過DNA聚合酶的作用進行互補鏈合成而生成焦磷酸即可。此外，期望使用 不含其它dNTP以及導致背景發光的ATP、焦磷酸的高純度產品。其以PCR、測序、導入突變、 cDNA合成等用途形式進行市售，因此可以使用這些市售的物質。也可以加入焦磷酸酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶等酶，事先分解摻入的焦磷酸、ATP。添 加的酶可通過超濾膜濾除或加入化學藥品等使其失去活性，從而降低對由互補鏈合成所生 成的焦磷酸和ATP的分解。(互補鏈合成)作為本發明中使用的互補鏈合成工序，可使用公知的各種方法。例如，類似於SNPs 分析那樣，使用加入1種dNTP來進行1個鹼基量的互補鏈合成的方法，通過互補鏈合成的 有無可分析目標部分的鹼基。此外，類似於焦磷酸測序法等那樣，使用加入每一種類的dNTP 並分步進行互補鏈合成的方法，可分析目標部分的鹼基序列。核酸序列的鑑定中，可加入全 部4種dNTP和已知的引物，通過互補鏈合成的有無，檢測具有特定的序列的核酸的有無。本發明中使用的互補鏈合成中，可以使用PCR法、LAMP法、ICAN法等這類DNA擴增 法。在進行這些互補鏈合成的過程中，會生成與互補鏈合成量相當的焦磷酸。(DNA 聚合酶)本發明中的互補鏈合成工序中所使用的DNA聚合酶是指，以核酸為模板來合成具 有與其互補的鹼基序列的DNA鏈的酶，包括以DNA為模板而複製DNA的DNA依賴性DNA聚 合酶、和以RNA為模板而複製DNA的RNA依賴性DNA聚合酶(逆轉錄酶)等。本發明中使用的DNA聚合酶，只要是具有以脫氧核糖核苷酸為底物而生成焦磷酸的活性的酶，則沒有 特別限定。(與焦磷酸量相當的ATP的生成)作為將上述互補鏈合成工序所生成的焦磷酸轉換為與其相當的ATP的方法，可使 用各種公知的方法，尤其優選使用酶的方法。作為使用的酶，例如可舉出ATP硫酸化酶(EC 2. 7. 7. 4) (Anal Biochem. 1985 年 151 卷(2)、p504_509)、煙醯胺單核苷酸腺苷轉移酶(EC 2. 7. 7. 1)(日本特表2003-509601號公報)、丙酮酸磷酸雙激酶(PPDK) (US 5891659、非專利 文獻3)等，但並不限定於此。(核酸分析用試劑盒)將上述試劑、酶等組合，能製作出用於本發明的核酸分析方法中的試劑盒。試劑盒 例如可含有以下成分。 1)與鹼基AGTC相應的4種dNTP或其衍生物2) DNA 聚合酶3)D-螢光素和前述方案1 4所述的對dATP為低反應性的螢光素酶4)AMP和磷酸烯醇式丙酮酸以及丙酮酸磷酸雙激酶、和/或腺苷_5』 -磷酸硫酸 (adenosine 5' -phosphosulfate，APS)和 ATP 硫酸化酶。所述試劑盒中的各試劑、酶的配合量可根據使用的酶的特性以及測定條件而變 化，例如反應時，可如下製備dNTP或其衍生物濃度為0. 001 1 ii M、DNA聚合酶為1 5000U/mL、D-螢光素為 0. 001 10mM、螢光素酶為 1 5000GLU/mL、AMP 為 0. 001 10mM、 磷酸烯醇式丙酮酸為0. 001 10mM、丙酮酸磷酸雙激酶為0. 1 1000U/mL、APS為0. 1 100 u M、ATP 硫酸化酶為 0. 02 2U/mL。試劑盒使用時的pH可根據使用的酶的特性等而變化，例如，可調整pH為6. 0 8. 5。還可加入鎂鹽以及其他金屬鹽等和BSA、二硫蘇糖醇(DTT)等酶類活化因子以及 穩定劑。此外，為了分解成為背景的ATP、焦磷酸，作為酶，可加入腺苷三磷酸雙磷酸酶、焦 磷酸酶。以下通過實驗例和實施例對本發明進行更具體的說明。但本發明的保護範圍不受 這些例子任何限制。實施例11.螢光素酶突變體北美產螢火蟲螢光素酶(野生型)使用sigma公司製造的產品。此外，LUC_H(龜 甲萬公司制，製品編號61314)為平家螢的217位變為亮氨酸(L)、490位變為賴氨酸(K)從 而提高了穩定性的螢光素酶；LUC-T(龜甲萬公司制、製品編號61315)為源氏螢的217位 變為異亮氨酸(I)從而提高了穩定性的螢光素酶。進而，LUC-C(龜甲萬公司制、製品編號 61313)為如下的嵌合型螢光素酶螢光素酶中，N末端側具有源氏螢的1 448位的胺基酸 序列，且217位、219位、239位分別變為異亮氨酸(I)，C末端側具有北美產螢火蟲螢光素酶 的447 550位的胺基酸序列。pET16b-BLU-Y 的製作
為擴增生物素化螢光素酶結構基因，合成了全長用引物(序列號2)。以日本專利 第3466765號記載的質粒pHLf248 (另外，大腸桿菌JMlOl [pHLf248]保藏於獨立行政法人 產業技術綜合研究所專利生物保藏中心，保藏號為FERM BP-5081。)為模板，使用所述引物 和市售M13-M4引物(寶生物公司制)進行PCR，將獲得的DNA片段用NdeI和HindIII消 化後，用瓊脂糖凝膠進行純化。另一方面，將質粒載體PET 16b (諾維信公司制)用Ndel、 HindIII消化後，純化，製作插入了所述DNA片段的質粒pET16b_BLU_Y。將製作的質粒導入 大腸桿菌JM109菌株，進行轉化。由獲得的轉化體純化質粒，並確認DNA序列。
pET32-LUC-H 的製作為了擴增螢光素酶結構基因，合成了全長用引物(序列號3、4)。以日本專利第 3749628號記載的質粒pHLfLK(另外，大腸桿菌JM109[pHLfLK]保藏於獨立行政法人產業 技術綜合研究所專利生物保藏中心，保藏編號為FERM BP-6147。)為模板，使用所述引物進 行PCR，將獲得的DNA片段插入到用SmaI消化後的pBluescriptll中。將該質粒導入到大 腸桿菌JM109菌株中，進行轉化，由獲得的轉化體提取質粒。將獲得的質粒用BamHI和XhoI 消化，使用瓊脂糖凝膠純化螢光素酶結構基因。另一方面，插入有DNA片段的質粒載體如下 製備將pET32c (諾維信公司制)用NdeI和BamHI消化後，純化，插入退火後的合成寡核苷 酸(序列號5、6)而製備。將該質粒導入大腸桿菌JM109菌株中進行轉化後，提取質粒。對 該質粒的DNA序列進行確認，用BamHI、XhoI消化後，使用瓊脂糖凝膠進行純化，製作出插入 有含所述螢光素酶結構基因的DNA片段的質粒pET32-LUC-H。將所製作的質粒導入到大腸 桿菌JM109菌株中，進行轉化。由獲得的轉化體純化質粒，確認DNA序列。突變螢光素酶344A、344V以及3441的製作合成出如下設計的PCR引物將平家螢螢光素酶的胺基酸序列中344位的胺基酸 殘基亮氨酸轉換成丙氨酸(A)、纈氨酸(V)以及異亮氨酸(I)。為了容易選擇出候選株，進 行了如下設計在序列F-344V、I共用(序列號7)中導入了沉默突變，製作出天然序列中所 不具有的AatII位點。以pET16b-BLU-Y為模板，通過PCR擴增全長。引物的組合如下。pHLf344A F-344A (序列號 8)、R-344A (序列號 9)pHLf344V F-344V、I 共用、R-344V (序列號 10)pHLf344I F-344V、I 共用、R-344I (序列號 11)使用PCR反應液，通過DpnI消化而分解模板質粒，通過激酶處理而將PCR產物末 端磷酸化。使用處理後的PCR反應液轉化大腸桿菌JM109菌株。由獲得的轉化體JM109菌 株純化質粒，確認DNA序列。突變螢光素酶425L、438G以及532R的製作與上述同樣地設計引物，使得平家螢螢光素酶的胺基酸序列中，425位的胺基酸為 亮氨酸(L)、438位的胺基酸為甘氨酸(G)以及532位的胺基酸為精氨酸(R)，來進行胺基酸 置換。使用的引物組合如下。pHLf425L F-425L (序列號 I2)、R-425L (序列號pHLf438G F-438G (序列號 I3)、R-438G (序列號 I6)pHLf532R F_532R(序列號 14)、R_532R(序列號 17)此外，分別製作這些突變的組合。以pHLf425L為模板，與前述同樣地通過PCR導 入 438G 突變(pHLf425L+438G)。進而，以 pHLf425L、pHLf438G、pHLf425L+438G 為模板，與前述同樣地導入 532R 突變，分別製作 pHLf425L+532R、pHLf438G+532R、pHLf425L+438G+532R。突變螢光素酶344A+425L+438G的製作將用ApaI消化pHLf425L+438G而獲得的DNA片段用瓊脂糖凝膠進行純化。另一 方面，以用ApaI消化pHLf344A而獲得的DNA為模板，同樣地純化，製作插入有所述片段的 質粒pHLf344A+425L+438G。將獲得的質粒DNA導入到大腸桿菌JM109菌株中，進行轉化，由 獲得的轉化體純化質粒，並測定序列。突變螢光素酶440A的製作合成出如下設計的PCR引物將平家螢螢光素酶的胺基酸序列中，440位的胺基酸 殘基亮氨酸轉換為丙氨酸(A)。以PET32-LUC-H為模板，通過PCR擴增全長。引物的組合如 下。pHLf440A F_440A(序列號 18)、 R_440A(序列號 19)使用PCR反應液，通過DpnI消化而分解模板質粒，在80°C下孵育20分鐘而使DpnI 失活，使用失活後的PCR反應液導入到大腸桿菌KRX菌株中進行轉化。由獲得的轉化體KRX 菌株純化質粒，並確認DNA序列。突變螢光素酶的純化將前述製作的質粒pET32-LUC-H、pHLf344A、pHLf344V、pHLf344I、 pHLf425L、pHLf438G、pHLf532R、pHLf425L+438G、pHLf425L+532R、pHLf438G+532R, pHLf425L+438G+532R、pHLf344A+425L+438G、pHLf440A 分別導入大腸桿菌 BL21 (DE3)或大 腸桿菌KRX菌株中，使用所獲得的轉化體製作突變螢光素酶His-LUC-H、344A、344V、344I、 425L、438G、532R、425L+438G、425L+532R、438G+532R、425L+438G+532R、344A+425L+438G、 440A。將導入有含突變螢光素酶基因的質粒的轉化體分別接種到含50 μ g/mL氨苄青黴素 的LB培地2mL中，在37°C下進行好氧培養。在培養條件為轉數120rpm、37°C下培養3小時， 加入IPTG並使其終濃度為ImM，然後在30°C下進行4小時的誘導表達。將收集的菌體用生理鹽水洗滌，將獲得的菌體懸浮於50mM磷酸鈉緩衝液(pH7. 5) 中，通過超聲波進行破碎，通過離心分離去除細胞殘渣。用His-tag純化試劑盒(MagExtractor-His-tag-、東洋紡公司制)，按照實驗流程 對獲得的離心上清進行純化，將其用於以下的實驗。2.試齊[J添加並溶解以下物質使其達到各自的濃度，製備溶液，將其用於實驗。(l)ATP/dATP 比測定用試劑(ρΗ7· 5)60mM N-三(羥甲基)甲基甘氨酸2mM EDTA20mM 醋酸鎂0. 2mM 二硫蘇糖醇(DTT)0. 4mMD-螢光素0. 牛血清白蛋白(BSA)1 μ g/mL螢光素酶(2)互補鏈合成確認用發光試劑(pH7. 5)60mM N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(同仁化學公司制)
2mM EDTA (同仁化學公司制)20mM醋酸鎂(和光純藥工業公司制)0. 2mM DTT (和光純藥工業公司制)33. 8U/mL PPDK (龜甲萬公司制)
658. 8GLU/mL 螢光素酶1. 8U/mL腺苷三磷酸雙磷酸酶(sigma公司制)0. 4mM D-螢光素(YMC公司制)0. 08mM磷酸(烯酮式)丙酮酸三鈉(sigma公司制)0. 4mM AMP (Oriental Yeast 公司制)0· BSA (sigma 公司制)(3) ATP 溶液IXliT7M ATP(Oriental Yeast 公司制)(4)dATP 溶液IXliT5M dATP 溶液(GE Healthcare Life Sciences 公司制)3.對ATP、dATP的反應性的測定製作了含各種螢光素酶的ATP/dATP比測定用試劑。ATP測定中，向0. ImL ATP/ dATP比測定試劑中添加0. ImL的1 X 1(Γ7ΜΑΤΡ、通過Lumitester C-100N測定剛添加後的發 光量。dATP測定中，向0. ImL ATP/dATP比測定用試劑中添加0. ImL的1 X 10_5MdATP，通過 Lumitester C-100N測定剛添加後的發光量。使添加ATP時的發光量為100倍，再將該值除 以添加dATP時的發光量，將獲得的值表示為「ATP/dATP比」。測定在25°C下進行。該結果如下所示。螢光素酶ATP/dATP比北美產螢光素酶(野生型)100LUC-H160His-LUC-H170LUC-T250LUC-C430425L500438G520532R400425L+438G690425L+532R590438G+532R640425L+438G+532R1,300344V4603441720344A7,200344A+425L+438G16,000440A240
北美產螢火蟲螢光素酶(野生型)的ATP/dATP比為100，LUC-T的ATP/dATP比 為250，LUC-H的ATP/dATP比為160。此外，在LUC-H中插入有組氨酸標籤的His-LUC-H的 ATP/dATP比與LUC-H基本相同，為170，表明組氨酸標籤的插入對ATP/dATP比沒有影響。相對於此，LUC-C的 ATP/dATP 比為 430，425L 時為 500，532R 時為 400。438G 時為 520，425L+532G 時為 590，425L+438G 時為 690，進而 438G+532R 時為 640，在 425L+438G+532R 時為 1300。進而 344A 的 ATP/dATP 比為 7200，344V 時為 460，3441 時為 720，344A+425L+438G 時為 16000,440A 時為 240。已知LUC-C為耐熱性等穩定性優異且催化效率高的螢光素酶(專利文獻日本特 願平10-548594)，但還沒有關於其對dATP的反應性的研究報導，此次初次發現該酶為對 dATP反應性低的酶。344A是將平家螢的344位(相當於北美產螢火蟲中的342位)的亮氨酸變成 丙氨酸的螢光素酶。作為類似於該酶的酶，Branchini等的報導中已闡明通過將北美 產螢火蟲的342位的亮氨酸變成丙氨酸，其將變成發光峰降低、半衰期變長的發光模式 (Biochemistry,2003年、第42卷、p. 10429)，但沒有關於其對dATP的反應性的研究報導， 此次初次發現該酶為對dATP的反應性低的酶。對於含425L、438G、532R、440A或它們的組合的突變螢光素酶，雖然將其作為發光 強度被增強的突變進行過報導(專利文獻日本特開2007-97577號公報)，但這些報導並 非是對dATP的反應性進行研究，此次初次闡明了這些酶為對dATP反應性低的酶。組合了425L (ATP/dATP 為 500)和 438G (ATP/dATP 為 520)的突變的 425L+438G，其 ATP/dATP 比為 690，組合了 425L 和 532R (ATP/dATP 為 400)的 425L+532R，其 ATP/dATP 比為 590，組合了 438G和532R的438G+532R，其ATP/dATP比為640。此外，組合了這3個突變的 425L+438G+532R，其 ATP/dATP 比為 1300。進而在 344A (ATP/dATP 為 7200)中組合有 425L 和438G的344A+425L+438G，其ATP/dATP比為16000，因此可知，通過組合具有對dATP反應 性低的效果的突變，能獲得對dATP的反應性更低的突變體。S卩，即使是440A(ATP/dATP為240)這種、與突變前相比對dATP的反應性降低但單 獨時被認為這種效果較小的突變體，認為通過與其它具有同樣效果的螢光素酶組合，效果 將變大。(本發明的使用螢光素酶的核酸分析)在核酸分析法中實施焦磷酸測序法，在該測序法中使用了利用PPDK的焦磷酸測 定法。通過實施例對本發明進行更詳細的說明，但實施例並不構成對本發明的任何限定。使用LUC-H、LUC-T、LUC-C、425L+438G 突變體、344A 突變體、和 344A+425L+438G 突 變體，製作互補鏈合成確認用發光試劑。在0. IOOmL的互補鏈合成確認用發光試劑中，添加 0. 002mL 的 5 X ICT6M 的分析用模板 DNA (序列號 20)(終濃度 5 X I(T8M)、0. 002mL 的 5 X ICT6M 的分析用引物DNA (序列號21)(終濃度5 X I(T8M)，進而，加入0. 002mL的5000U/mL Exo-克 列諾片段(Exo-Klenow Fragment)(克隆)(Ambion公司制、終濃度50U/mL)，加入超純水使 其為0. 2mL,在37°C下加溫。測定時，添加0. 03mL的1 X ICT5M dCTP或dATP (含0. lU/mL焦 磷酸酶)，通過Lumat LB9507 (Berthold公司制)，對此時的發光量的經時變化以1秒的間 隔測定60秒。dATP、dCTP以分析用模板DNA、分析用引物DNA的30倍量的方式添加。
分析用模板DNA和分析用引物DNA為如下的序列添加dCTP時則進行1個鹼基量 的互補鏈合成並顯示發光，添加其它核苷酸時則不合成互補鏈。使用各種螢光素酶，測定進行1個鹼基量的互補鏈合成時的發光量的經時變化。 對於LUC-H(ATP/dATP為160)，在加入模板DNA的30倍量的dATP的情況下，在dCTP時顯 示最大值的添加6秒後的發光量為dCTP時的約120%。同樣地，對於LUC-T(ATP/dATP為 250)，為89%，因此，不能說是能夠容易地區分dATP導致的背景發光和來自於互補鏈合成 的發光。
然而，對於LUC-C (ATP/dATP為430)，添加dATP時的發光量為43 %，對於 425L+438G(ATP/dATP為690)，為38% ；由於其在50%以下，因此使得dATP導致的背景發光 和來源於互補鏈合成的發光能夠容易地區分開。隨著使用的螢光素酶的ATP/dATP比進一步變大，添加dATP時的發光量降低， 344A (ATP/dATP 為 7200)、344A+425L+438G (ATP/dATP 為 16000)則幾乎看不到發光。圖1中示意出各種螢光素酶的ATP/dATP比的倒數、即dATP/ATP比與互補鏈合成 試驗中添加dATP時發光量的關係。觀察圖1，dATP/ATP比和添加dATP時的發光量存在比 例關係，近似直線的斜率為20000。為了明確區分互補鏈合成引起的發光量和dATP導致的發光量，在最大發光量下， 需要使dATP導致的發光量相對於互補鏈合成時的發光量的比例為約50%以下，優選在最 大發光量下為約10%以下。此外，考慮到基因組序列中經常存在相同的鹼基序列連續10次左右的序列，為了 使dNTP不會不充分從而準確地解析鹼基序列，需要添加其模板DNA的30倍、期望添加60 倍、進而期望添加100倍的dNTP。由圖1的結果可知，在使dATP的添加量為模板核酸的30倍時，為了使dATP導致 的背景發光變成50%以下，需要使用ATP/dATP比為400以上的螢光素酶；為了使dATP導 致的背景發光變成10%以下，需要使用ATP/dATP比為2000以上的螢光素酶。此外，dATP的添加量與其所導致的背景發光量存在比例關係，因此在使dATP的 添加量為模板DNA的60倍時，為了使背景發光分別為50%以下、10%以下，需要使用ATP/ dATP比分別為800以上、4000以上的螢光素酶；在使dATP的添加量為模板DNA的100倍 時，需要使用ATP/dATP比為1300、6700以上的螢光素酶。目前，雖有報導使用北美產螢火蟲螢光素酶、LUC-H這類ATP/dATP比在400以下 的螢光素酶的例子，但不存在使用ATP/dATP比為400以上的螢光素酶來實施鹼基序列分析 的報導。發明人等發現，通過使用對dATP反應性低的螢光素酶，能將dATP導致的背景發光 抑制為較低，即使使用能廉價且穩定地進行互補鏈合成的dATP，也能進行高精度的核酸分 析。產業上的可利用性根據本發明，能抑制dATP導致的背景發光的影響，因此無需使用dATP α S這類昂 貴的試劑即能夠進行廉價、高精度且高靈敏度的核酸分析。
權利要求
一種核酸分析用組合物，其含有對dATP的反應性為對ATP的反應性的1/400以下的螢光素酶。
2.根據權利要求1所述的核酸分析用組合物，其中，螢光素酶的425位的胺基酸為亮 氨酸，或者438位的胺基酸為甘氨酸，或者532位的胺基酸為精氨酸，或者425位的胺基酸 為亮氨酸且438位的胺基酸為甘氨酸，或者425位的胺基酸為亮氨酸且532位的胺基酸為 精氨酸，或者438位的胺基酸為甘氨酸且532位的胺基酸為精氨酸，或者425位的胺基酸為 亮氨酸、438位的胺基酸為甘氨酸且532位的胺基酸為精氨酸，或者344位的胺基酸為丙氨 酸，或者344位的胺基酸為纈氨酸，或者344位的胺基酸為異亮氨酸，或者344位的胺基酸 為丙氨酸、425位的胺基酸為亮氨酸且438位的胺基酸為甘氨酸。
3.根據權利要求1或2所述的核酸分析用組合物，其中，螢光素酶為平家螢(Luciola lateralis)來源。
4.根據權利要求1所述的核酸分析用組合物，其中，螢光素酶為下述的嵌合型螢光素 酶螢光素酶中，N末端側具有源氏螢(Luciola cruciata)的1 448位的胺基酸序列，且 217位、219位、239位分別變為異亮氨酸(I)，C末端側具有北美產螢火蟲螢光素酶的447 550位的胺基酸序列。
5.一種核酸分析方法，其特徵在於，使用權利要求1 4所述的組合物。
6.核酸分析用試劑盒，其含有權利要求1 4所述的組合物。
全文摘要
本發明提供螢火蟲螢光素酶、使用其的核酸分析方法和核酸分析試劑盒，其用於使用dATP的廉價、高精度且高靈敏度的核酸分析，無需使用dATPαS這類對DNA聚合酶反應性低且昂貴的試劑。核酸分析用組合物含有對dATP的反應性為對ATP的反應性的1/400以下的螢光素酶；核酸分析方法，其特徵在於使用所述組合物；以及含有所述組合物的核酸分析用試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101861397SQ20088011637
公開日2010年10月13日 申請日期2008年11月19日 優先權日2007年11月20日
發明者三重正和, 小玉侑加子, 小畠英理, 鈴木繁哉, 黑澤惠子 申請人:龜甲萬株式會社