血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法
2023-10-05 09:58:29
專利名稱：血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法
技術領域：
本發明涉及一種醫用試劑檢測方法，特別涉及血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法。
背景技術：
利用現代生物技術所開發的超微量測定方法，極大的推動了生物和醫學各領域的各項臨床和科研工作的快速發展，為人類的科學事業和社會進步作出了非凡的貢獻。
上世紀七十年代由Arakawa首先發表了應用魯米諾——過氧化物酶的化學發光反應進行酶免分析的技術，這一技術由於靈敏度高達10-18mol，可在20分鐘內快速測定出結果，可簡便實現完全自動化，有效期長達一年以上，無放射性和致畸物質，利於環保而受到普遍歡迎，是目前發展最迅速的檢測技術。
目前，化學發光技術在免疫分析中已得到相當普及的程度，已發展為能檢測多種生物活性物質的常規監床檢測方法，從免疫反應方式分，該方法有兩種基本類型，即化學發光免疫分析(CLIA)和免疫化學發光分析(ICMA)；從發光方式上看，一是將發光物質直接標記到抗體或抗原上，免疫反應後，在起動劑的作用下而發光，另一種是用酶標記抗體或抗原，免疫反應後，加入化學發光底物，在酶催作用下而發光。
該方法雖有突出的優點，但目前僅限於免疫分析，而在生化分析中還是空白。
天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)存在於血液和相關組織中。AST在心肌細胞內吶喊量較多，當心肌梗塞時，血清中AST活力增高，發病6～12小時內顯著增高，48小時達高峰，3～5天恢復正常；各種肝病也會引起血清AST升高，有時可達1200單位，中毒性肝炎可更高；肌炎、胸膜炎、腎炎和肺炎等也使血清AST輕度升高。因此，測定血清AST對診斷這些疾病具有重要價值。
現在普遍使用的測定血液中天門冬氨酸氨基轉移酶的方法為測定不同時間的吸光值的速率法，該法是利用天門冬氨酸氨基轉移酶催化L-天門冬氨酸和α-酮戊二酸生成草醯乙酸，後者與NADH和H+在MDH作用下產生L-蘋果酸和NAD+，在不同時間進行比色測定，通過測定出NADH的下降速率推算出AST的活性。該法的不足之處主要有1.線性範圍窄。由於檢測光吸收，其解析度不像化學發光那麼敏感，線性範圍不能完全滿足臨床檢測的需要，對高濃度的樣品需要經稀釋後測定，帶來一定不便。
2.靈敏度不如化學發光。化學發光是測定光信號，靈敏度要比測光吸收高出許多。
3.試劑成份複雜，操作煩瑣，容易造成誤差，影響測定結果的準確性。
4.幹擾因素多，如α-酮酸等會干擾比色。
5.只能用於自動化儀器測定，普及受到限制。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是一種提供能克服上述缺陷、且靈敏度高、線性範圍寬、方便、安全的血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法。解決該技術問題採用的主要技術方案血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法，其特徵在於用天門冬氨酸氨基轉移酶催化L-天門冬氨酸和α-酮戊二酸生成L-穀氨酸；L-穀氨酸在L-穀氨酸氧化酶催化下產生過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶作用下，使化學發光物氧化而發光；光信號的大小與天門冬氨酸氨基轉移酶的濃度呈正相關，即天門冬氨酸氨基轉移酶濃度越大發出的光信號越強；記錄這種光信號即可推測天門冬氨酸氨基轉移酶的濃度；用已知濃度的天門冬氨酸氨基轉移酶與測出的光信號，作出劑量-反應曲線；未知樣品的天門冬氨酸氨基轉移酶含量可從該曲線推算出來；所述的化學發光物為魯米諾。本發明與現有技術相比有如下優點用化學發光物代替顯色物，達到更靈敏、更穩定、範圍寬、更安全的目的。用該方法可以製備相應的定量測定血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的商品試劑盒。具體優點是①靈敏度更高。傳統方法是檢測顏色深淺，而化學發光是測光信號，可一個一個光子計數，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。②線性範圍寬。測顏色的深淺的解析度比光子計數的精度要低得多，化學發光的檢測範圍高達105。③有效消除幹擾因素，使測定結果更準確。④安全適用。化學發光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利於環境保護。⑤便於普及。本發明所製備的試劑盒，可用於全自動測量，也可用於手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫療和研究機構使用。⑥巨大的社會效益。用化學發光法測定生化指標或免疫物質，可同用一臺化學發光儀，不再需要進口昂貴的生化儀，節省大量資金，不只降低了成本，對醫療機構、患者及社會均大有益處。
具體實施例方式現舉例說明本發明的實施例。用天門冬氨酸氨基轉移酶催化L-天門冬氨酸和α-酮戊二酸生成L-穀氨酸；L-穀氨酸在L-穀氨酸氧化酶催化下產生過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶作用下，使化學發光物氧化而發光；光信號的大小與天門冬氨酸氨基轉移酶的濃度呈正相關，即天門冬氨酸氨基轉移酶濃度越大發出的光信號越強；記錄這種光信號即可推測天門冬氨酸氨基轉移酶的濃度；用已知濃度的天門冬氨酸氨基轉移酶測出的光信號，作出劑量-反應曲線；未知樣品的天門冬氨酸氨基轉移酶含量可從該曲線推算出來；這便是本發明的血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法；所述的化學發光物為魯米諾。本發明的反應原理用式子表示如下
一、試劑包括混合酶液；天門冬氨酸氨基轉移酶(或替代品)標準單一或系列濃度；底物液。
二、測定程序按下表進行，加樣單位為μl。
三、用適當方法處理作出劑量-反應曲線，根據樣品的RLU值從該曲線求出其血清AST的濃度。或直接由公式求出AST濃度＝(樣品RLU/標準RLU)×標準濃度四、可用雙試劑測定。
本發明的靈敏度更高。因為傳統方法是檢測顏色深淺，而本發明是測光信號，可一個一個光子計數，所測的最低限更小，因而靈敏度更高。線性範圍寬。這是因為傳統的測顏色的深淺的解析度比光子計數的精度要低得多，本發明的化學發光檢測範圍高達105。有效消除幹擾因素，使測定結果更準確。安全適用。本發明的化學發光物如魯米諾等很安全，整個檢測過程無有害物出現，無論是檢測或處理廢物都很安全，有利於環境保護。便於普及。本發明所製備的試劑盒，可用於全自動測量，也可用於手工或半自動測量，適宜大、中、小各層次的醫療和研究機構使用。社會效益巨大。用本發明的化學發光法測定生化指標或免疫物質，可同用一臺化學發光儀，不再需要進口昂貴的生化儀，節省大量資金，不只降低了成本，對醫療機構、患者及社會均大有益處。本發明方法簡單，適於廣泛推廣應用。
權利要求
1.血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法，其特徵在於用天門冬氨酸氨基轉移酶催化L-天門冬氨酸和α-酮戊二酸生成L-穀氨酸；L-穀氨酸在L-穀氨酸氧化酶催化下產生過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶作用下，使化學發光物氧化而發光；光信號的大小與天門冬氨酸氨基轉移酶的濃度呈正相關，即天門冬氨酸氨基轉移酶濃度越大發出的光信號越強；記錄這種光信號即可推測天門冬氨酸氨基轉移酶的濃度；用已知濃度的天門冬氨酸氨基轉移酶與測出的光信號，作出劑量-反應曲線；未知樣品的天門冬氨酸氨基轉移酶含量可從該曲線推算出來。
2.根據權利要求1所述的血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法，其特徵在於所述的化學發光物為魯米諾。
全文摘要
本發明血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法，涉及一種在生化分析中醫用試劑的化學發光測定方法。它所要解決的是現有檢測範圍窄、靈敏度低、幹擾因素多等技術問題。解決該技術問題的主要技術方案血清中天門冬氨酸氨基轉移酶的化學發光測定方法，其特徵在於用天門冬氨酸氨基轉移酶催化L－天門冬氨酸和α－酮戊二酸生成L－穀氨酸；L－穀氨酸在L－穀氨酸氧化酶催化下產生過氧化氫；過氧化氫在過氧化物酶作用下，使化學發光物氧化而發光；天門冬氨酸氨基轉移酶濃度越大發出的光信號越強；用已知濃度的天門冬氨酸氨基轉移酶與測出的光信號，作出劑量－反應曲線；未知樣品的天門冬氨酸氨基轉移酶含量可從該曲線推算出來。它檢測方便、靈敏度高。
文檔編號C12Q1/48GK1912598SQ200610114998
公開日2007年2月14日 申請日期2006年8月10日 優先權日2006年8月10日
發明者王京, 高淑舫 申請人:福建省洪誠生物藥業有限公司